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Chemistry

Avaliação do estresse oxidativo em amostras biológicas usando o ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61122
Automatic Translation
1,
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Summary

O objetivo do ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico é avaliar o estresse oxidativo em amostras biológicas medindo a produção de produtos de peroxidação lipídica, principalmente malondialdeído, utilizando espectrofotometria de comprimento de onda visível a 532 nm. O método descrito aqui pode ser aplicado ao soro humano, lises celulares e lipoproteínas de baixa densidade.

Abstract

Apesar de sua limitada especificidade analítica e robustez, o ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) tem sido amplamente utilizado como uma métrica genérica de peroxidação lipídica em fluidos biológicos. É frequentemente considerado um bom indicador dos níveis de estresse oxidativo dentro de uma amostra biológica, desde que a amostra tenha sido adequadamente manuseada e armazenada. O ensaio envolve a reação de produtos lipídicos de peroxidação, principalmente malondialdeído (MDA), com ácido tiobarbitúrico (TBA), o que leva à formação de adutos MDA-TBA2 chamados TBARS. O TBARS produz uma cor vermelho-rosa que pode ser medida espectrofotometricamente a 532 nm. O ensaio TBARS é realizado em condições ácidas (pH = 4) e a 95 °C. O MDA puro é instável, mas essas condições permitem a liberação de MDA de MDA bis (acetal de dimetila), que é usado como padrão analítico neste método. O ensaio TBARS é um método simples que pode ser concluído em cerca de 2 h. A preparação dos reagentes de ensaios são descritas em detalhes aqui. Pesquisadores conscientes do orçamento podem usar esses reagentes para experimentos múltiplos a um custo baixo em vez de comprar um kit de ensaio TBARS caro que só permite a construção de uma única curva padrão (e, portanto, só pode ser usado para um experimento). A aplicabilidade deste ensaio TBARS é mostrada em soro humano, lipoproteínas de baixa densidade e lises celulares. O ensaio é consistente e reprodutível, e os limites de detecção de 1,1 μM podem ser alcançados. Recomendações para o uso e interpretação do ensaio espectrofotométrico TBARS são fornecidas.

Introduction

A peroxidação lipídica é um processo no qual radicais livres, como espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio, atacam ligações duplas carbono-carbono em lipídios, um processo que envolve a abstração de um hidrogênio a partir de um carbono e inserção de uma molécula de oxigênio. Esse processo leva a uma mistura de produtos complexos, incluindo, radicais lipídicos e hidroperóxidos como produtos primários, bem como malondialdeído (MDA) e 4-hidroxynonenal como produtos secundários predominantes1.

O MDA tem sido amplamente utilizado em pesquisas biomédicas como um marcador de peroxidação lipídica devido à sua reação fácil com ácido tiobarbitúrico (TBA). A reação leva à formação do MDA-TBA2, um conjugado que absorve no espectro visível a 532 nm e produz uma cor vermelho-rosa2. Outras moléculas derivadas da peroxidação lipídica além do MDA também podem reagir com TBA e absorver luz a 532 nm, contribuindo para o sinal de absorção global que é medido. Da mesma forma, o MDA pode reagir com a maioria das outras classes principais de biomoléculas, potencialmente limitando sua acessibilidade para reação com TBA3,4. Como tal, este ensaio tradicional é simplesmente considerado para medir "substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico" ou TBARS5.

Quando corretamente aplicado e interpretado, o ensaio TBARS é geralmente considerado um bom indicador dos níveis globais de estresse oxidativo em uma amostra biológica6. Infelizmente, como documentado por Khoubnasabjafari e outros, o ensaio TBARS é frequentemente conduzido e interpretado de maneiras que facilitam conclusões duvidosas3,4,7,8,9,10,11. As causas para isso estão enraizadas principalmente em variáveis pré-analíticas relacionadas à amostra e na falta de robustez de ensaios que proíbe variações aparentemente menores no protocolo de ensaio sem alterações substanciais nos resultados do ensaio1,7,12,13.

Variáveis pré-analíticas relacionadas ao manuseio e armazenamento de bioespecímen (por exemplo, o plasma de sangue mantido temporariamente a -20 °C)14,15 podem ter um grande impacto nos resultados do ensaio TBARS16,17; tanto que os resultados do ensaio TBARS não devem ser comparados em diferentes laboratórios, a menos que seja justificado por dados explícitos de validação analítica interlaboratória. Esta recomendação é semelhante à forma como as manchas ocidentais são comumente usadas e interpretadas. Comparações de densidades de banda são válidas para estudos dentro da mancha e talvez dentro de laboratório, mas comparar densidades de banda entre laboratórios é geralmente considerado uma prática inválida.

Alguns pesquisadores sugeriram que o MDA medido pelo ensaio TBARS simplesmente não atende aos critérios analíticos ou clínicos exigidos de um biomarcador aceitável3,9,10,18,19. De fato, se o ensaio não tivesse sido desenvolvido há mais de 50 anos, provavelmente não teria ganho o uso generalizado e a aceitabilidade tácita que tem hoje. Embora existam outros ensaios com maior sensibilidade analítica, especificidade e robustez utilizadas para determinar o estresse oxidativo, o ensaio TBARS baseado na absorção a 532 nm permanece de longe um dos ensaios mais utilizados para a determinação da peroxidação lipídica20, e assim a avaliação do estresse oxidativo.

