Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

הערכה של עקה חמצונית בדגימות ביולוגיות באמצעות חומצה Thiobarbituric חומרים תגובתיים אסייד

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61122
Automatic Translation
1,
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Summary

המטרה של חומרים תגובתיים חומצה thiobarbituric assay היא להעריך מתח חמצוני בדגימות ביולוגיות על ידי מדידת הייצור של מוצרי peroxidation השומנים, בעיקר malondialdehyde, באמצעות ספקטרופוטומטריית אורך גל גלוי ב 532 ננומטר. השיטה המתוארת כאן ניתן ליישם סרום אנושי, ליסאטים תאים, ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה.

Abstract

למרות הספציפיות האנליטית המוגבלת שלה ואת המחוספס, החומרים תגובתי חומצה thiobarbituric (TBARS) בדיקה כבר בשימוש נרחב כמדד גנרי של peroxidation שומנים בדם בנוזלים ביולוגיים. זה נחשב לעתים קרובות אינדיקטור טוב של רמות של עקה חמצונית בתוך מדגם ביולוגי, בתנאי המדגם טופל כראוי מאוחסן. ההבחנה כוללת תגובה של מוצרי פרוקסידציה שומנים בדם, בעיקר malondialdehyde (מד"א), עם חומצה thiobarbituric (TBA), אשר מוביל להיווצרות של תוספים מד"א-TBA2 בשם TBARS. TBARS מניב צבע אדום-ורוד שניתן למדוד באופן ספקטרופוטומטרי ב- 532 ננומטר. בדיקת TBARS מתבצעת בתנאים חומציים (pH = 4) וב 95 °C (75 °F). מד"א טהור אינו יציב, אך תנאים אלה מאפשרים את שחרורו של מד"א מד"א (דימתיל אצטל), המשמש כסטנדרט אנליטי בשיטה זו. בדיקת TBARS היא שיטה פשוטה שניתן להשלים בכ 2 שעות. הכנת ריאגנטים של בדיקות מתוארים בפירוט כאן. חוקרים מודעים לתקציב יכולים להשתמש בריגנטים אלה לניסויים מרובים בעלות נמוכה במקום לקנות ערכת TBARS יקרה המאפשרת בניית עקומה סטנדרטית אחת בלבד (ולכן ניתן להשתמש בה רק לניסוי אחד). הישימות של בדיקת TBARS זו מוצגת בסרום אנושי, ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה, וליזאטים לתאים. ההסתה עקבית וניתן לשחזור, וניתן להגיע למגבלות הזיהוי של 1.1 מיקרומטר. המלצות לשימוש ופרשנות של בדיקת TBARS ספקטרופוטומטרית מסופקות.

Introduction

peroxidation השומנים הוא תהליך שבו רדיקלים חופשיים, כגון מינים חמצן תגובתי ומינים חנקן תגובתי, לתקוף קשרים כפולים פחמן פחמן שומנים, תהליך הכולל הפשטה של מימן מפחמן והכנסת מולקולת חמצן. תהליך זה מוביל לתערובת של מוצרים מורכבים כולל, רדיקלים פרוקסיל שומנים, הידרופרוקסידים כמוצרים העיקריים, כמו גם malondialdehyde (מד"א) ו 4-hydroxynonenal כמוצרים משניים השולטים1.

מד"א נמצא בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כסמן של פרוקסידציה שומנית בשל תגובתו הקלינית עם חומצה תיוברביטורית (TBA). התגובה מובילה להיווצרות מד"א-TBA2, מצומדת הנקלטת בספקטרום הנראה ב-532 ננומטר ומייצרת צבע אדום-ורוד2. מולקולות אחרות המופקות מפרוקסידציה שומנית מלבד מד"א יכולות להגיב גם הן עם TBA ולספוג אור במהירות של 532 ננומטר, מה שתורם לאות הקליטה הכולל הנמדד. באופן דומה, מד"א יכול להגיב עם רוב המעמדות העיקריים האחרים של ביומולקולים, מה שעלול להגביל את הנגישות שלו לתגובה עם TBA3,4. ככזה, זה בדיקת מסורתית נחשב פשוט למדוד "חומרים תגובתי חומצה thiobarbituric" או TBARS5.

כאשר מיושם כראוי ופרש, TBARS assay נחשב בדרך כלל אינדיקטור טוב של רמות הכולל של עקה חמצונית במדגם ביולוגי6. למרבה הצער, כפי שתועד על ידי Khoubnasabjafari ואחרים, TBARS בדיקות מתבצע לעתים קרובות ומתפרש בדרכים המאפשרות מסקנות מפוקפקות3,4,7,8,9,10,11. הסיבות לכך נעוצות בעיקר במשתנים טרום-אנליטיים הקשורים לדגימה ובהיעדר קשיחות של מטען האוסר על שינויים קלים לכאורה בפרוטוקול ההסתה ללא שינויים מהותיים בתוצאות ה-assay1,7,12,13.

משתנים preanalytical הקשורים biospecimen טיפול ואחסון (למשל, פלזמת דם נשמר באופן זמני ב -20 °C)14,15 יכול להיות בעל השפעה גדולה על תוצאות בדיקת TBARS16,17; עד כדי כך, כי תוצאות TBARS בוחן אין להשוות על פני מעבדות שונות אלא אם כן מוצדק על ידי נתוני אימות אנליטיים interlaboratory מפורשים. המלצה זו דומה לאופן שבו נפוץ להשתמש בכתמים מערביים ולפרש. השוואות של צפיפות רצועות תקפות למחקרים בתוך כתם ואולי בתוך המעבדה, אבל השוואת צפיפות הרצועה בין מעבדות נחשבת בדרך כלל פרקטיקה לא חוקית.

כמה חוקרים הציעו כי מד"א כפי שנמדד על ידי TBARS בחינה פשוט לא עונה על הקריטריונים האנליטיים או הקליניים הנדרשים של סמן ביולוגי מקובל3,9,10,18,19. ואכן, אם ההבחנה לא הייתה מפותחת לפני יותר מ -50 שנה, היא כנראה לא הייתה זוכה לשימוש הנרחב ולמקובלות שבשתהון שיש לה כיום. למרות שיש בדיקות אחרות עם רגישות אנליטית גדולה יותר, ספציפיות, ו מחוספס המשמש לקביעת עקה חמצונית, TBARS בדיקות המבוססות על ספיגה ב 532 ננומטר נשאר ללא ספק אחד בדיקות הנפוצות ביותר לקביעת peroxidation השומנים20, ובכך הערכה של עקה חמצונית.

