Summary
チオバルビト尿酸反応性物質アッセイの目的は、532nmの可視波長分光光度測定を用いて、脂質過酸化生成物、主にマロンジアルデヒドの生産を測定することによって生体試料中の酸化ストレスを評価することです。ここで説明する方法は、ヒト血清、細胞ライセート、および低密度リポタンパク質に適用することができる。
Abstract
分析上の特異性と堅牢性は限られているにもかかわらず、チオバルビツール酸反応性物質(TBARS)アッセイは、生体液中の脂質過酸化の一般的な指標として広く使用されています。生体試料内の酸化ストレスのレベルを示す良い指標と考えられることが多く、サンプルが適切に処理され保存されていることが考えられます。このアッセイは、脂質過酸化生成物、主にマロンジアルデヒド(MDA)、チオバルビツール酸(TBA)との反応を伴い、TBARSと呼ばれるMDA-TBA2付加物の形成につながります。TBARS は 532 nm で分光光度を測定できる赤ピンク色を生成します。TBARSアッセイは、酸性条件下(pH = 4)で、95°Cで行います。 純粋なMDAは不安定ですが、これらの条件はMDAビス(ジメチルアセタール)からMDAを放出することを可能にし、この方法で分析標準として使用されます。TBARSアッセイは、約2時間で完了できる簡単な方法です。アッセイ試薬の調製について、詳細を説明します。予算重視の研究者は、単一の標準曲線の構築のみを可能にする高価なTBARSアッセイキットを購入するのではなく、これらの試薬を低コストで複数の実験に使用することができます(したがって、1つの実験にのみ使用できます)。このTBARSアッセイの適用可能性は、ヒト血清、低密度リポタンパク質、および細胞ライセートで示されている。アッセイは一貫して再現可能であり、1.1 μMの検出限界に達することができる。分光光度TBARSアッセイの使用および解釈に関する推奨事項が提供される。
Introduction
脂質過酸化は、活性酸素種や反応性窒素種などのフリーラジカルが、脂質中の炭素炭素二重結合を攻撃するプロセスであり、炭素からの水素の抽象化と酸素分子の挿入を伴うプロセスである。このプロセスは、主要な製品として、脂質ペルオキシルラジカル、およびヒドロペルオキシドを含む複雑な製品の混合物、ならびに主要な二次製品としてマロンジアルデヒド(MDA)および4-ヒドロキシノンを含む。
MDAはチオバルビツール酸(TBA)との容易な反応による脂質過酸化のマーカーとして、生物医学研究で広く使用されています。この反応は、532 nmの可視スペクトルで吸収し、赤-ピンク色2を生成するコンジュゲートであるMDA-TBA2の形成につながります。MDA以外の脂質過酸化に由来する他の分子も、TBAと反応して532nmで光を吸収し、測定される全体的な吸収シグナルに寄与する。同様に、MDAは生体分子の他のほとんどの主要クラスと反応することができ、TBA3,4との反応に対するアクセシビリティを制限する可能性があります。したがって、この伝統的なアッセイは、単に「チオバルビツール酸反応性物質」またはTBARS5を測定すると考えられています。
TBARSアッセイは、正しく適用され、解釈されると、一般的に生物学的サンプル6における酸化ストレスの全体的なレベルの良好な指標と考えられます。残念ながら、Khoubnasabjafariと他の人によって文書化されているように、TBARSアッセイはしばしば疑わしい結論3、4、7、8、9、10、11を容易にする方法で行われ、解釈されます。この原因は、主にサンプル関連の前分析変数と、アッセイ結果の大幅な変更なしにアッセイプロトコルの一見軽微な変動を禁止するアッセイ堅牢性の欠如に根ざしています1,7,12,13。
生体試料の取り扱いと保存に関連する前分析変数(例えば、血漿を-20°Cに一時的に保つ)14,15は、TBARSアッセイ結果に大きな影響を与える可能性があります16,17;TBARSアッセイの結果は、明示的なラボ間分析検証データによって保証されない限り、異なる実験室間で比較されるべきではありません。この推奨事項は、ウエスタン ブロットの一般的な使用方法と解釈方法に似た方法です。バンド密度の比較は、ブロット内およびおそらく実験室内の研究に有効であるが、実験室間のバンド密度を比較することは一般的に無効な慣行と考えられる。
一部の研究者は、TBARSアッセイによって測定されたMDAが、許容可能なバイオマーカー3、9,10、18,19に必要な分析基準または臨床基準を単に満たしていないことを示唆している。確かに、50年以上前にアッセイが開発されていなかったら、今日の広範な使用と暗黙の受け入れ能力を得ることはなかったでしょう。酸化ストレスの決定に使用される分析感度、特異性、および堅牢性を有するアッセイは他にもありますが、532nmでの吸光度に基づくTBARSアッセイは、脂質過酸化20の決定に最も一般的に使用されるアッセイの1つであり、それによって酸化ストレスの評価を行います。
TBARSアッセイは、使用される試薬のほとんどの濃度に関する詳細な情報を提供しない高価なキット(400米ドル以上)としてのみ見つけることができます。また、提供される試薬は、1キットにつき1つの色分け標準曲線しか作ることができないため、1つの実験にのみ使用できます。これは、同じ標準曲線を複数回使用できないため、異なるタイムポイントで数サンプル内の酸化レベルを決定しようとする研究者にとって問題になる可能性があります。したがって、複数の実験のために複数のキットを購入する必要があります。現在、高価なキットを購入しない限り、TBARSアッセイの実行方法に関する詳細なプロトコルはありません。過去に一部の研究者は、TBARS assay21,22を実行する方法を漠然と説明してきましたが、高価なキットなしでTBARSアッセイを行う方法に関する完全に詳細なプロトコルや包括的なビデオは文献で入手できません。
ここでは、簡単で再現性の低い方法でTBARSアッセイを実行する方法に関する詳細で分析的に検証された目的別方法論を報告します。ヒト血清の脂質過酸化、HepG2溶糖、およびCu(II)イオンによる処理時の低密度リポタンパク質の変化が、TBARSアッセイの例示的な用途として実証されています。結果は、このTBARSアッセイが日常的に一貫して再現可能であることを示しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ヒト血清検体は、IRBの承認の下で同意したボランティアから、そしてヘルシンキ宣言で述べられている原則に従って得られた。検体は、分析室に移る前にコード化され、同定を解除した。