O ensaio TBARS só pode ser encontrado como um kit caro (mais de 400 dólares americanos), no qual as instruções não fornecem informações detalhadas sobre a maioria das concentrações dos reagentes utilizados. Além disso, os reagentes fornecidos só podem ser usados para um experimento, pois apenas uma curva padrão colorimétrica pode ser feita por kit. Isso pode ser problemático para pesquisadores que pretendem determinar níveis de oxidação dentro de algumas amostras em diferentes pontos de tempo, porque a mesma curva padrão não pode ser usada em vários momentos. Portanto, vários kits precisam ser comprados para vários experimentos. Atualmente, a menos que um kit caro seja comprado, não há um protocolo detalhado disponível para como realizar um ensaio TBARS. Alguns pesquisadores no passado descreveram vagamente como realizar um ensaio TBARS21,22, mas nem um protocolo totalmente detalhado ou um vídeo abrangente sobre como conduzir o ensaio TBARS sem um kit caro está disponível na literatura.

Aqui relatamos uma metodologia detalhada e analiticamente validada para fins sobre como realizar um ensaio TBARS de forma simples, reprodutível e barata. Alterações na peroxidação lipídica do soro humano, lisatos hepG2 e lipoproteínas de baixa densidade após o tratamento com íons cu(II) são demonstradas como aplicações ilustrativas para o ensaio TBARS. Os resultados demonstram que este ensaio TBARS é consistente e reproduzível no dia-a-dia.

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Protocol

Os espécimes de soro humano foram obtidos de voluntários consentidos sob aprovação do IRB e de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinque. Os espécimes foram codificados e desidentifilados antes da transferência para o laboratório analítico.