ניתן למצוא את TBARS assay רק כערכה יקרה (מעל 400 דולר אמריקאי), שבה ההוראות אינן מספקות מידע מפורט על רוב הריכוזים של ריאגנטים בשימוש. בנוסף, ריאגנטים שסופקו יכולים לשמש רק לניסוי אחד, מכיוון שניתן לבצע רק עקומת תקן צבעונית אחת לכל ערכה. זה יכול להיות בעייתי עבור חוקרים שמתכוונים לקבוע רמות של חמצון בתוך כמה דגימות בנקודות זמן שונות, כי אותה עקומה סטנדרטית לא ניתן להשתמש במספר פעמים. לפיכך, ערכות מרובות יש לרכוש עבור ניסויים מרובים. נכון לעכשיו, אלא אם כן נרכשת ערכה יקרה, אין פרוטוקול מפורט זמין לביצוע בדיקות TBARS. כמה חוקרים בעבר תיארו במעורפל כיצד לבצע TBARS assay21,22, אבל לא פרוטוקול מפורט לחלוטין או וידאו מקיף על איך לנהל את TBARS בדיקה ללא ערכה יקרה זמין בספרות.

כאן אנו מדווחים על מתודולוגיה מפורטת, מאומתת אנליטית למטרה כיצד לבצע בדיקת TBARS בצורה פשוטה, ניתנת לשחזור וזולה. שינויים peroxidation השומנים של סרום אנושי, HepG2 ליסאטים, וליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה על הטיפול עם Cu(II) יונים מוצגים כיישומים להמחשה עבור בדיקת TBARS. התוצאות מראות כי ת.ב.ס.ק זה עקבי וזמין לשחזור על בסיס יומיומי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דגימות סרום אנושי התקבלו ממתנדבים בהסכמה באישור IRB ובהתאם לעקרונות שבאו לידי ביטוי בהצהרת הלסינקי. דגימות קודדו ולא זוהו לפני המעבר למעבדה האנליטית.