1. サンプル準備
- ヘプG2細胞ライセート
- 16 T75フラスコに16個のT75フラスコに種子約10 x 106 HepG2細胞があり、10%のウシ胎児血清(FBS)を補充したEMEM培地14mLで、2日間細胞を増殖させる。
- RIPAバッファーを準備する:50 mLチューブに、5 M NaClの1.5 mL、1 MトリスHCl(pH = 7)の2.5 mL、NP-40試薬の500 μLを加え、DI水で50 mLに最終容積を持って来ます。
- 溶解バッファーを準備する:50 mLチューブにRIPAバッファーのアリコート20 mLを追加し、タンパク質と脂質分解を阻害するために100xプロテアーゼ阻害剤溶液の200 μLを追加します。4 °Cで保管。
注意:リシスバッファーはTBARS試薬と互換性があり、532 nmでの吸光度を妨げません。別のリシスバッファーを使用するか、またはリシスバッファーに追加の成分を追加する場合は、リシスバッファーコンポーネントがTBARSアッセイと互換性があることを確認するために予備検証研究を行う必要があります。 - 10%FBSを含む培地を取り出し、5 mLの冷たい滅菌1x PBSで細胞2倍を洗浄します。
- 細胞を含むT75フラスコに1mLのリシスバッファーを加え、室温(RT)で10分間、一定の渦巻きでインキュベートし、バッファーが十分に分散されていることを確認します。
- 適切にラベル付けされた2 mLスナップキャップポリプロピレンチューブにライセートを収集し、氷の上で10分間インキュベートします。
- 5,000 x g で 5,000 x g で細胞の破片を収集し、吸引上清上清を 15 mL チューブに入れ、RT で 10 分間回転させます。
- 50°Cと3mbarでスピードVacを使用して上澄み液を4倍に濃縮し、それぞれ94 μLのアリコートを2mLのスナップキャップポリプロピレンチューブにします。サンプルは、インビトロ酸化やTBARSアッセイに使用されるまで、-80 °Cで保存します。
注:細胞の溶菌上清を集中させないように、細胞は、3 mLの1xトリプシンを使用して取り外し、6 mLの培地で中和し、5 mLの冷たいPBSで2倍洗浄することもできます。その後、細胞ペレットを250 μLのリシスバッファーで再構成し、ステップ1.1.6および1.1.7を実行することができます。 - 酢酸(pH = 4)で35 mM CuCl2 ストック溶液を調製します。
- 酢酸溶液を調製(pH = 4):100mLのDI水に1μLの氷酢酸を希釈します(pHは約4ですが、pHメーターでこれを確認してください)。さらに水または酢酸を加える 4 に pH を調整します。
- 約0.1936 gの塩化銅を重量を量り、酢酸溶液(pH=4)の10mLに溶解し、144mM CuCl2 ストックを作ります。この溶液からアリコート490 μLを加え、1,510 μLの酢酸(pH = 4)を加え、35 mM CuCl2 溶液を作ります。
- アリコート6 μLから35 mM CuCl2 ストック溶液を、94 μLの細胞溶解液を含む6個のサンプルに加え、最終的なCuCl2 濃度を約2 mMにします。コントロールとして使用する細胞溶解物の94 μLを含む6つのサンプルにCuCl2 を持たない酢酸溶液(pH = 4)の6 μLを加えます。細胞ライセートの最終容積は、TBARSアッセイに使用される100 μLである必要があります。
注:35 mM CuCl2 を酢酸(pH = 4)でストック溶液にすることは、水酸化銅の沈殿を防ぐために必要です。 - 37 °Cのオーブンでサンプルを24時間インキュベートし、最終容積100 μLを含む各サンプルに対してTBARSアッセイを行います。
- ステップ 1.1.9 および 1.1.11 2x を別々の日に繰り返して、HepG2細胞溶解物の TBARS アッセイの再現性を確認します。
- 低密度リポタンパク質
注:典型的には、予精製された低密度リポタンパク質(LDL)は、EDTAのいくつかの量を含む。ここで使用するLDLサンプルは0.01%EDTAを含んでいます。EDTAは、インビトロCu(II)媒介酸化LDLを阻害することができます。したがって、実験または分析の前に、LDLサンプルからEDTAを除去する必要があるかもしれません。ステップ 1.2.1 – 1.2.5 では、このプロセスについて説明します。
注意:水酸化ナトリウムは腐食性であり、皮膚や目に刺激を与えます。適切な個人用保護具を使用してください。- アリコート24 μLは、5.51 mg/mL LDLストック(BSAを標準として使用した改変ローリー法により求められるタンパク質濃度)から、適切に標識された1 mLスナップキャップポリプロピレンチューブに。必要に応じてアリコートを作り、酸化やTBARSアッセイに使用するまで4°Cで保存してください。
- NaOHビーズでpH = 7に調整された0.15 MのHePESバッファを10 mM HEPESバッファーに調製する:水の0.49 LにNaClの4.39 gを溶解し、HEPESの1.19 gを加えます。かき混ぜる棒でよく溶かす。pHが7になるまで水酸化ナトリウムビーズを加えます。水で0.5Lに希釈します。バッファーを4 °Cで保存し、3ヶ月以内に使用してください。
- 0.15 M NaCl(pH = 7)の10 mM HEPESバッファの476 μLをアリクォートLDLサンプルに加えて、最終体積を500 μLにします。希釈LDLサンプルを、分子量カットオフ100Kの0.5 mL遠心スピンフィルター装置に加えます。
- RTで10分間14,000 x gでサンプルを回し、最終的なリテンテート体積は約30μLです。0.15 M NaCl(pH = 7)の10 mM HEPESバッファの480 μLのサンプルを再構成し、RTで10分間14,000 x gで再びスピンします。
- フィルターデバイスを逆さまにして新しい2 mLスナップキャップポリプロピレンチューブに、遠心分離機を1000 x gで2分間置き、LDLサンプルを収集します(最終容積= 約30 μL)。