1. Preparação da amostra

  1. Lises celulares HepG2
    1. Semente cerca de 10 x 106 células HepG2 por frasco em 16 frascos T75 com 14 mL de mídia EMEM complementadas com 10% de soro bovino fetal (FBS) e células de cultivo por 2 dias.
    2. Prepare o buffer RIPA: em um tubo de 50 mL, adicione 1,5 mL de 5 M NaCl, 2,5 mL de 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL de reagente NP-40 e, em seguida, leve o volume final para 50 mL com água DI.
    3. Prepare o tampão de lise: alíquota de 20 mL de tampão RIPA em um tubo de 50 mL e adicione 200 μL de uma solução inibidora de protease de 100x para inibir a degradação da proteína e lipídica. Armazenar a 4 °C.
      NOTA: O tampão de lise é compatível com reagentes TBARS e não interfere com a absorvência a 532 nm. Se o planejamento de usar um tampão de lise diferente ou adicionar ingredientes adicionais ao tampão de lise, estudos preliminares de validação precisam ser feitos para verificar se os componentes do buffer de lise são compatíveis com o ensaio TBARS.
    4. Remova a mídia contendo 10% de FBS e lave as células 2x com 5 mL de PBS frio e estéril.
    5. Adicione 1 mL de tampão de lise aos frascos T75 contendo as células e incuba-as por 10 minutos à temperatura ambiente (RT) com redemoinho constante para garantir que o buffer esteja bem distribuído.
    6. Colete lysates em tubos de polipropileno de 2 mL e incubar no gelo por 10 minutos.
    7. Gire os lises a 5.000 x g por 10 min no RT para coletar detritos celulares e aspire supernantes em um único tubo de 15 mL.
    8. Concentre-se em células supernasas de células 4 vezes usando um Vac de velocidade a 50 °C e 3 mbar e faça alíquotas de 94 μL cada em tubos de polipropileno de 2 mL. Armazene amostras a -80 °C até que sejam usadas para oxidação in vitro e/ou ensaio TBARS.
      NOTA: Para evitar concentrar o supernanato celular, as células também podem ser destacadas usando 3 mL de trippsina 1x, neutralizadas com 6 mL de mídia, e lavadas 2x com 5 mL de PBS frio. As pelotas celulares podem então ser reconstituídas em 250 μL de tampão de lise, e as etapas 1.1.6 e 1.1.7 podem então ser realizadas.
    9. Prepare uma solução de estoque cucl2 de 35 mM em ácido acético (pH = 4).
      1. Preparar solução de ácido acético (pH = 4): Diluir 1 μL de ácido acético glacial em 100 mL de água DI (pH deve ser aproximadamente 4, mas confirme isso com um medidor de pH). Adicione mais água ou ácido acético para ajustar o pH a 4.
      2. Peso cerca de 0,1936 g de cloreto de cobre II e dissolver-se em 10 mL da solução de ácido acético (pH = 4) para fazer um estoque de CuCl2 de 144 mM. Aliquot 490 μL desta solução e adicionar a 1.510 μL de ácido acético (pH = 4) para fazer uma solução cucl2 de 35 mM.
    10. Aliquot 6 μL da solução de estoque CuCl2 de 35 mM e adicioná-lo a seis amostras contendo 94 μL de lisato celular para fazer uma concentração final de CuCl2 de cerca de 2 mM. Adicione 6 μL de uma solução de ácido acético (pH = 4) que não tenha CuCl2 a seis amostras contendo 94 μL de lisatos celulares para usar como controles. O volume final de lise celular deve ser de 100 μL, que é o que será usado para o ensaio TBARS.
      NOTA: Fazer a solução de estoque cucl2 de 35 mM em ácido acético (pH = 4) é necessário para evitar a precipitação de hidróxido de cobre.
    11. Incubar amostras em um forno a 37 °C por 24 h e realizar um ensaio TBARS em cada amostra contendo um volume final de 100 μL.
    12. Repita as etapas 1.1.9 e 1.1.11 2x em dias separados para verificar a reprodutibilidade do ensaio TBARS para as células HepG2.
  2. Lipoproteínas de baixa densidade
    NOTA: Normalmente, a lipoproteína de baixa densidade pré-purificada (LDL) contém alguma quantidade de EDTA. As amostras de LDL aqui utilizadas contêm 0,01% de EDTA. EDTA pode inibir a oxidação in vitro cu(II) mediada de LDL. Portanto, pode ser necessário remover EDTA de amostras de LDL antes de experimentos ou análises. As etapas 1.2.1-1.2.5 descrevem esse processo.
    ATENÇÃO: Hidróxido de sódio é corrosivo e causa irritação na pele e nos olhos. Use equipamentos de proteção individual adequados.
    1. Aliquot 24 μL de um estoque LDL de 5,51 mg/mL (concentração de proteína determinada pelo método Lowry modificado usando BSA como padrão) em tubos de polipropileno de 1 mL apropriadamente rotulados. Faça quantas alíquotas forem necessárias e armazene a 4 °C até usar em ensaio de oxidação e/ou TBARS.
    2. Prepare um buffer HEPES de 10 mM em 0,15 M NaCl ajustado ao pH = 7 com contas NaOH: dissolva 4,39 g de NaCl em 0,49 L de água e adicione 1,19 g de HEPES. Dissolva bem com uma barra de mexida. Adicione contas de hidróxido de sódio até que o pH seja 7. Diluir para 0,5 L com água. Armazene o buffer a 4 °C e use dentro de 3 meses.
    3. Adicione 476 μL do buffer HEPES de 10 mM em 0,15 M NaCl (pH = 7) às amostras de LDL aliquoted para trazer volume final para 500 μL. Adicione a amostra diluída de LDL a um dispositivo de filtro de giro centrífugo de 0,5 mL com um corte de peso molecular de 100K.
    4. Gire amostras a 14.000 x g por 10 min na RT, deixando um volume final de retentato de cerca de 30 μL. Reconstituir amostras em 480 μL do buffer HEPES de 10 mM em 0,15 M NaCl (pH = 7) e girar novamente a 14.000 x g por 10 min na RT. Execute esta etapa 2x para um total de quatro spin-throughs.
    5. Coloque o dispositivo do filtro de cabeça para baixo em um novo tubo de polipropileno de 2 mL e centrífugas a 1000 x g por 2 minutos para coletar amostra de LDL (volume final = cerca de 30 μL).
    6. Amostra de alíquota em tubo de 1 mL devidamente rotulado e adicionar 20 μL de água a cada amostra para alcançar um volume final de 50 μL.
    7. Preparação de 200 μM CuCl2 solução de estoque em ácido acético (pH = 4)
      1. Prepare a solução de ácido acético (pH = 4): veja o passo 1.1.9.1.
      2. Prepare uma solução de estoque CuCl2 de 144 mM (ver passo 1.1.9.2), depois aliquot 5,5 μL do estoque cucl2 de 144 mM e dissolva em um volume final de 4 mL de ácido acético (pH = 4) para fazer a solução de 200 μM.
    8. Aliquot 2,7 μL da solução de estoque CuCl2 de 200 μM e adicioná-la a seis amostras contendo 50 μL de LDL para obter uma concentração final de CuCl2 de ~10 μM. Adicione 2,7 μL de uma solução de ácido acético (pH = 4) que não contenha CuCl2 a seis amostras contendo 50 μL de LDL a serem utilizadas para os controles.
    9. Incubar amostras de LDL por 2 h em forno a 37 °C. Após 2h, leve o volume final para 100 μL para cada amostra com 10 mM de tampão HEPES em 0,15 M NaCl (pH = 7). Realize imediatamente um ensaio TBARS.
    10. Repetir as etapas 1.2.3-1.2.9 2x em dois dias diferentes para testar a reprodutividade do ensaio TBARS.
  3. Soro humano
    1. A partir de uma amostra de soro humano, faça alíquotas de 94 μL cada em tubos de polipropileno de 2 mL e armazene amostras a -80 °C.
    2. Prepare uma solução de estoque cucl2 de 35 mM em ácido acético (pH = 4): veja o passo 1.1.9.
    3. Aliquot 6 μL da solução de estoque CuCl2 e adicioná-lo a seis amostras contendo 94 μL de soro humano para fazer uma concentração final de CuCl2 de cerca de 2 mM. Adicione 6 μL de uma solução de ácido acético (pH = 4) que não tenha CuCl2 a seis amostras contendo 94 μL de soro humano para usar como controles.
    4. Incubar amostras de soro humano por 24 h em forno a 37 °C e determinar níveis de oxidação com ensaio TBARS (seção 4).
    5. Repetir as etapas 1.3.2-1.3.4 2x em dois dias separados para determinar a reprodutibilidade do ensaio TBARS.

2. Preparação do reagente

ATENÇÃO: O ácido thiobarbitúrico causa irritação na pele e nos olhos e talvez prejudicial por inalação ou absorção da pele. O ácido acético pode danificar órgãos internos se inalado. Prepare todas as soluções ácidas em um capô de fumaça.