1. הכנת מדגם

  1. תפילת תאים HepG2
    1. זרע על 10 x 106 HepG2 תאים לכל בקבוקון ב 16 T75 צלוחיות עם 14 מ"ל של מדיה EMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ולגדל תאים במשך 2 ימים.
    2. הכן חוצץ RIPA: בצינור 50 מ"ל, להוסיף 1.5 מ"ל של 5 M NaCl, 2.5 מ"ל של 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL של NP-40 ריאגנט, ולאחר מכן להביא את הנפח הסופי ל 50 מ"ל עם מי DI.
    3. הכן מאגר תמיסת: aliquot 20 מ"ל של מאגר RIPA לתוך צינור 50 מ"ל ולהוסיף 200 μL של תמיסת מעכב פרוטאז 100x כדי לעכב חלבון השפלת שומנים בדם. יש לאחסן ב-4 °C (75°F).
      הערה: מאגר תמוגה תואם עם ריאגנטים TBARS ואינו מפריע לספיגה ב 532 ננומטר. אם אתם מתכננים להשתמש במאגר תמוגה אחר או להוסיף מרכיבים נוספים למאגר התמוגה, יש לבצע מחקרי אימות ראשוניים כדי לוודא שרכיבי מאגר תמוגה תואמים ל- TBARS assay.
    4. הסר מדיה המכילה 10% FBS ותאי לשטוף 2x עם 5 מ"ל של PBS קר, סטרילי 1x.
    5. הוסף 1 מ"ל של מאגר תמוגה לבקבוקי T75 המכילים את התאים ודגר אותם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם מערבולת מתמדת כדי להבטיח את המאגר מופץ היטב.
    6. לאסוף ליסאטים לתוך תוויות מתאימות 2 מ"ל צינורות פוליפרופילן snap-cap ודגרה על קרח במשך 10 דקות.
    7. סובבו את ה-lysates ב-5,000 x g למשך 10 דקות ב-RT כדי לאסוף פסולת תאים, ושאפו את פסולת העל לצינור יחיד של 15 מ"ל.
    8. לרכז תא ליסאט supernatant פי ארבעה באמצעות Speed Vac ב 50 °C ו 3 mbar ולעשות aliquots של 94 μL כל לתוך 2 mL snap-cap צינורות פוליפרופילן. יש לאחסן דגימות ב-80 °C (80 °F) עד שהן משמשות לחמצון במבחנה ו/או לבדיקת TBARS.
      הערה: כדי להימנע מריכוז התא lysate supernatant, תאים יכולים גם להיות מנותקים באמצעות 3 מ"ל של טריפסין 1x, מנוטרלים עם 6 מ"ל של מדיה, שטף 2x עם 5 מ"ל של PBS קר. לאחר מכן ניתן לשחזר כדורי תאים ב 250 μL של מאגר תמה, ולאחר מכן ניתן לבצע שלבים 1.1.6 ו- 1.1.7.
    9. הכן פתרון מלאי CuCl2 35 mM בחומצה אצטית (pH = 4).
      1. הכן פתרון חומצה אצטית (pH = 4): לדלל 1 μL של חומצה אצטית קרחונית ב 100 מ"ל של מים DI (pH צריך להיות כ 4 אבל לאשר את זה עם מד pH). מוסיפים עוד מים או חומצה אצטית כדי להתאים את ה- pH ל -4.
      2. משקל על 0.1936 גרם של נחושת II כלוריד להתמוסס ב 10 מ"ל של פתרון חומצה אצטית (pH = 4) כדי להפוך 144 mM CuCl2 מלאי. Aliquot 490 μL מפתרון זה ולהוסיף 1,510 μL של חומצה אצטית (pH = 4) כדי להפוך פתרון CuCl2 35 מ"מ.
    10. Aliquot 6 μL מפתרון מלאי CuCl2 35 mM ולהוסיף אותו לשש דגימות המכילות 94 μL של ליסאט תא כדי להפוך את ריכוז CuCl2 הסופי של כ 2 מ"מ. הוסף 6 μL של פתרון חומצה אצטית (pH = 4) שאין לו CuCl2 עד שש דגימות המכילות 94 μL של ליסאטים תא לשימוש כפקדים. הנפח הסופי של ליסאט תא צריך להיות 100 μL, וזה מה שישמש לבדיקת TBARS.
      הערה: ביצוע פתרון מלאי CuCl2 35 mM בחומצה אצטית (pH = 4) יש צורך למנוע משקעים של הידרוקסיד נחושת.
    11. מדגם דגימות בתנור ב 37 °C (24 שעות) ולבצע TBARS בדיקות על כל מדגם המכיל נפח סופי של 100 μL.
    12. חזור על שלבים 1.1.9 ו- 1.1.11 2x בימים נפרדים כדי לבדוק את יכולת השחזור של בדיקת TBARS עבור lysates תא HepG2.
  2. ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה
    הערה: בדרך כלל, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מטוהר מראש (LDL) מכיל כמות מסוימת של EDTA. דגימות LDL בשימוש כאן מכילות 0.01% EDTA. EDTA יכול לעכב את החמצון במבחנה Cu(II) בתיווך של LDL. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך להסיר EDTA מדגימות LDL לפני ניסויים או ניתוחים. שלבים 1.2.1–1.2.5 מתארים תהליך זה.
    אזהרה: נתרן הידרוקסיד הוא מאכל וגורם לגירוי בעור ובעיניים. השתמש בציוד מגן אישי מתאים.
    1. Aliquot 24 μL ממלאי LDL 5.51 מ"ג /מ"ל (ריכוז חלבונים שנקבע בשיטת לאורי שונה באמצעות BSA כסטנדרט) לצינורות פוליפרופילן 1 מ"ל המסומנים כראוי. יש להפוך כמה עליקוטים לפי הצורך ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש בבדיקת חמצון ו/או TBARS.
    2. הכן מאגר HEPES של 10 מ"מ ב- 0.15 M NaCl מותאם ל- pH = 7 עם חרוזי NaOH: המיס 4.39 גרם של NaCl ב- 0.49 ליטר מים, ולאחר מכן הוסף 1.19 גרם של HEPES. ממיסים היטב עם בר ערבוב. מוסיפים חרוזי נתרן הידרוקסיד עד pH הוא 7. לדלל ל 0.5 L עם מים. יש לאחסן מאגר במהירות של 4 °C (5%), ולהשתמש תוך 3 חודשים.
    3. הוסף 476 μL של מאגר HEPES 10 mM ב 0.15 M NaCl (pH = 7) לדגימות LDL aliquoted להביא נפח סופי ל 500 μL. הוסף דגימת LDL מדוללת למכשיר מסנן ספין צנטריפוגלי 0.5 מ"ל עם ניתוק משקל מולקולרי של 100K.
    4. ספין דגימות ב 14,000 x g במשך 10 דקות ב RT, משאיר נפח retentate סופי של כ 30 μL. דגימות reconstit ב 480 μL של 10 mM HEPES חוצץ ב 0.15 M NaCl (pH = 7) ולהסתובב שוב ב 14,000 x g במשך 10 דקות ב RT. בצע שלב זה 2x עבור סך של ארבעה ספין-דרך.
    5. מקם את התקן המסנן הפוך לתוך צינור פוליפרופילן snap-cap חדש 2 מ"ל, וצנטריפוגה ב 1000 x g במשך 2 דקות כדי לאסוף דגימת LDL (נפח סופי = כ 30 μL).
    6. דגימת Aliquot לתוך כראוי שכותרת 1 mL צינור ולהוסיף 20 μL של מים לכל מדגם כדי להשיג נפח סופי של 50 μL.
    7. הכנת 200 תמיסת מלאי CuCl2 μM בחומצה אצטית (pH = 4)
      1. הכן פתרון חומצה אצטית (pH = 4): ראה שלב 1.1.9.1.
      2. הכן פתרון מלאי CuCl2 144 mM (ראה שלב 1.1.9.2), ולאחר מכן aliquot 5.5 μL מן 144 mM CuCl2 מניות להתמוסס בנפח הסופי של 4 מ"ל של חומצה אצטית (pH = 4) כדי להפוך את פתרון 200 μM.
    8. Aliquot 2.7 μL מפתרון מלאי 200 μM CuCl2 ולהוסיף אותו לשש דגימות המכילות 50 μL של LDL כדי להשיג ריכוז CuCl2 הסופי של ~ 10 מיקרומטר. הוסף 2.7 μL מפתרון חומצה אצטית (pH = 4) שאינו מכיל CuCl2 לשש דגימות המכילות 50 μL של LDL שישמשו עבור הפקדים.
    9. מדגם דגימות LDL במשך 2 שעות בתנור ב 37 °C (50 °F). לאחר 2 שעות, להביא את הנפח הסופי ל 100 μL עבור כל מדגם עם 10 mM HEPES חוצץ ב 0.15 M NaCl (pH = 7). לבצע מיד TBARS אסייד.
    10. חזור על שלבים 1.2.3–1.2.9x ביומיים שונים כדי לבדוק את הרבייה של בדיקת TBARS.
  3. נסיוב אנושי
    1. מדגם סרום אנושי, לעשות aliquots של 94 μL כל לתוך 2 mL snap-cap צינורות פוליפרופילן ולאחסן דגימות ב -80 °C (80 °F).
    2. הכן פתרון מלאי CuCl2 35 mM בחומצה אצטית (pH = 4): ראה שלב 1.1.9.
    3. Aliquot 6 μL מפתרון מלאי CuCl2 ולהוסיף אותו לשש דגימות המכילות 94 μL של סרום אנושי כדי להפוך את ריכוז CuCl2 הסופי של כ 2 מ"ר. הוסף 6 μL של פתרון חומצה אצטית (pH = 4) שאין לו CuCl2 עד שש דגימות המכיל 94 μL של סרום אנושי לשימוש כמו פקדים.
    4. לדגור דגימות סרום אנושי במשך 24 שעות בתנור ב 37 °C ולקבוע רמות של חמצון עם TBARS בדיקת (סעיף 4).
    5. חזור על שלבים 1.3.2–1.3.4x ביומיים נפרדים כדי לקבוע את יכולת השחזור של בדיקת TBARS.

2. הכנת ריאגנט

אזהרה: חומצה תיוברביטורית גורמת לגירוי בעור ובעיניים ואולי מזיקה על ידי שאיפה או ספיגת העור. חומצה אצטית עלולה לפגוע באיברים פנימיים אם שואפים. הכן את כל פתרונות החומצה במכסה אדים.