- アリコートサンプルを適切にラベル付けした1 mLチューブにし、各サンプルに20 μLの水を加え、最終的な体積50 μLを達成します。
- 酢酸中200 μM CuCl2 ストック溶液の調製 (pH = 4)
- 酢酸溶液を調製(pH=4):ステップ1.1.9.1を参照してください。
- 144 mM CuCl2 ストック溶液(ステップ1.1.9.2を参照)を準備し、144 mM CuCl2 ストックからアリコート5.5 μLを調製し、最終体積4 mLの酢酸(pH = 4)に溶解して200 μM溶液を作ります。
- 200 μM CuCl2 ストック溶液のアリコート 2.7 μL を、50 μL の LDL を含む 6 つのサンプルに加え、CuCl2 濃度を約 10 μM にします。コントロールに使用する50 μLのLDLを含む6サンプルにCuCl2 を含まない酢酸溶液(pH = 4)から2.7 μLを加えます。
- 37 °Cのオーブンで2時間のLDLサンプルをインキュベートする。 2時間後、0.15 M NaCl(pH = 7)の10 mM HEPESバッファを持つ各サンプルの最終体積を100 μLにします。直ちにTBARSアッセイを実行します。
- ステップ 1.2.3 ~ 1.2.9 2x を 2 つの異なる日に繰り返して、TBARS アッセイの再生産をテストします。
- ヒト血清
- ヒト血清サンプルから、それぞれ94 μLのアリコートを2mLのスナップキャップポリプロピレンチューブに作り、サンプルを-80 °Cで保存します。
- 酢酸(pH = 4)で35 mM CuCl2 ストック溶液を調製する:ステップ1.1.9を参照してください。
- CuCl2ストック溶液からアリコート6 μLを、94 μLのヒト血清を含む6個のサンプルに加え、最終的なCuCl2濃度を約2mMにします。コントロールとして使用するヒト血清94μLを含む6つのサンプルにCuCl2を持たない酢酸溶液(pH = 4)の6 μLを加えます。
- 37 °Cのオーブンで24時間のヒト血清サンプルをインキュベートし、TBARSアッセイ(セクション4)で酸化のレベルを決定します。
- ステップ 1.3.2 ~ 1.3.4 2x を 2 つの別々の日に繰り返して、TBARS アッセイの再現性を判断します。
2. 試薬の準備
注意:チオバルビツール酸は皮膚や眼の刺激を引き起こし、吸入や皮膚吸収によって有害である可能性があります。酢酸は、吸入すると内臓に損傷を与える可能性があります。ヒュームフードですべての酸溶液を準備します。
- 8.1%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液の調製
- 32.4 gのSDSを重み出し、350 mLのDI水にビーカーで溶解します。SDSを静かに溶解し、気泡を作らないように磁気攪拌バーを使用してください。DI水で最終容積を400mLに持ち込み、RTでSDSソリューションを保存します。
注:ここでは、余分な8.1%のSDSソリューションが用意されています。しかし、96個のサンプルでは、8.1%のSDS溶液のうち約20mLしか必要ありません。分析するサンプルの数に応じて、このソリューションを準備します。
- 32.4 gのSDSを重み出し、350 mLのDI水にビーカーで溶解します。SDSを静かに溶解し、気泡を作らないように磁気攪拌バーを使用してください。DI水で最終容積を400mLに持ち込み、RTでSDSソリューションを保存します。
- 3.5 M酢酸ナトリウム緩衝液の調製(pH=4)
- 氷酢酸を100mLのDI水350mLでビーカーに希釈します。磁気攪拌棒を使用して、軽く溶解します。
- 水に水酸化ナトリウムビーズを使用して6.5 M NaOH溶液を調製します。NAOHビーズ13gを40mLのDI水に溶かし、DI水で50mLの最終体積に持ち込みます。
- 6.5 M NaOH溶液の約46mLを酢酸溶液にゆっくりと加えながら、攪拌棒と混合します(pHを4に上げるはずですが、pHメーターを使用して測定しながらNaOH溶液をゆっくりと添加して確認してください)。
- DI水で500mLに最終容積をもたらし、RTで酢酸ナトリウムバッファーを保存します。
- チオバルビツール酸の0.8%水溶液の調製(pH= 4に調整)
注:このステップでは、チオバルビツール酸の調製は、大量のサンプルが分析される予定であるため、最適化されています(108サンプル、標準を含まない)。分析のために計画されたサンプルの数に応じて、このソリューションを準備します。- 水酸化ナトリウムビーズと水を使用して5 M水酸化ナトリウム溶液を調製する:水酸化ナトリウムビーズの4 gを水の最終容積に溶解します。プラスチック容器に保管してください。このソリューションは、バッチごとに新たに準備する必要があります。
- チオバルビツール酸の重量4gとDI水の450 mLを加えます。磁気攪拌棒を使用して、軽く溶解します。
注:このソリューションは最終的に500 mLの総容量に持ち込まれます。 - チオバルビツール酸を攪拌棒で溶解しながら、5 M NaOH溶液の約3 mLを100 μL単位で(ゆっくりと、滴下して)加えます。NaOH溶液を添加した後、チオバルビツール酸粒子が溶解し始める。
- チオバルビツール酸粒子がまだ完全に溶解していない場合は、チオバルビツール酸粒子がすべて完全に溶解するまで、5 M NaOH溶液を100 μL単位で追加します。この特定の溶液量については、5 M NaOH溶液の合計4 mLを添加し、チオバルビツール酸粒子を完全に溶解する。
注:この濃度では、チオバルビツール酸はpHが4近くでない限り完全に溶解しません。 - チオバルビツール酸が完全に溶解した後、NaOHを添加し停止します。4のpHを超えないようにしてください。最終的なpHは、チオバルビツール酸溶液を混合してpH紙に入れて1μLを取り出すことで検証できます。
- DI水で500mLに最終容積をもたらし、水性0.8%チオバルビツール酸溶液をRTに保管してください。
3. マロンジアルデヒドビス(ジメチルアセタール)標準サンプル製剤
注意:マロンジアルデヒド(MDA)は不安定で、市販されていません。しかし、MDAテトラブチランモニウム塩、MDAビス(ジメチルアセタール)、MDAビス(ジエチルアセタール)など、市販されているMDAにはさまざまな化学的形態があります。これらの3つの化学形態のうち、MDAビス(ジメチルアセタール)は、研究の大半がこの同じ標準21,22を使用するため、ここで使用されています。MDAの他の2つの化学形態を使用することを選択した場合、その適合性の事前検証を行う必要があります。