  1. Preparação de solução de 8,1% (c/v) dodecylsulfate de sódio (SDS)
    1. Peso 32,4 g de SDS e dissolva em 350 mL de água DI em um béquer. Use uma barra de agitação magnética para dissolver suavemente os SDS e evitar fazer bolhas. Leve o volume final para 400 mL com água DI e armazene a solução SDS na RT.
      NOTA: Aqui, o excesso de 8,1% de solução SDS é preparado; no entanto, para 96 amostras, são necessários apenas cerca de 20 mL da solução SDS de 8,1%. Prepare esta solução de acordo com o número de amostras que estão sendo analisadas.
  2. Preparação de tampão de acetato de sódio de 3,5 M (pH = 4)
    1. Diluir 100 mL de ácido acético glacial em 350 mL de água DI em um béquer. Use uma barra de agitação magnética para dissolvê-la suavemente.
    2. Prepare uma solução NaOH de 6,5 M usando contas de hidróxido de sódio na água. Dissolva 13 g de contas NaOH em 40 mL de água DI e leve a um volume final de 50 mL com água DI.
    3. Adicione lentamente cerca de 46 mL da solução NaOH de 6,5 M à solução de ácido acético enquanto se mistura com a barra de agitação (isso deve elevar o pH para 4, mas confirmar adicionando lentamente a solução NaOH enquanto mede usando um medidor de pH).
    4. Leve o volume final para 500 mL com água DI e armazene o tampão de acetato de sódio na RT.
  3. Preparação de solução aquosa de 0,8% de ácido tiobarbitúrico (ajustado ao pH = 4)
    NOTA: Nesta etapa, a preparação do ácido tiobarbitúrico é otimizada para grandes volumes, uma vez que um grande número de amostras será analisada (108 amostras, sem incluir as normas). Prepare esta solução dependendo do número de amostras planejadas para análise.
    1. Prepare uma solução de hidróxido de sódio de 5 M usando contas de hidróxido de sódio e água: dissolva 4 g de contas de hidróxido de sódio em um volume final de 20 mL de água. Guarde em um recipiente de plástico. Esta solução deve ser preparada recentemente para cada lote.
    2. Peso 4 g de ácido tiobarbitúrico e adicione 450 mL de água DI. Use uma barra de agitação magnética para dissolvê-la suavemente.
      NOTA: Esta solução será eventualmente levada a um volume total de 500 mL.
    3. Ao dissolver o ácido tiobarbitúrico com uma barra de mexida, adicione (lentamente e de forma dropwise) cerca de 3 mL da solução 5 M NaOH em incrementos de 100 μL. Depois de adicionar a solução NaOH, as partículas de ácido thibarbitúrico começarão a se dissolver.
    4. Se as partículas de ácido thibarbitúrico ainda não tiverem totalmente dissolvido, adicione mais da solução 5 M NaOH em incrementos de 100 μL até que todas as partículas de ácido thiobarbitúrico sejam totalmente dissolvidas. Para este volume específico de solução, um total de 4 mL da solução 5 M NaOH é adicionado para dissolver totalmente as partículas de ácido thiobarbitúrico.
      NOTA: Nesta concentração, o ácido tiobarbitúrico não se dissolverá totalmente a menos que o pH seja de quase 4.
    5. Pare de adicionar NaOH depois de tudo o ácido tiobarbitúrico ter se dissolvido completamente. Evite exceder um pH de 4. O pH final pode ser verificado tomando 1 μL da solução de ácido thiobarbitúrico de mistura e colocando-o em papel pH.
    6. Leve o volume final para 500 mL com água DI e armazene solução aquosa de ácido thiobarbitúrico de 0,8% na RT.

3. Preparação padrão da amostra padrão malondialdeído bis (dimethyl acetal)

NOTA: O malondialdeído (MDA) é instável e não está disponível comercialmente. No entanto, existem diferentes formas químicas de MDA que estão disponíveis comercialmente, como o sal de tetrabutylammonium MDA, MDA bis (acetal de dimetila) e MDA bis (acetal de dietilo). Dessas três formas químicas, o MDA bis (acetal de dimetila) é usado aqui, pois a maioria dos estudos usa esse mesmo padrão21,22. Se optar por usar as outras duas formas químicas de MDA, deve ser realizada validação prévia de sua adequação.

  1. Prepare uma solução de estoque de 550 μM MDA bis (dimethyl acetal) diluindo 92 μL de mda bis puro (acetal de dimetila) em 1 L de água DI. Use uma barra de mexiça magnética para misturar bem a solução por 10 minutos. Armazene a solução a 4 °C e use dentro de 1 mês.
  2. Prepare um bi de 200 μM MDA bis (acetal de dimetila) diluindo 726 μL do estoque de 550 μM MDA bis (acetal de dimetila) em 1274 μL de água DI. Esta solução de 200 μM MDA bis (acetal de dimetila) deve ser preparada fresca toda vez que um ensaio TBARS é realizado.
  3. Preparação padrão da curva: pegue oito tubos de polipropileno de tampa de snap-cap de 2 mL e rotule-os com letras A através de H. Adicione MDA bis (acetal de dimetila) do estoque de 200 μM e diluir na água conforme descrito na Tabela 1.
  4. Pegue oito tubos de vidro (13 mm x 100 mm) e rotule-os A-H, em seguida, adicione 100 μL de padrão aos tubos correspondentes. Execute seis réplicas para o padrão em branco (amostra A) para calcular os limites de detecção do ensaio TBARS.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui por não mais do que 1 h.