  1. הכנת פתרון נתרן 8.1% (w/v) דודסילסולפט (SDS)
    1. משקל 32.4 גרם של SDS להתמוסס ב 350 מל של מים DI ב. השתמשו בסרגל ערבוב מגנטי כדי להמיס בעדינות SDS ולהימנע מיצירת בועות. הבא נפח סופי ל-400 מ"ל עם מי DI ואחסן פתרון SDS ב-RT.
      הערה: כאן מוכן פתרון SDS עודף של 8.1%; עם זאת, עבור 96 דגימות, רק על 20 מ"ל של פתרון 8.1% SDS נדרשים. הכן פתרון זה בהתאם למספר הדגימות המנותחות.
  2. הכנת 3.5 M נתרן אצטט חוצץ (pH = 4)
    1. לדלל 100 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית ב 350 מ"ל של מים DI בכוס. השתמש בסרגל ערבוב מגנטי כדי להמיס אותו בעדינות.
    2. הכן פתרון 6.5 M NaOH באמצעות חרוזי נתרן הידרוקסיד במים. להמיס 13 גרם של חרוזי NaOH ב 40 מ"ל של מים DI ולהביא לנפח סופי של 50 מ"ל עם מים DI.
    3. לאט להוסיף כ 46 מ"ל של פתרון 6.5 M NaOH לתמיסת חומצה אצטית תוך ערבוב עם מוט ערבוב (זה צריך להעלות את ה- pH ל 4, אבל לאשר על ידי הוספה איטית של פתרון NaOH תוך מדידה באמצעות מד pH).
    4. להביא נפח סופי ל 500 מ"ל עם מים DI ולאחסן מאגר אצטט נתרן ב RT.
  3. הכנת 0.8% תמיסה מימית של חומצה תיוברביטורית (מותאם ל- pH = 4)
    הערה: בשלב זה, הכנת חומצה thiobarbituric ממוטב עבור כרכים גדולים, שכן מספר רב של דגימות הולך להיות מנותח (108 דגימות, לא כולל הסטנדרטים). הכן פתרון זה בהתאם למספר הדגימות המתוכננות לניתוח.
    1. הכן פתרון נתרן הידרוקסיד 5 M באמצעות חרוזי נתרן הידרוקסיד ומים: להמיס 4 גרם של חרוזי נתרן הידרוקסיד בנפח סופי של 20 מ"ל של מים. יש לאחסן במיכל פלסטיק. פתרון זה צריך להיות מוכן טרי עבור כל אצווה.
    2. משקל 4 גרם של חומצה thiobarbituric ולהוסיף 450 מ"ל של מים DI. השתמש בסרגל ערבוב מגנטי כדי להמיס אותו בעדינות.
      הערה: פתרון זה יובא בסופו של דבר לנפח כולל של 500 מ"ל.
    3. תוך כדי המסת חומצה thiobarbituric עם מוט ערבוב, להוסיף (לאט ובאופן dropwise) על 3 מ"ל של פתרון 5 M NaOH במרווחים 100 μL. לאחר הוספת פתרון NaOH, חלקיקי חומצה thiobarbituric יתחילו להתמוסס.
    4. אם חלקיקי החומצה התיוברביטורית עדיין לא נמסו במלואם, הוסיפו עוד מפתרון 5 M NaOH במרווחים של 100 מיקרול עד שכל חלקיקי החומצה התיוברביטורית יתמוססו במלואם. עבור נפח מסוים זה של פתרון, סך של 4 מ"ל של פתרון 5 M NaOH מתווסף להמיס באופן מלא את חלקיקי חומצה thiobarbituric.
      הערה: בריכוז זה, חומצה thiobarbituric לא יתמוסס באופן מלא אלא אם כן ה- pH הוא כמעט 4.
    5. תפסיקו להוסיף NaOH אחרי כל החומצה thiobarbituric התמוסס לחלוטין. הימנעו מ-pH של 4. pH הסופי ניתן לאמת על ידי לקיחת 1 μL מן פתרון חומצה thiobarbituric ערבוב והנחת אותו על נייר pH.
    6. הביאו את הנפח הסופי ל-500 מ"ל עם מים DI וחסנו תמיסת חומצה תיוברביטורית מימית ב-RT.

3. Malondialdehyde bis (דימתיל אצטל) הכנה מדגם סטנדרטי

הערה: Malondialdehyde (מד"א) אינו יציב ואינו זמין מסחרית. עם זאת, ישנן צורות כימיות שונות של מד"א הזמינות מסחרית, כגון מלח טטרבוטילמוניום של מד"א, ביס מד"א (דימתיל אצטל) ומד"א (דיאתיל אצטל). מתוך שלוש צורות כימיות אלה, מד"א ביס (דימתיל אצטל) משמש כאן, כי רוב המחקרים להשתמש באותו תקן 21,22. אם בוחרים להשתמש בשתי הצורות הכימיות האחרות של מד"א, יש לבצע אימות מוקדם של התאמתן.

  1. הכן פתרון מלאי ביס 550 מיקרומטרי (דימתיל אצטל) על ידי דילול 92 μL של ביס טהור מד"א (דימתיל אצטל) ב 1 ליטר של מים DI. השתמש מוט ערבוב מגנטי לערבב את הפתרון ביסודיות במשך 10 דקות. יש לאחסן את הפתרון במהירות של 4 °C (7%), ולהשתמש תוך חודש אחד.
  2. הכן 200 מיקרומטר ביס מד"א (דימתיל אצטל) על ידי דילול 726 μL מתוך 550 μM ביס (דימתיל אצטל) מלאי ב 1274 μL של מים DI. פתרון 200 מיקרומטרי ביס של מד"א צריך להיות מוכן טרי בכל פעם שמבצעים בדיקת TBARS.
  3. הכנת עקומה סטנדרטית: לקחת שמונה צינורות פוליפרופילן snap-cap 2 מ"ל ולתייג אותם עם אותיות A עד H. להוסיף ביס מד"א (דימתיל אצטל) מתוך מלאי 200 מיקרומטר לדלל במים כמתואר בטבלה 1.
  4. קח שמונה צינורות זכוכית (13 מ"מ x 100 מ"מ) ולתייג אותם A-H, ולאחר מכן להוסיף 100 μL של תקן צינורות המתאימים. בצע שישה שכפולים עבור התקן הריק (מדגם A) כדי לחשב את מגבלות הזיהוי של TBARS.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך לא יותר משעה אחת.