- 純MDAビス(ジメチルアセタール)92 μLを1LのDI水に希釈して、550 μM MDAビス(ジメチルアセタール)ストック液を調製します。磁気攪拌棒を使用して溶液を10分間完全に混合します。4 °Cで保存し、1ヶ月以内に使用してください。
- 200 μM MDA ビス(ジメチルアセタール)を、1274 μLのDI水の550 μM MDAビス(ジメチルアセタール)ストックから726 μL希釈して準備します。この200 μM MDAビス(ジメチルアセタール)溶液は、TBARSアッセイが実行されるたびに新鮮に調製する必要があります。
- 標準曲線の準備:8つの2 mLスナップキャップポリプロピレンチューブを取り、200 μMストックからMDAビス(ジメチルアセタール)を追加し、 表1に記載されているように水で希釈するAからHまで文字でラベル付けします。
- 8本のガラス管(13mm x 100 mm)を取り、A-Hにラベルを付け、対応するチューブに100 μLの標準を追加します。ブランク規格(サンプルA)に対して6回の複製を行い、TBARSアッセイの検出限界を計算します。
注: プロトコルは、1 時間以下でここで一時停止できます。
4. TBARSアッセイ
メモ:TBARSアッセイが開始されると、停止せずに終了する必要があります。
- 分析するサンプルの数に必要な数のガラス管を取り、サンプルの名前をラベル付けします。次に、各ガラス管に(上記の通り)各サンプルを100μL加えます。
- 各サンプルと標準に8.1%SDSの200 μLを加え、ガラスチューブを円運動でそっと旋回してサンプルを混合します。
- 3.5 M酢酸ナトリウムバッファー (pH = 4) の 1.5 mL を各サンプルと標準に加えます。
- 水性0.8%チオバルビツール酸溶液(pH = 4)を各サンプルと標準に1.5mL添加します。
- 700 μLのDI水を加えることで、各サンプルと標準の最終体積を4 mLにします。
- 各ガラス管をしっかりとキャップし、1時間95°Cに設定した加熱ブロックでインキュベートします。ガラス管をアルミホイルで覆い、チューブの上部で結露を防ぎます。
- 加熱ブロックからガラス管を取り出し、氷の上で30分間インキュベートします。
- 遠心分離機サンプルと標準は1500 x gで、4°Cで10分間です。 遠心分離後、サンプルと規格を含むガラス管をRTに保管してください。
注:サンプルを氷の上または4°Cに保つと、サンプル全体または標準物が沈殿します。 - 遠心分離の直後に、各チューブから150μLの上清をアリコートし、96ウェルプレートの別のウェルに入れます。
- ピペットチップを使用して、各ウェルから気泡を取り除きます。
注:気泡の存在は、高いアッセイの不正確さにつながる、不一致の吸光度の読み取りをもたらす。 - 532 nmで吸光度を読み取る。他のすべての吸光度測定値からブランクサンプルの平均吸光度測定値を引きます。
- 空白差の吸光度測定値を532 nmでプロットし、各標準の既知の濃度をプロットして、標準曲線を作成します。線形回帰を使用してデータポイントを適合します。標準曲線から得られた線形回帰線の式を使用して、未知のサンプル濃度を計算します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
酸性条件下(pH = 4)および95°Cでは、マロンジアルデヒド(MDA)ビス(ジメチルアセタール)はMDA23を生成します。MDAと密接に関連する化学共因は、チオバルビツール酸(TBA)の2分子と反応してチオバルビツール酸反応性物質(TBARS)と呼ばれる化合物を生成し、赤色ピンク色を与え、532nmで吸光度λmax を有する(図1、 図2)。標準としてMDAビス(ジメチルアセタール)を用いて、標準曲線(図3、 表1)を生成し、3つの異なる生物学的試料におけるアッセイの検出と感度および酸化レベルの限界を決定した。異なる日に3つの異なるサンプルの酸化レベルを決定するために合計9つのTBARSアッセイが行われました。したがって、 図 3 に示すように、合計 9 つの標準曲線が生成されました。最小二乗法24 は、傾きとy-切片の標準偏差を決定するために使用された、それぞれ8.67 x 10-6 および5.66 x 10-4であった。
TBARSアッセイの検出限界は、3つの異なる日にブランクサンプル(実験反復ごとに2つの技術的複製を伴う6つの実験反復)の吸光度を測定することによって、標準的な分析手順25に従って決定した。最小識別可能な分析信号(Sm)は、空白信号(S'bl)の平均とブランクの標準偏差の複数のk(ksbl)を合計して求めた。.k= 3.つまり、Sm = SはSのブル+ ksblです。Smと標準曲線(m)の傾きを用いて、検出限界(cm)をcm=(Sm-S・S・S・bl)/mとして計算した。3日間のブランクサンプルの結果データは、検出可能な非ノイズ吸光度信号を与えるために必要なTBARS物質の最小濃度が1.1μMであることを示しています(表2)。TBARSアッセイの感度は約0.00160吸光度単位/μMであり、これは検体の濃度の違いを区別するアッセイの能力である(表2)。
種々の生物学的マトリックスにおける脂質過酸化の変化を検出する際のTBARSアッセイの適用性を説明するために、ヒト血清、HepG2 細胞ライセート、および低密度リポタンパク質のインビトロ酸化を誘導するために使用された。ここで使用されるこれらの生物学的サンプルは、生物学的マトリックスのプロトタイプです。例えば、HepG2細胞ライセートに関してここで示した結果に基づいて、このアッセイが他のタイプの細胞ライセートと連携することを期待するのが妥当です。ただし、この目的のために分析的に検証する必要があります。また、ここで用いる3つの生物学的マトリックスのうち、特定の種類のサンプルが低い内因性濃度のTBARSを示すことが一般的である。例えば、CuCl2 で処理されなかったHepG2細胞ライセートのTBARSは、アッセイの検出限界を超えていた(約2μM; 図4)。低い信号対雑音比が存在する場合に予想されるように、この特定のサンプルの標準偏差と変動係数は比較的高い(表3)。しかし、Cu(II)媒介酸化の結果として信号が増加すると、変動係数は低くなります。一般に、吸光度が検出限界を超えて増加するにつれて、アッセイ再現性が向上する(表3)。