4. Ensaio TBARS

NOTA: Uma vez iniciado o ensaio TBARS, ele deve ser terminado sem parar.

  1. Pegue o máximo de tubos de vidro necessários para que o número de amostras seja analisado e rotule-os com os nomes das amostras. Em seguida, adicione 100 μL de cada amostra preparada (conforme descrito acima) a cada tubo de vidro.
  2. Adicione 200 μL de 8,1% SDS a cada amostra e padrões e gire suavemente o tubo de vidro em um movimento circular para misturar a amostra.
  3. Adicione 1,5 mL do tampão de acetato de sódio de 3,5 M (pH = 4) a cada amostra e padrão.
  4. Adicione 1,5 mL da solução aquosa de ácido thiobarbitúrico de 0,8% (pH = 4) a cada amostra e padrão.
  5. Leve o volume final para 4 mL para cada amostra e padrão adicionando 700 μL de água DI.
  6. Tampa firmemente cada tubo de vidro e incuba em um bloco de aquecimento definido a 95 °C por 1 h. Cubra os tubos de vidro com papel alumínio para evitar a condensação nos topos dos tubos.
  7. Remova os tubos de vidro do bloco de aquecimento e incubar no gelo por 30 minutos.
  8. Centrifugar amostras e padrões a 1500 x g por 10 min a 4 °C. Após a centrifugação, mantenha os tubos de vidro contendo as amostras e padrões na RT.
    NOTA: Manter as amostras no gelo ou a 4 °C fará com que toda a amostra ou padrão precipitar.
  9. Imediatamente após a centrifugação, aliquot 150 μL de supernante de cada tubo e coloque em um poço separado de uma placa de 96 poços.
  10. Remova todas as bolhas de cada poço usando uma ponta de pipeta.
    NOTA: A presença de bolhas produzirá leituras de absorção inconsistentes, levando a uma alta imprecisão do ensaio.
  11. Leia absorventes a 532 nm. Subtraia a leitura média de absorvência das amostras em branco de todas as outras leituras de absorvência.
  12. Crie uma curva padrão plotando as leituras de absorvância subtraídas em branco a 532 nm vs. a concentração conhecida de cada padrão. Encaixe os pontos de dados usando regressão linear. Calcular concentrações amostrais desconhecidas usando a equação da linha de regressão linear obtida da curva padrão.

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Representative Results

Em condições ácidas (pH = 4) e a 95 °C, o malondialdeído (MDA) bis (acetal de dimetila) produz MDA23. Os congêneres químicos relacionados com mDA e intimamente relacionados reagem com duas moléculas de ácido tiobarbitúrico (TBA) para produzir compostos chamados substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS), que dão uma cor vermelho-rosa e têm uma absorção λmax a 532 nm (Figura 1, Figura 2). Utilizando-se o MDA bis (dimetil acetal) como padrão, foram geradas curvas padrão (Figura 3, Tabela 1) para determinar os limites de detecção e sensibilidade do ensaio e níveis de oxidação em três diferentes amostras biológicas. Foram realizados nove ensaios TBARS para determinar os níveis de oxidação nas três amostras diferentes em dias diferentes. Assim, foram geradas nove curvas padrão, como mostra a Figura 3. O procedimento de menor quadrado24 foi utilizado para determinar os desvios padrão da inclinação e do y-intercept, que foram 8,67 x 10-6 e 5,66 x 10-4, respectivamente.

Os limites de detecção do ensaio TBARS foram determinados de acordo com os procedimentos analíticos padrão25 medindo absorvências das amostras em branco (seis réplicas experimentais com duas réplicas técnicas por replicação experimental) em três dias diferentes. O sinal analítico distinto mínimo (Sm) foi determinado somando a média do sinal em branco (Sİbl) mais um múltiplo k do desvio padrão do em branco (ksbl), onde k = 3. Ou seja, Sm = Sİbl+ ksbl. Utilizando Sm e inclinação da curva padrão (m), o limite de detecção (cm) foi calculado como cm = (Sm - Sİbl)/m. Os dados resultantes das amostras em branco em três dias diferentes mostram que a concentração mínima da substância TBARS necessária para dar um sinal de absorção não-ruído detectável é de 1,1 μM (Tabela 2). A sensibilidade do ensaio TBARS é de cerca de 0,00160 unidades de absorção/μM, que é a capacidade do ensaio de distinguir diferenças na concentração de analito (Tabela 2).

Para ilustrar a aplicabilidade do ensaio TBARS na detecção de alterações na peroxidação lipídica em várias matrizes biológicas, o CuCl2 foi usado para induzir a oxidação in vitro do soro humano, lises celulares HepG2 e lipoproteínas de baixa densidade. Estas amostras biológicas usadas aqui são protótipos de matrizes biológicas. Por exemplo, com base nos resultados apresentados aqui para os lises celulares HepG2, é razoável esperar que este ensaio funcione com outros tipos de lise celular; no entanto, precisaria ser validado analiticamente para este fim. Além disso, das três matrizes biológicas utilizadas aqui, é comum que certos tipos de amostras apresentem baixas concentrações endógenas de TBARS. Por exemplo, os TBARS para as células HepG2 que não foram tratados com CuCl2 estavam um pouco acima do limite de detecção do ensaio (cerca de 2 μM; Figura 4). Como seria de esperar na presença de baixas relações sinal-ruído, o desvio padrão e o coeficiente de variação para esta amostra em particular é relativamente alto (Tabela 3). No entanto, à medida que o sinal aumenta como resultado da oxidação mediada de Cu(II), o coeficiente de variação torna-se menor. Em geral, à medida que a absorvância aumenta além do limite de detecção, melhora a reprodutibilidade do ensaio (Tabela 3).