4. TBARS אסייד

הערה: לאחר בדיקת TBARS מופעלת, זה צריך להסתיים בלי לעצור.

  1. קח כמה צינורות זכוכית לפי הצורך עבור מספר הדגימות להיות מנותח ולתייג אותם עם שמות הדגימות. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של כל מדגם מוכן (כמתואר לעיל) לכל צינור זכוכית.
  2. הוסף 200 μL של 8.1% SDS לכל מדגם וסטנדרט וסובב בעדינות את צינור הזכוכית בתנועה מעגלית כדי לערבב את הדגימה.
  3. הוסף 1.5 מ"ל של מאגר נתרן אצטט 3.5 M (pH = 4) לכל מדגם וסטנדרט.
  4. הוסיפו 1.5 מ"ל לתמיסת החומצה התיוברביטורית (pH = 4) לכל דגימה ותקן.
  5. הבא את הנפח הסופי ל 4 מ"ל עבור כל מדגם וסטנדרט על ידי הוספת 700 μL של מים DI.
  6. מכסים בחוזקה כל צינור זכוכית ודגרה בבלוק חימום להגדיר 95 °C (55 °F) במשך 1 שעה. לכסות את צינורות הזכוכית עם רדיד אלומיניום כדי למנוע עיבוי בחלק העליון של הצינורות.
  7. הסר את צינורות הזכוכית מבלוק החימום ודגרה על קרח במשך 30 דקות.
  8. דגימות צנטריפוגות ותקנים ב 1500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). לאחר צנטריפוגה, לשמור על צינורות זכוכית המכילים את הדגימות ואת הסטנדרטים ב RT.
    הערה: שמירה על הדגימות על קרח או ב 4 °C (4 °F) תגרום המדגם כולו או תקן לזרז.
  9. מיד לאחר צנטריפוגה, aliquot 150 μL של supernatant מכל צינור ומניחים לתוך באר נפרדת של צלחת 96 באר.
  10. הסר את כל הבועות מכל באר באמצעות קצה פיפטה.
    הערה: נוכחות של בועות תניב קריאות ספיגה לא עקביות, מה שיוביל לחוסר סילוק מהותי גבוה.
  11. קרא ספיגות ב 532 ננומטר. הפחת את קריאת הספיגה הממוצעת של הדגימות הריקות מכל קריאות הספיגה האחרות.
  12. צור עקומה סטנדרטית על-ידי התוויית קריאות הספיגה החסרות ריקות ב- 532 ננומטר לעומת הריכוז הידוע של כל תקן. התאם את נקודות הנתונים באמצעות רגרסיה ליניארית. חשב ריכוזי מדגם לא ידועים באמצעות המשוואה של קו הרגרסיה הליניארית המתקבלת מהעיקול הסטנדרטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בתנאים חומציים (pH = 4) וב 95 °C(5 °F), malondialdehyde (מד"א) ביס (דימתיל אצטל) מניב מד"א23. מד"א ומקורבים כימיים קשורים מגיבים עם שתי מולקולות של חומצה תיוברביטורית (TBA) כדי לייצר תרכובות הנקראות חומרים תגובתיים לחומצה תיוברביטורית (TBARS), המעניקות צבע אדום-ורוד ויש להן λmax סופג ב-532 ננומטר (איור 1, איור 2). שימוש בביס של מד"א (דימתיל אצטל) כסטנדרט, נוצרו עקומות סטנדרטיות (איור 3, טבלה 1) כדי לקבוע את גבולות האיתור והרגישות של הבחינה ורמות החמצון בשלוש דגימות ביולוגיות שונות. בסך הכל בוצעו תשע בוצעו תשע בוצעו בוצעו תשע דגימות TBARS כדי לקבוע את רמות החמצון בשלוש הדגימות השונות בימים שונים. לפיכך, נוצרו בסך הכל תשע עקומות סטנדרטיות, כפי שמוצג באיור 3. הליך הריבועים הפחות24 שימש לקביעת סטיות התקן של השיפוע ויירוט ה- y, שהיו 8.67 x 10-6 ו- 5.66 x 10-4, בהתאמה.

גבולות הזיהוי של TBARS assay נקבעו על פי נהלים אנליטיים סטנדרטיים25 על ידי מדידת ספיגות של דגימות ריקות (שישה שכפולים ניסיוניים עם שני שכפולים טכניים לכל שכפול ניסיוני) בשלושה ימים שונים. האות האנליטי המינימלי הניתן להבחנה (Sm) נקבע על-ידי סיכום הממוצע של האות הריק (S̄bl) בתוספת k מרובים של סטיית התקן של הריק (ksbl), כאשר k = 3. כלומר, Sm = S̄bl + ksbl. באמצעות Sm והשיפוע של העקומה הסטנדרטית (m), מגבלת הזיהוי (cm) חושבה כ- cm = (Sm - S̄bl)/m. הנתונים המתקבלים של הדגימות הריקות בשלושה ימים שונים מראים כי הריכוז המינימלי של חומר TBARS הדרוש כדי לתת אות ספיגה ללא רעש לגילוי הוא 1.1 μM (טבלה 2). הרגישות של TBARS assay הוא על 0.00160 יחידות ספיגה / μM, המהווה את היכולת של הבחינה להבחין הבדלים בריכוז אנליטי (טבלה 2).

כדי להמחיש את הישימות של בדיקת TBARS בזיהוי שינויים peroxidation השומנים במטריקות ביולוגיות שונות, CuCl2 שימש כדי לגרום חמצון במבחנה של סרום אנושי, ליסאטים תא HepG2, ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה. הדגימות הביולוגיות האלה המשמשות כאן הן אבות טיפוס של מטריצות ביולוגיות. לדוגמה, בהתבסס על התוצאות המוצגות כאן עבור lysates תא HepG2, סביר לצפות כי בדיקה זו תעבוד עם סוגים אחרים של ליסייט תא; עם זאת, יהיה צורך לאמת אותו באופן אנליטי למטרה זו. כמו כן, מתוך שלוש מטריצות ביולוגיות המשמשות כאן, זה נפוץ עבור סוגים מסוימים של דגימות להפגין ריכוזים אנדוגני נמוך של TBARS. לדוגמה, TBARS עבור lysates תא HepG2 שלא טופלו עם CuCl2 היו רק מעל גבול הזיהוי של ה- assay (כ 2 מיקרומטר; איור 4). כצפוי בנוכחות יחסי אות לרעש נמוכים, סטיית התקן ומקדם השונות עבור מדגם מסוים זה גבוהה יחסית (טבלה 3). עם זאת, ככל שהאות עולה כתוצאה מחמצון מתווך Cu(II), מקדם השונות הופך נמוך יותר. באופן כללי, ככל שהספיגה גדלה מעבר למגבלת הזיהוי, יכולת הרבייה של בדיקת ההסמכה משתפרת (טבלה 3).