このプロトコルの目的のために、生体試料のインビトロCu(II)媒介酸化を隠すために抗酸化物質を使用する意欲はなかった。市販の低密度リポタンパク質(LDL)は、0.01%EDTAを含んでいてもよい。EDTAは、LDLのCu(II)媒介酸化を防ぎますが、必ずしも他の金属媒介酸化反応26,27とは限りません。EDTAを含むLDLサンプルに対してTBARSアッセイを行い、TBARSのレベルはCu(II)処理と未処理のLDLサンプルの間で変化しなかった(図5A)。しかし、EDTAがスピン濾過によって除去された後(ステップ1.2.3-1.2.5を参照)、LDLはTBARSアッセイによって検出されたようにCu(II)媒介酸化を受けた(図5B)。
MDAの観点から発現される健康なドナーからのヒト血清中の脂質過酸化産物の正常範囲は1.80-3.94 μM28の間である。ヒト血清中のTBARSアッセイのダイナミックレンジを例示するために、2mM Cu(II)イオンの濃度をサンプルに加え、続いて37°Cで24時間インキュベートした。 その結果、TBARS が 6 倍から 7 倍に増加しました (図 6)。
図1:チオバルビツール酸反応性物質アッセイ回路図
13 mm x 100 mm ガラス管に 100 マイクロリットルのサンプルまたは標準を加え、続いてチオバルビツール酸反応性物質 (TBARS) 試薬を添加します。95°Cで1時間培養した後、サンプルと標準は氷中で30分間培養され、4°Cで10分間1,500 x gで遠心分離されます。 100マイクロリットルのサンプルまたは標準的な上清を96ウェルプレートに積み込み、吸光度は532 nmで測定されます。未知のサンプル濃度は標準曲線の式を用いて計算される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:チオバルビツール酸反応性物質の原型。
マロンジアルデヒドビス(ジメチルアセタール)は、酸触媒加水分解1の下でマロンジアルデヒドを生成します。次いで、放出されたマロンジアルデヒド(MDA)は、2-チオバルビツール酸(PH =4および95°C)の2分子と反応して、赤-ピンク色を与えるMDA-TBA2付加物を形成し、532nmで分光光度を測定することができる。酸化脂質に由来するMDA以外の分子もTBAと反応することができるため、532nmでの吸光度測定は、チオバルビツール酸反応性物質、またはTBARSの測定と呼ばれるだけです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マロンジアルデヒドビス(ジメチルアセタール)の色分け標準曲線
図は、異なる日に作成された 9 つの標準曲線を示しています。一部のポイントは重なり合っており、互いに区別できません。マロンジアルデヒドビス(ジメチルアセタール)は、0、2.5、5、10、20、40、80、および160μM( 表1;n=1日あたりの濃度ポイントあたり1)でキャリブレーターサンプルに強化されました。吸光度は532 nmで測定し、未知のものを含むそのバッチ内のすべての測定値から差し引かれたブランクサンプルの平均吸光度を有する。毎日、最小二乗線形回帰によって生成された式を使用して、生物学的サンプル中のTBARSを決定した。9 つの標準曲線を組み合わせたものすべてについて、傾きの標準偏差は 8.67 x 10-6 で、y-切片の標準偏差は 5.66 x 10-4 でした。傾斜角とy-切片の標準偏差は最小二乗手順24を用いて計算した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:TBARSによって検出されたHepG2ライセートにおける酸化。
6個のHepG2細胞溶解物サンプルを2 mM CuCl2 [HepG2細胞溶解物+2 mM Cu(II)]とインキュベートし、37°Cで24時間CuCl2 (HepG2細胞溶解物)を含まない溶液中で6つのサンプルをインキュベートした。 インキュベーション後、TBARSアッセイを12個のサンプルに対して行った。この手順は、合計3つの異なる日のために2倍繰り返した。エラーバーはSDを表します.アスタリスクは、コントロールとCu(II)処理のライセート(p<0.001)の間で統計的に有意な差を示します。統計的有意性は、グラフパッドでマンホイットニーU検定を使用して決定された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:TBARSによって検出された低密度リポタンパク質における酸化。
(A) 0.01% EDTAを含むLDLサンプルで実施したTBARSアッセイ。6個のLDLサンプルを10 μM CuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)]でインキュベートし、37°Cで2時間CuCl2 (ネイティブLDL)を加えない制御溶液で6サンプルをインキュベートしました。 次いで、12個のサンプルに対してTBARSアッセイを行った。"ns" は統計的有意性を表しません。(B)LDLは、遠心スピンフィルタ装置を用いてスピン濾過し、EDTAを除去した。そして、Cu(II)を加えたままのインキュベーションを、(A)に説明したように再度行った。TBARSアッセイは、その直後に行われました。この同じ手順を合計3日間2倍繰り返した。エラー バーは SD を <表します。統計的有意性は、グラフパッドのマン・ホイットニーU検定を用いて決定された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:TBARSによって検出されたヒト血清サンプル中の脂質過酸化。