Para efeitos deste protocolo, não houve desejo de usar antioxidantes para mascarar a oxidação mediada in vitro cu(II) de amostras biológicas. Lipoproteína de baixa densidade (LDL) preparada comercialmente pode conter 0,01% de EDTA. O EDTA evitará a oxidação mediada por Cu(II) de LDL, mas não necessariamente outras reações de oxidação mediadas por metal26,27. Um ensaio TBARS foi realizado em amostras de LDL contendo EDTA, e os níveis de TBARS não se alteraram entre as amostras de LDL tratadas e não tratadas de (Figura 5A). No entanto, depois que o EDTA foi removido por filtragem de spin (ver passo 1.2.3-1.2.5), o LDL sofreu oxidação mediada por Cu(II), conforme detectado pelo ensaio TBARS (Figura 5B).

A gama normal de produtos de peroxidação lipídica no soro humano de doadores saudáveis expressos em termos de MDA está entre 1,80-3,94 μM28. Para ilustrar o alcance dinâmico do ensaio TBARS no soro humano, foi adicionada uma concentração de íons cu(II) de 2 mM(II) às amostras, seguida de incubação por 24 h a 37 °C. Isso resultou em um aumento de 6x-7x no TBARS (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Substâncias reativas de ácido thiobarbitúrico que ensaio esquema.
Cem microlitadores de amostra ou padrão são adicionados a um tubo de vidro de 13 mm x 100 mm, seguido pela adição de reagentes de ácido tiobarbitúrico (TBARS). Após a incubação a 95 °C por 1h, amostras e padrões são incubados em gelo por 30 min, depois centrifugas a 1.500 x g por 10 min a 4 °C. Cento e cinquenta microlitres de amostra ou supernante padrão são carregados em uma placa de poço 96, e a absorvância é medida a 532 nm. A concentração amostral desconhecida é calculada usando a equação da curva padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Reação de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico arquétipo.
Malondialdeído bis (acetal de dimetila) produz malondialdeído sob hidrólise catalisada por ácido1. Malondialdeído (MDA) liberado então reage com duas moléculas de ácido 2-thiobarbitúrico (TBA) (pH = 4 e 95 °C) para formar adutos MDA-TBA2 que dão uma cor vermelho-rosa e podem ser medidos espectrofotometricamente a 532 nm. Como outras moléculas além do MDA que são derivadas de lipídios oxidados também podem reagir com TBA, a medição de absorvância a 532 nm é simplesmente referida como uma medida de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico, ou TBARS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Malondialdeído bis (dimethyl acetal) curvas padrão colorimétricas.
A figura mostra nove curvas padrão criadas em dias diferentes. Alguns pontos se sobrepõem e não podem ser distinguidos um do outro. Malondialdeído bis (acetal de dimetila) foi fortificado em amostras de calibradores em 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 μM (como mostrado na Tabela 1; n = 1 por ponto de concentração por dia). A absorvância foi medida em 532 nm, com a absorvência média das amostras em branco subtraídas de todas as medições naquele lote, incluindo desconhecidos. A cada dia, a equação gerada pela regressão linear de menos quadrados foi utilizada para determinar TBARS em amostras biológicas. Para todas as nove curvas padrão combinadas, o desvio padrão da inclinação foi de 8,67 x 10-6, e o desvio padrão do y-intercept foi de 5,66 x 10-4. Os desvios padrão da inclinação e da interceptação y foram calculados utilizando-se o procedimento de menor quadrado24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Oxidação em lises hepG2 detectadas por TBARS.
Seis amostras de lisato de células HepG2 foram incubadas com 2 mM CuCl2 [Lisato de células HepG2 + 2 mM Cu(II)] e seis amostras foram incubadas em uma solução sem CuCl2 (hepG2 cell lysate) por 24 h a 37 °C. Após a incubação, o ensaio TBARS foi realizado nas 12 amostras. Este procedimento foi repetido 2x por um total de três dias diferentes. As barras de erro representam SD. Asterisk indica diferenças estatisticamente significativas entre o controle e os lisatos tratados com Cu(II) (p < 0,001). A significância estatística foi determinada usando um teste mann whitney u no GraphPad. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Oxidação em lipoproteína de baixa densidade detectada por TBARS.
(A) Ensaio TBARS realizado em amostras de LDL contendo 0,01% de EDTA. Seis amostras de LDL foram incubadas com 10 μM CuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)], e seis amostras foram incubadas com uma solução de controle sem cucl2 adicionado (LDL nativo) por 2 h a 37 °C. Em seguida, foi realizado um ensaio TBARS nas 12 amostras. "ns" não representa nenhum significado estatístico. (B) O LDL foi filtrado por meio de um dispositivo de filtro de giro centrífugo para remover o EDTA. Em seguida, a incubação com e sem adicionado Cu(II) foi realizada novamente como descrito para (A). O ensaio TBARS foi realizado imediatamente depois. Este mesmo procedimento foi repetido 2x por um total de 3 dias. As barras de erro representam SD. Asterisk indica diferenças estatisticamente significativas entre o controle e as amostras de LDL tratadas com Cu(II) (p < 0,001). A significância estatística foi determinada usando o teste Mann Whitney U no GraphPad. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Peroxidação lipídica em amostras de soro humano detectadas por TBARS.
Seis amostras de soro humano foram incubadas com 2 mM CuCl2 [soro + 2 mM Cu(II)], e seis amostras foram incubadas com uma solução que não tinha nenhum CuCl2 adicionado (soro normal) por 24 h a 37 °C. Após a incubação, o ensaio TBARS foi realizado nas 12 amostras. Este procedimento foi repetido em dois dias adicionais. As barras de erro representam SD. Asterisk indica diferenças estatisticamente significativas entre o controle e as amostras de soro tratados com Cu(II) (p < 0,001). A significância estatística foi determinada usando o teste Mann Whitney U no GraphPad. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tubo de vidro 200 μM MDA bis (acetal de dimetila) (μL) Água (μL) MDA bis (acetal de dimetila) Concentração final (μM)
Aa 0 1000 0
B 12.5 987.5 2.5
C 25 975 5
D 50 950 10
E 100 900 20
F 200 800 40
G 400 600 80
H 800 200 160