לצורך פרוטוקול זה, לא היה רצון להשתמש בנוגדי חמצון כדי להסוות את החמצון המופרך של דגימות ביולוגיות. ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) מוכן מסחרית עשוי להכיל 0.01% EDTA. EDTA ימנע חמצון בתיווך Cu(II) של LDL אבל לא בהכרח תגובות חמצון אחרות בתיווך מתכת26,27. בוצעו דגימות LDL של TBARS המכילות EDTA, ורמות ה-TBARS לא השתנו בין דגימות ה-LDL שטופלו על-ידי Cu(II) לבין דגימות LDL שלא טופלו (איור 5A). עם זאת, לאחר ש-EDTA הוסרה על-ידי סינון ספין (ראו שלב 1.2.3–1.2.5), LDL עבר חמצון בתיווך Cu(II), כפי שזוהה על-ידי TBARS assay (איור 5B).

הטווח הנורמלי של מוצרי peroxidation השומנים בסרום האנושי מתורמים בריאים לידי ביטוי במונחים של מד"א הוא בין 1.80-3.94 μM28. כדי להמחיש את הטווח הדינמי של בדיקת TBARS בסרום אנושי, ריכוז של 2 mM Cu(II) יונים נוספה לדגימות, ואחריו דגירה במשך 24 שעות ב 37 °C (7 °F). כתוצאה מכך חלה עלייה של פי 6 לעומת 7 ב-TBARS (איור 6).

Figure 1
איור 1: חומרים תגובתיים של חומצה תיאוברביטורית.
מאה מיקרוליטרים של מדגם או סטנדרטי מתווספים צינור זכוכית 13 מ"מ x 100 מ"מ, ואחריו תוספת של חומרים תגובתיים חומצה thiobarbituric (TBARS) ריאגנטים. לאחר הדגירה ב 95 °C (55 °F) במשך 1 שעות, דגימות וסטנדרטים הם דגירה בקרח במשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגות ב 1,500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). מאה חמישים מיקרוליטרים של דגימה או סופר-נט סטנדרטי נטענים על צלחת 96 באר, והספיגה נמדדת ב-532 ננומטר. ריכוז מדגם לא ידוע מחושב באמצעות המשוואה של העקומה הסטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תגובת חומרים תגובתיים של חומצה תיוברביטורית ארכיטיפ.
Malondialdehyde bis (דימתיל אצטל) מניב malondialdehyde תחת הידרוליזה מזורז חומצה1. שוחרר Malondialdehyde (מד"א) ולאחר מכן מגיב עם שתי מולקולות של חומצה 2-thiobarbituric (TBA) (pH = 4 ו 95 °C (55 °C) כדי ליצור תוספות מד"א-TBA2 שנותנות צבע אדום-ורוד וניתן למדוד ספקטרופוטומטרית ב 532 ננומטר. מכיוון שמולקולות אחרות מלבד מד"א שמקורן בשומנים מחומצנים יכולות להגיב גם עם TBA, מדידת הספיגה ב-532 ננומטר נקראת פשוט מדידה של חומרים תגובתיים לחומצה תיוברביטורית, או TBARS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מעקומות צבע צבעוניות של Malondialdehyde bis(דימתיל אצטל).
איור מציג תשע עקומות סטנדרטיות כפי שנוצרו בימים שונים. נקודות מסוימות חופפות ולא ניתן להבחין ביניהן. Malondialdehyde bis (דימתיל אצטל) היה מבוצר לתוך דגימות calibrator ב 0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, ו 160 מיקרומטר (כפי שמוצג בטבלה 1; n = 1 לנקודת ריכוז ליום). הספיגה נמדדה ב 532 ננומטר, עם הספיגה הממוצעת של הדגימות הריקות מופחת מכל המדידות באותה אצווה, כולל לא ידועים. בכל יום, המשוואה שנוצרה על ידי רגרסיה ליניארית בריבועים לפחות שימשה לקביעת TBARS בדגימות ביולוגיות. עבור כל תשע עקומות התקן יחד, סטיית התקן של השיפוע הייתה 8.67 x 10-6, וסטיית התקן של יירוט y הייתה 5.66 x 10-4. סטיות התקן של השיפוע ויירוט y חושבו באמצעות הליך הריבועים הפחות24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: חמצון בהפ-ג'2 lysates שזוהה על ידי TBARS.
שש דגימות ליסאט תא HepG2 דוגרו עם 2 mM CuCl2 [HepG2 תא ליסאט + 2 mM Cu(II)] ושש דגימות דוגרו בפתרון ללא CuCl2 (HepG2 תא ליסאט) עבור 24 שעות ב 37 °C (57 °F). לאחר הדגירה, TBARS assay בוצע על 12 דגימות. הליך זה חזר על עצמו 2x במשך סך של שלושה ימים שונים. סרגלי שגיאה מייצגים SD. כוכבית מציינת הבדלים מובהקים סטטיסטית בין פקד לבין ליסאטים שטופלו ב- Cu (p < 0.001). משמעות סטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן מאן ויטני U ב GraphPad. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: חמצון בליפופרוטאין בצפיפות נמוכה שזוהה על ידי TBARS.
(א) TBARS בדיקות שנערכו בדגימות LDL המכילות 0.01% EDTA. שש דגימות LDL דוגרו עם 10 μM CuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)], ושש דגימות דוגרו עם פתרון בקרה ללא CuCl2 נוסף (LDL מקורי) עבור 2 שעות ב 37 °C (7 °F). לאחר מכן בוצעה ת.ב.ס. על 12 הדגימות. "ns" אינו מייצג שום משמעות סטטיסטית. (B) LDL היה ספין מסונן באמצעות התקן מסנן ספין צנטריפוגלי כדי להסיר EDTA. לאחר מכן, דגירה עם ובלי Cu(II) הוסיף בוצע שוב כמתואר עבור (A). ה- TBARS assay בוצע מיד לאחר מכן. אותו הליך חזר על עצמו 2x במשך סך של 3 ימים. קווי שגיאה מייצגים SD. כוכבית מציינת הבדלים מובהקים סטטיסטית בין דגימות LDL שטופלו על-ידי Cu(II) (p < 0.001). משמעות סטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן מאן ויטני U ב GraphPad. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: חמצון שומנים בדם בדגימות סרום אנושי שזוהו על ידי TBARS.
שש דגימות סרום אנושי דוגרו עם 2 mM CuCl2 [סרום + 2 mM Cu(II)], ושש דגימות דוגרו עם פתרון כי לא היה כל CuCl2 נוסף (סרום רגיל) עבור 24 שעות ב 37 °C (7 °F). לאחר הדגירה, TBARS assay בוצע על 12 דגימות. הליך זה חזר על עצמו ביומיים נוספים. סרגלי שגיאה מייצגים SD. כוכבית מציינת הבדלים מובהקים סטטיסטית בין דגימות סרום שטופלו ב- Cu(II) (p < 0.001). משמעות סטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן מאן ויטני U ב GraphPad. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