ヒト血清サンプル6個を2mCuCl2[血清+2 mM Cu(II)]でインキュベートし、37°Cで24時間CuCl2(ノーマル血清)を添加していない溶液で6サンプルをインキュベートした。 インキュベーション後、TBARSアッセイを12個のサンプルに対して行った。この手順は、さらに2日間繰り返した。エラーバーはSDを表します.アスタリスクは、コントロールとCu(II)処理血清サンプル(p<0.001)の間で統計的に有意な差を示します。統計的有意性は、グラフパッドのマン・ホイットニーU検定を用いて決定された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 試験管 | 200 μM MDA ビス(ジメチルアセタール) (μL) | 水 (μL) | MDAビス(ジメチルアセタール) 最終濃度 (μM) |
| Aa | 0 | 1000 | 0 |
| B | 12.5 | 987.5 | 2.5 |
| C | 25 | 975 | 5 |
| D | 50 | 950 | 10 |
| E | 100 | 900 | 20 |
| F | 200 | 800 | 40 |
| G | 400 | 600 | 80 |
| H | 800 | 200 | 160 |
表1:マロンジアルデヒドビス(ジメチルアセタール)標準試料製剤 作りたての200 μMマロンジアルデヒドビス(ジメチルアセタール)から、標準曲線の最終濃度に到達するために提案されたボリュームをアリコートします。メソッドの検出限界を決定するために、1日に少なくとも6回の空のサンプル(A)の反復を実行することをお勧めします。
| 日 | 吸光度 | スブルブ | SMC | 感度(吸光度単位/μM)d | cm (μM)e |
| 1 (n = 6) | 0.0412 | 0.000612 | 0.0430 | 0.00160 | 1.14 |
| 2 (n = 6) | 0.0415 | 0.000632 | 0.0433 | 0.00160 | 1.18 |
| 3 (n = 6) | 0.0413 | 0.000605 | 0.0431 | 0.00160 | 1.13 |
| 3 日間すべて (n = 18) | 0.0413 | 0.000589 | 0.0431 | 0.00160 | 1.10 |
| ある1日あたり6回の反復で3つの異なる日にブランクサンプルの吸光度。 | |||||
| bSbl = ブランクサンプルの吸光度の標準偏差。 | |||||
| cSm = 最小識別可能な分析信号は、空白信号の平均(Sthebl)にブランクの標準偏差の複数のk(ksbl)を加算して決定された、k = 3。つまり、その場合は、次のことが行われますSm = S'bl + ksbl. | |||||
| d標準曲線の傾きであるTBARSアッセイの感度。 | |||||
| ecm = cm = (Sm - Sthebl)/m として計算された検出の限界値(m = 標準曲線の傾き)。 | |||||
表2:TBARSアッセイの検出限界
| 低密度リポタンパク質 | ヒト血清 | HepG2細胞リセート | |||
| 日 | % CV | 日 | % CV | 日 | % CV |
| 1 (n = 6) | 5.6 | 1 (n = 6) | 7.9 | 1 (n = 6) | 12.6 |
| 2 (n = 6) | 5.4 | 2 (n = 6) | 7.2 | 2 (n = 6) | 15.8 |
| 3 (n = 6) | 3.9 | 3 (n = 6) | 7.0 | 3 (n = 6) | 17.7 |
| 3日間(n = 18)a | 7.4 | 3 日間すべて (n = 18) | 9.8 | 3 日間すべて (n = 18) | 15.5b |
| With 10 μM CuCl2 | 2 mM CuCl2 | 2 mM CuCl2 | |||
| 1 (n = 6) | 3.R | 1 (n = 6) | 6.0 | 1 (n = 6) | 5.8 |
| 2 (n = 6) | 6.5 | 2 (n = 6) | 4.3 | 2 (n = 6) | 6.0 |
| 3 (n = 6) | 6.7 | 3 (n = 6) | 6.2 | 3 (n = 6) | 8.0 |
| 3 日間すべて (n = 18) | 6.1 | 3 日間すべて (n = 18) | 5.6 | 3 日間すべて (n = 18) | 7.3 |
| ある3 日間のデータをプールすることで、日中の精度を計算しました。 | |||||
| b結果がアッセイLODの近くにあったため、精度が限られていました。 | |||||
表3:3つの異なる生物学的試料におけるTBARSの分析的再現性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
その限界にもかかわらず1、3、4、7、8、10、12、13、14、15、19および実験室間の比較のための適合性の欠如、TBARSのアッセイは最も古い29,30の1つである しかし、生物学的サンプル中の酸化ストレスを測定するために最も広く使用されているアッセイ。TBARSアッセイは、必要な試薬をすべて調製した後、約2時間しか実行できない簡単な方法です。ここでは、標準的な曲線を含むこのアッセイが、サンプルのバッチごとに高価なキットを購入することなく、経済的な方法(96サンプルで約3.50米ドル)で何回も実行できる方法を詳しく説明しました。
アッセイのすべてのステップは重要ですが、特別な注意が必要ないくつかのステップがあります。例えば、チオバルビツール酸のpHは4より高くすべきではない。チオバルビツール酸に水酸化ナトリウム溶液を添加し、4より大きいpHを得ることを避ける場合は、注意が必要です。MDAとTBAの反応を起こすために酸性環境が必要であり、MDA標準は、酸触媒加水分解によってMDAビス(ジメチルアセタール)から放出されます。したがって、高いpHは予測不能で、非常に可変的な結果31を招く可能性があります。
また、これは一部の読者には明らかかもしれませんが、吸光度を測定する前に96ウェルプレートの気泡を取り除くことも重要です。気泡の存在は、高い吸光度値と複製間の差をもたらし、CVの高い割合につながる。さらに、95°Cで1時間のインキュベーションの後、サンプルは氷上で30分以上インキュベートしてはならない。特に、TBARSアッセイが開始されると、良い停止点はありません。開始後に完了する必要があります。最後に、このアッセイに適用できる多くの方法論的バリエーションがあります。ここで説明する一般的なプロトコルは、分析前にラジカルスカベンジャーまたは他のタイプの抗酸化物質の添加が必要なものなど、特定の用途に対してさらに適応(および検証)することができる。