Tabela 1: Malondialdeído bis (dimethyl acetal) preparação padrão da amostra. A partir dos 200 μM malondialdeído bis (acetal de dimetila), aliquot os volumes sugeridos para alcançar a concentração final para a curva padrão. Recomenda-se realizar pelo menos seis réplicas da amostra em branco (A) por dia para determinar os limites de detecção do método.

Dia Absorbancea Sblb Smc Sensibilidade (unidades de absorção/μM)d cm (μM)e
1 (n = 6) 0.0412 0.000612 0.0430 0.00160 1.14
2 (n = 6) 0.0415 0.000632 0.0433 0.00160 1.18
3 (n = 6) 0.0413 0.000605 0.0431 0.00160 1.13
Todos os três dias (n = 18) 0.0413 0.000589 0.0431 0.00160 1.10
um Absorção das amostras em branco em três dias diferentes com 6 réplicas por dia.
bSbl = Desvio padrão da absorção das amostras em branco.
cSm = Sinal analítico distinto mínimo, que foi determinado somando a média do sinal em branco (Sİbl) mais um múltiplo k do desvio padrão do em branco (ksbl), onde k = 3. Ou seja, eu não tenho o que fazer. Sm = Sİbl + ksbl.
d Sensibilidade do ensaio TBARS, que é a inclinação da curva padrão.
ecm = Limites de detecção, que foi calculado como cm = (Sm - Sİbl)⁄m, onde m = a inclinação da curva padrão.

Tabela 2: Limites de detecção do ensaio TBARS.

Lipoproteína de baixa densidade Soro Humano Lysato de células HepG2
Dia % CV Dia % CV Dia % CV
1 (n = 6) 5.6 1 (n = 6) 7.9 1 (n = 6) 12.6
2 (n = 6) 5.4 2 (n = 6) 7.2 2 (n = 6) 15.8
3 (n = 6) 3.9 3 (n = 6) 7.0 3 (n = 6) 17.7
Todos os três dias (n = 18)a 7.4 Todos os três dias (n = 18) 9.8 Todos os três dias (n = 18) 15,5 bilhões
Com 10 μM CuCl2 Com 2 mM CuCl2 Com 2 mM CuCl2
1 (n = 6) 4.5 1 (n = 6) 6.0 1 (n = 6) 5.8
2 (n = 6) 6.5 2 (n = 6) 4.3 2 (n = 6) 6.0
3 (n = 6) 6.7 3 (n = 6) 6.2 3 (n = 6) 8.0
Todos os três dias (n = 18) 6.1 Todos os três dias (n = 18) 5.6 Todos os três dias (n = 18) 7.3
um A precisão interday foi calculada por meio de dados de agrupamento dos três dias.
b A precisão foi limitada devido aos resultados estarem próximos ao taldão lod.

Tabela 3: Reprodutibilidade analítica de TBARS em três amostras biológicas diferentes.

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Discussion

Apesar de suas limitações1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 e falta de adequação para comparação entre laboratórios, o ensaio do TBARS é um dos mais antigos29,30 mas ensaios mais amplamente utilizados para medir o estresse oxidativo em amostras biológicas. O ensaio TBARS é um método simples que leva apenas cerca de 2h para ser realizado, uma vez que todos os reagentes necessários tenham sido preparados. Aqui, descrevemos em detalhes como este ensaio, incluindo a curva padrão, pode ser realizado muitas vezes de forma econômica (cerca de US$ 3,50 para 96 amostras), sem ter que comprar um kit caro para cada lote de amostras.

Todas as etapas do ensaio são críticas, mas existem algumas etapas que requerem atenção extra. Por exemplo, o pH do ácido tiobarbitúrico não deve ser superior a 4. Precauções devem ser tomadas ao adicionar a solução de hidróxido de sódio ao ácido tiobarbitúrico e evitar obter um pH maior que 4. Um ambiente ácido é necessário para que a reação entre MDA e TBA ocorra, e o padrão MDA é liberado do MDA bis (acetal de dimetila) por hidrólise catalisada por ácido. Assim, um pH alto pode levar a resultados imprevisíveis e altamente variáveis31.