צינור זכוכית 200 מיקרומטר ביס מד"א (דימתיל אצטל) (μL) מים (μL) ריכוז סופי (דימתיל אצטל) של מד"א (μM)
אא 0 1000 0
B 12.5 987.5 2.5
C 25 975 5
D 50 950 10
E 100 900 20
F 200 800 40
G 400 600 80
H 800 200 160

טבלה 1: Malondialdehyde bis (דימתיל אצטל) הכנה מדגם סטנדרטי. מן 200 μM malondialdehyde ביס (דימתיל אצטל), aliquot את הנפחים המוצעים כדי להגיע לריכוז הסופי עבור העקומה הסטנדרטית. מומלץ לבצע לפחות שישה שכפולים של המדגם הריק (A) ליום כדי לקבוע את גבולות הזיהוי של השיטה.

יום Absorbancea Sblb Smc רגישות (יחידות ספיגה/μM)d cm (μM)e
1 (n = 6) 0.0412 0.000612 0.0430 0.00160 1.14
2 (n = 6) 0.0415 0.000632 0.0433 0.00160 1.18
3 (n = 6) 0.0413 0.000605 0.0431 0.00160 1.13
כל שלושת הימים (n = 18) 0.0413 0.000589 0.0431 0.00160 1.10
a ספיגת הדגימות הריקות בשלושה ימים שונים עם 6 שכפולים ליום.
bSbl = סטיית תקן של ספיגת הדגימות הריקות.
cSm = אות אנליטי מינימלי ניתן להבחנה, אשר נקבע על ידי סיכום הממוצע של האות הריק (S̄bl) בתוספת k מרובים של סטיית התקן של ריק (ksbl), כאשר k = 3. כלומר; Sm = S̄bl + ksbl.
ד רגישות של TBARS assay, שהוא השיפוע של העקומה הסטנדרטית.
ecm = מגבלות של זיהוי, אשר חושב כ- cm = (Sm - S̄bl)⁄m, כאשר m = השיפוע של העקומה הסטנדרטית.

טבלה 2: מגבלות זיהוי של תיקון TBARS.

ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה סרום אנושי ליסאט תא HepG2
יום % קורות ים יום % קורות ים יום % קורות ים
1 (n = 6) 5.6 1 (n = 6) 7.9 1 (n = 6) 12.6
2 (n = 6) 5.4 2 (n = 6) 7.2 2 (n = 6) 15.8
3 (n = 6) 3.9 3 (n = 6) 7.0 3 (n = 6) 17.7
כל שלושת הימים (n = 18)a 7.4 כל שלושת הימים (n = 18) 9.8 כל שלושת הימים (n = 18) 15.5b
עם 10 מיקרומטר CuCl2 עם 2 מ"מ CuCl2 עם 2 מ"מ CuCl2
1 (n = 6) 4.5 1 (n = 6) 6.0 1 (n = 6) 5.8
2 (n = 6) 6.5 2 (n = 6) 4.3 2 (n = 6) 6.0
3 (n = 6) 6.7 3 (n = 6) 6.2 3 (n = 6) 8.0
כל שלושת הימים (n = 18) 6.1 כל שלושת הימים (n = 18) 5.6 כל שלושת הימים (n = 18) 7.3
a דיוק בין-יומי חושב על-ידי איגום נתונים מכל שלושת הימים.
b הדיוק היה מוגבל עקב התוצאות להיות ליד LOD assay.

טבלה 3: שחזור אנליטי של TBARS בשלוש דגימות ביולוגיות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות מגבלותיו1,3,4,7,8,10,12,13,14,15,19 וחוסר התאמה להשוואה בין מעבדות, מתקן TBARS הוא אחד הוותיקים ביותר 29,30 אבל בדיקות הנפוצות ביותר למדידת עקה חמצונית בדגימות ביולוגיות. TBARS אסאי היא שיטה פשוטה שלוקח רק כ 2 שעות לבצע, לאחר כל הריאגנטים הנדרשים הוכנו. כאן, תיארנו בפירוט כיצד ניתן לבצע את ההסתה הזו, כולל העקומה הסטנדרטית, פעמים רבות בצורה חסכונית (כ-3.50 דולר עבור 96 דגימות), מבלי לקנות ערכה יקרה עבור כל אצווה של דגימות.

כל שלבי ההסתה הם קריטיים, אבל יש כמה צעדים הדורשים תשומת לב נוספת. לדוגמה, ה- pH של החומצה thiobarbituric לא צריך להיות גבוה מ 4. יש לנקוט אמצעי זהירות בעת הוספת פתרון נתרן הידרוקסיד לחומצה thiobarbituric ולהימנע קבלת pH של יותר מ 4. נדרשת סביבה חומצית לתגובה בין מד"א לת"א, ותקן מד"א משתחרר ממד"א (דימתיל אצטל) באמצעות הידרוליזה חומצית. לפיכך, pH גבוה עלול להוביל לתוצאות בלתי צפויות ומשתנות מאוד31.