TBARSアッセイは一般的ですが、分子特異的なアッセイではないことを認識することが重要です。脂質以外の酸化生体分子に由来するものも含め、多くの化学的反応性カルボニル含有有機分子は、TBAと反応し、TBARS1,32,33,34としてカウントされます。また、吸光度ベースのTBARSアッセイの検出限界は、この方法で決定される約1.1μMよりはるかに優れているわけではありません。ただし、他の検出方法を使用することで検出の限界を改善することができます。例えば、520 nmで励起し、550 nmで放出する分光フルオロメトリーは、以前にJoとAhn35によって示唆されたように、より高い感度とより良い検出限界を提供します。質量分析法をベースにした方法は、検出の特異性と限界の両方を劇的に改善することができます。例えば、電子捕捉陰イオン化学イオン化(ECNICI)法を用いたGC-MS/MSは、ヒト血清および尿サンプル中のMDAのペンタフルオロベンジル誘導体を検出するために用いられており、カラム36上で2 x 10-18 mol MDAの検出限界があります。ここで、クロマトグラフィー分離は、タンデム質量分析と組み合わせて、アッセイの分子特異性も飛躍的に向上する。
しかしながら、生物学的サンプル37,38内の酸化プロセスの他の測定と同様に、前分析的なサンプル処理はTBARS測定の結果にとって重要である。例えば、-20°Cでの血漿貯蔵は、MDA濃度の遅いが劇的な増加をもたらす39,40。したがって、最小限の時間を除いて、生物学的サンプルが解凍されたり、部分的に解凍された状態に曝露されたりすることは、TBARSレベルの実際の標高を引き起こすと仮定すべきである。これは、TBARSアッセイを用いて比較される生体試料の前分析的取り扱いと保存のわずかな変動さえ避けなければならないことを意味する。
事前分析的変動に関連するこれらの注意点と、限られた感度と特異性を考えると、吸光度ベースのTBARSアッセイは、実験室内の一般評価または範囲発見実験にのみ使用することをお勧めします。これらのアプリケーションには、研究者によって完全に制御される単一の変数によってのみ処理または保存される生物学的に類似したサンプルの1つ以上のグループ間で相対的TBARSレベルを直接比較する研究が含まれます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益やその他の利益相反を開示する必要はありません。
Acknowledgments
ここで報告された研究は、賞の下で国立衛生研究所の国立がん研究所によって部分的にサポートされました。R33 CA217702 と学生育成(IMSD)プログラムを最大化するためのイニシアチブ。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Sterile PBS pH 7.4 1 L | VWR, PA | 101642--262 | cell lysis reagent |
| 50 mL self-standing centrifuge tube | Corning, NY | CLS430897 | General material |
| 96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | To measure absorbance |
| Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | LDL purification |
| Caps for glass tubes | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | for TBARS assay |
| Copper II Chloride | SIGMA, MO | 222011-250G | to induce oxidation |
| Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) | VWR, PA | 53283-800 | for TBARS assay |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | HepG2 cell media |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | eppendorf, NY | 22363204 | General material |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | General material |
| Fetal Bovine Serum US Source | Omega Scientific, CA | FB-11 | for cell culture |
| Glacial Acetic Acid | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS Reagent |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | cell lysis reagent |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | LDL solvent |
| HepG2 Cells | ATCC, VA | HB-8065 | Biological matrix prototype |
| Hydrocloric acid (HCl) | Fisher Scientific, NH | A144-212 | cell lysis reagent |
| Legend Micro 17 Centrifuge | Thermo Scientific, MA | 75002431 | General material |
| Low Density Lipoprotein, Human Plasma | Athens Research & Technology, GA | 12-16-120412 | Biological matrix prototype |
| Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment | VWR, PA | 58948-025 | General material |
| Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS Standard |
| Multiskan Go Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific, NH | 51119200 | To measure absorbance |
| NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | cell lysis reagent |
| Sodium Chloride | SIGMA, MO | S7653-1KG | cell lysis reagent |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | TBARS Reagent |
| Sodium hydroxide | SIGMA, MO | 367176-2.5KG | TBARS Reagent |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific, MA | SC250EXP | For concentrating cell lysates |
| T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap | USA Scientific, FL | 658175 | cell culture |
| Thiobarbituric Acid | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS Reagent |
| TRIS base | Fluka, GA | 93362 | cell lysis reagent |
| Trypsin (1x) | VWR, PA | 16777-166 | To detach HepG2 cells |
References
- Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
- Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
- Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
- Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
- Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
- Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
- Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
- Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
- Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
- Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
- Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
- Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
- Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
- Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
- Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
- Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
- Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
- Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
- Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
- Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
- Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
- Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
- Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
- Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
- Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
- Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
- Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
- Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
- Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
- Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
- Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
- Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
- Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).