Além disso, embora isso possa ser óbvio para alguns leitores, também é fundamental remover quaisquer bolhas na placa de poço 96 antes de medir a absorvância. A presença de bolhas produzirá altos valores de absorção e diferenças entre as réplicas, levando a um alto percentual de CVs. Além disso, após a incubação de 1 h a 95 °C, as amostras não devem ser incubadas por mais de 30 minutos no gelo, uma vez que isso precipitará toda a amostra, e a coleta de um supernante sem precipitação será difícil de realizar. Notavelmente, não há bons pontos de parada uma vez que o ensaio TBARS foi iniciado. Deve ser concluído uma vez iniciado. Finalmente, existem muitas variações metodológicas possíveis que podem ser aplicadas a este ensaio. O protocolo geral descrito aqui pode ser mais adaptado (e validado) para aplicações específicas, incluindo aquelas em que é necessária a adição de catadores radicais ou outros tipos de antioxidantes antes da análise.

Embora o ensaio TBARS seja popular, é importante perceber que não é um ensaio molecularmente específico. Numerosas moléculas orgânicas quimicamente reativas que contêm carbonyl, incluindo aquelas derivadas de biomoléculas oxidadas que não sejam lipídios, podem reagir com TBA e, portanto, são contadas como TBARS1,32,33,34. Além disso, os limites de detecção do ensaio TBARS baseado em absorvência não ficam muito melhores do que cerca de 1,1 μM, conforme determinado por este método. No entanto, os limites de detecção podem ser melhorados usando outros métodos de detecção. Por exemplo, espectrofluorometria com excitação a 520 nm e emissão a 550 nm oferecem maior sensibilidade e melhores limites de detecção, como sugerido anteriormente por Jo e Ahn35. Métodos baseados em espectrometria de massa podem melhorar drasticamente tanto a especificidade quanto os limites de detecção. Por exemplo, um método de ionização química de íons negativos (ECNICI) de captura eletrônica (ECNICI) tem sido usado para detectar o derivado pentafluorobenzyl de MDA em amostras de soro humano e urina, com limites de detecção de 2 x 10-18 mol MDA na coluna36. Aqui, a separação cromatográfica, em combinação com espectrometria de massa tandem, melhora drasticamente a especificidade molecular do ensaio, também.

No entanto, como acontece com outras medidas de processos oxidativos dentro de amostras biológicas37,38, o manuseio pré-analítico da amostra é fundamental para o resultado das medições de TBARS. Por exemplo, o armazenamento de plasma de sangue a -20 °C resulta em aumentos lentos, mas dramáticos, nas concentrações de MDA39,40. Assim, a exposição de amostras biológicas a condições descongeladas ou mesmo parcialmente descongeladas para qualquer coisa, exceto uma quantidade mínima de tempo deve ser assumida para causar elevação artefatofatofato dos níveis de TBARS. Isso significa que mesmo uma variabilidade modesta no manuseio pré-analítico e armazenamento de bioespecimens que devem ser comparados usando o ensaio TBARS deve ser evitada.

Dadas essas ressalvas relacionadas à variabilidade pré-analítica, bem como sensibilidade e especificidade limitadas, recomenda-se que o ensaio TBARS baseado em absorvência só seja usado para avaliação geral intra-laboratorial ou experimentos de localização de alcance. Essas aplicações incluem estudos nos quais os níveis relativos de TBARS são diretamente comparados entre um ou mais grupos de amostras biologicamente semelhantes que são processadas ou armazenadas juntas e separadas por apenas uma única variável totalmente controlada pelos pesquisadores.

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Disclosures

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

A pesquisa aqui relatada foi apoiada em parte pelo Instituto Nacional de Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio nº. R33 CA217702 e o programa Iniciativa de Maximização do Desenvolvimento Estudantil (IMSD). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a visão oficial dos Institutos Nacionais de Saúde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L VWR, PA 101642--262 cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube Corning, NY CLS430897 General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile Thermo Fisher Scientific, MA 280895 To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device Fisher Scientific, NH UFC510024 LDL purification
Caps for glass tubes Thermo Fisher Scientific, MA 14-930-15D for TBARS assay
Copper II Chloride SIGMA, MO 222011-250G to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) VWR, PA 53283-800 for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ATCC, VA HB-8065 HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL eppendorf, NY 22363204 General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Genesee Sceitific, CA 22363352 General material
Fetal Bovine Serum US Source Omega Scientific, CA FB-11 for cell culture
Glacial Acetic Acid SIGMA, MO 27225-1L-R TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific, MA 87786 cell lysis reagent
HEPES SIGMA, MO H3375-250G LDL solvent
HepG2 Cells ATCC, VA HB-8065 Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl) Fisher Scientific, NH A144-212 cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge Thermo Scientific, MA 75002431 General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma Athens Research & Technology, GA 12-16-120412 Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment VWR, PA 58948-025 General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) SIGMA, MO 8207560250 TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer Fisher Scientific, NH 51119200 To measure absorbance
NP-40 EMD Millipore Corp, MA 492016-100ML cell lysis reagent
Sodium Chloride SIGMA, MO S7653-1KG cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA, MO 436143-100G TBARS Reagent
Sodium hydroxide SIGMA, MO 367176-2.5KG TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific, MA SC250EXP For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap USA Scientific, FL 658175 cell culture
Thiobarbituric Acid SIGMA, MO T5500-100G TBARS Reagent
TRIS base Fluka, GA 93362 cell lysis reagent
Trypsin (1x) VWR, PA 16777-166 To detach HepG2 cells

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