כמו כן, בעוד זה עשוי להיות ברור לקוראים מסוימים, זה גם קריטי כדי להסיר את כל בועות בצלחת 96 היטב לפני מדידת הספיגה. נוכחות של בועות תניב ערכי ספיגה גבוהים והבדלים בין שכפולים, מה שיוביל לאחוז גבוה של קורות חיים. בנוסף, לאחר הדגירה של שעה אחת ב 95 מעלות צלזיוס, דגימות לא צריך להיות דגירה יותר מ 30 דקות על קרח, שכן זה יהיה לזרז את המדגם כולו, ואיסוף supernatant ללא משקעים יהיה קשה להשיג. ראוי לציין, אין נקודות עצירה טובות לאחר TBARS assay כבר התחיל. יש להשלים אותו לאחר תחילתו. לבסוף, ישנן וריאציות מתודולוגיות אפשריות רבות שניתן ליישם על תיחה זו. הפרוטוקול הכללי המתואר כאן יכול להיות מותאם עוד יותר (ולאמת) עבור יישומים ספציפיים, כולל אלה שבהם תוספת של אוכלי נבלות רדיקליים או סוגים אחרים של נוגדי חמצון לפני הניתוח נדרש.

בעוד TBARS בדיקות הוא פופולרי, חשוב להבין כי זה לא בדיקות ספציפיות מבחינה מולקולרית. מולקולות אורגניות רבות המכילות קרבוניל כימית, כולל אלה שמקורן ביומולקולות מחומצנות שאינן שומנים, יכולות להגיב עם TBA ולכן נספרות כ- TBARS1,32,33,34. בנוסף, גבולות הזיהוי של TBARS מבוסס ספיגה לא מקבלים הרבה יותר טוב מאשר על 1.1 μM, כפי שנקבע בשיטה זו. עם זאת, ניתן לשפר את מגבלות הזיהוי באמצעות שיטות זיהוי אחרות. לדוגמה, ספקטרופלואורומטריה עם עירור ב 520 ננומטר ופליטה ב 550 ננומטר מציעים רגישות גבוהה יותר ומגבלות טובות יותר של זיהוי, כפי שהוצע בעבר על ידי Jo ו- Ahn35. שיטות מבוססות ספקטרומטריית מסה יכולות לשפר באופן דרמטי הן את הספציפיות והן את גבולות הזיהוי. לדוגמה, שיטת GC-MS/MS עם יינון כימי שלילי-יונים ללכידת אלקטרונים (ECNICI) שימשה לזיהוי נגזרת פנטפלואורובנזיל של מד"א בדגימות סרום ושתן אנושיות, עם מגבלות זיהוי של 2 x 10-18 mol MDA על column36. כאן, ההפרדה הכרומטוגרפית, בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית, משפרת באופן דרמטי גם את הספציפיות המולקולרית של ההסתה.

עם זאת, כמו במדידות אחרות של תהליכי חמצון בתוך דגימות ביולוגיות37,38, טיפול במדגם טרום ניתוחי הוא קריטי לתוצאה של מדידות TBARS. לדוגמה, אחסון פלזמה בדם ב -20 °C (50 °F) גורם לעלייה איטית אך דרמטית בריכוזים של מד"א39,40. לכן, חשיפה של דגימות ביולוגיות לתנאים מופשרים או אפילו מופשרים חלקית לכל דבר מלבד כמות מינימלית של זמן יש להניח לגרום לגובה חפץ של רמות TBARS. משמעות הדבר היא כי יש להימנע אפילו שונות צנועה בטיפול לפני הניתוח ואחסון של biospecimens כי יש להשוות באמצעות בדיקת TBARS יש להימנע.

בהתחשב באזהרות אלה הקשורות לשינויים טרום ניתוחיים כמו גם רגישות וספציפיות מוגבלות, מומלץ כי בדיקת TBARS מבוססת ספיגה תשמש רק להערכה כללית תוך-מעבדתית או לניסויים במציאת טווח. יישומים אלה כוללים מחקרים שבהם רמות TBARS יחסיות משווות ישירות בין קבוצה אחת או יותר של דגימות דומות ביולוגית המעובדות או מאוחסנות יחד ומופרדות על ידי משתנה אחד בלבד הנשלט באופן מלא על ידי החוקרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים לחשוף.

Acknowledgments

המחקר שדווח כאן נתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס לא. R33 CA217702 והיוזמה למיקסום תוכנית פיתוח התלמידים (IMSD). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפה הרשמית של המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L VWR, PA 101642--262 cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube Corning, NY CLS430897 General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile Thermo Fisher Scientific, MA 280895 To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device Fisher Scientific, NH UFC510024 LDL purification
Caps for glass tubes Thermo Fisher Scientific, MA 14-930-15D for TBARS assay
Copper II Chloride SIGMA, MO 222011-250G to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) VWR, PA 53283-800 for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ATCC, VA HB-8065 HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL eppendorf, NY 22363204 General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Genesee Sceitific, CA 22363352 General material
Fetal Bovine Serum US Source Omega Scientific, CA FB-11 for cell culture
Glacial Acetic Acid SIGMA, MO 27225-1L-R TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific, MA 87786 cell lysis reagent
HEPES SIGMA, MO H3375-250G LDL solvent
HepG2 Cells ATCC, VA HB-8065 Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl) Fisher Scientific, NH A144-212 cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge Thermo Scientific, MA 75002431 General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma Athens Research & Technology, GA 12-16-120412 Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment VWR, PA 58948-025 General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) SIGMA, MO 8207560250 TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer Fisher Scientific, NH 51119200 To measure absorbance
NP-40 EMD Millipore Corp, MA 492016-100ML cell lysis reagent
Sodium Chloride SIGMA, MO S7653-1KG cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA, MO 436143-100G TBARS Reagent
Sodium hydroxide SIGMA, MO 367176-2.5KG TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific, MA SC250EXP For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap USA Scientific, FL 658175 cell culture
Thiobarbituric Acid SIGMA, MO T5500-100G TBARS Reagent
TRIS base Fluka, GA 93362 cell lysis reagent
Trypsin (1x) VWR, PA 16777-166 To detach HepG2 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

Tags

כימיה גיליון 159 חומרים תגובתיים לחומצה תיוברביטורית TBARS חמצון פרוקסידציה שומנית malondialdehyde מד"א חומצה תיוברביטורית TBA עקה חמצונית
הערכה של עקה חמצונית בדגימות ביולוגיות באמצעות חומצה Thiobarbituric חומרים תגובתיים אסייד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. … More

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. R. Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay. J. Vis. Exp. (159), e61122, doi:10.3791/61122 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter