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Chemistry

Evaluación del estrés oxidativo en muestras biológicas utilizando el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61122
Automatic Translation
1,
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Summary

El objetivo del ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico es evaluar el estrés oxidativo en muestras biológicas midiendo la producción de productos de peroxidación lipídica, principalmente malondialdehído, utilizando espectrofotometría de longitud de onda visible a 532 nm. El método descrito aquí se puede aplicar al suero humano, lisados celulares y lipoproteínas de baja densidad.

Abstract

A pesar de su limitada especificidad analítica y robustez, el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) se ha utilizado ampliamente como una métrica genérica de la peroxidación lipídica en fluidos biológicos. A menudo se considera un buen indicador de los niveles de estrés oxidativo dentro de una muestra biológica, siempre que la muestra se haya manipulado y almacenado adecuadamente. El ensayo implica la reacción de productos de peroxidación lipídica, principalmente malondialdehído (MDA), con ácido tiobarbitúrico (TBA), lo que conduce a la formación de aductos MDA-TBA2 llamados TBARS. TBARS produce un color rojo-rosa que se puede medir espectrofotométricamente a 532 nm. El ensayo TBARS se realiza en condiciones ácidas (pH = 4) y a 95 °C. La MDA pura es inestable, pero estas condiciones permiten la liberación de MDA de MDA bis (dimetil acetal), que se utiliza como estándar analítico en este método. El ensayo TBARS es un método sencillo que se puede completar en aproximadamente 2 h. La preparación de los reactivos de ensayo se describe en detalle aquí. Los investigadores conscientes del presupuesto pueden usar estos reactivos para múltiples experimentos a un bajo costo en lugar de comprar un costoso kit de ensayo TBARS que solo permite la construcción de una sola curva estándar (y por lo tanto solo se puede usar para un experimento). La aplicabilidad de este ensayo TBARS se muestra en suero humano, lipoproteínas de baja densidad y lisados celulares. El ensayo es consistente y reproducible, y se pueden alcanzar límites de detección de 1,1 μM. Se proporcionan recomendaciones para el uso e interpretación del ensayo espectrofotométrico TBARS.

Introduction

La peroxidación lipídica es un proceso en el que los radicales libres, como las especies reactivas de oxígeno y las especies reactivas de nitrógeno, atacan los dobles enlaces carbono-carbono en los lípidos, un proceso que implica la extracción de un hidrógeno de un carbono y la inserción de una molécula de oxígeno. Este proceso conduce a una mezcla de productos complejos que incluyen, radicales peroxilo lipídicos e hidroperóxidos como productos primarios, así como malondialdehído (MDA) y 4-hidroxinonenal como productos secundarios predominantes1.

MDA ha sido ampliamente utilizado en la investigación biomédica como un marcador de peroxidación lipídica debido a su reacción fácil con el ácido tiobarbitúrico (TBA). La reacción conduce a la formación de MDA-TBA2, un conjugado que se absorbe en el espectro visible a 532 nm y produce un color rojo-rosa2. Otras moléculas derivadas de la peroxidación lipídica además de MDA también pueden reaccionar con TBA y absorber luz a 532 nm, contribuyendo a la señal de absorción general que se mide. Del mismo modo, MDA puede reaccionar con la mayoría de las otras clases principales de biomoléculas, lo que potencialmente limita su accesibilidad para la reacción con TBA3,4. Como tal, este ensayo tradicional se considera simplemente para medir "sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico" o TBARS5.

Cuando se aplica e interpreta correctamente, el ensayo TBARS generalmente se considera un buen indicador de los niveles generales de estrés oxidativo en una muestra biológica6. Desafortunadamente, como lo documentan Khoubnasabjafari y otros, el ensayo TBARS a menudo se realiza e interpreta de manera que facilita conclusiones dudosas3,4,7,8,9,10,11. Las causas de esto se basan principalmente en variables preanalíticas relacionadas con la muestra y en la falta de robustez del ensayo que prohíbe variaciones aparentemente menores en el protocolo del ensayo sin cambios sustanciales en los resultados del ensayo1,7,12,13.

Las variables preanalíticas relacionadas con el manejo y almacenamiento de bioespecímenes (p. ej., plasma sanguíneo mantenido temporalmente a -20 °C)14,15 pueden tener un impacto importante en los resultados de los ensayos TBARS16,17; tanto es así, que los resultados de los ensayos TBARS no deben compararse entre diferentes laboratorios a menos que estén justificados por datos explícitos de validación analítica entre laboratorios. Esta recomendación es similar a cómo se usan e interpretan comúnmente los western blots. Las comparaciones de densidades de banda son válidas para estudios dentro de la mancha y tal vez dentro del laboratorio, pero la comparación de densidades de banda entre laboratorios generalmente se considera una práctica inválida.

Algunos investigadores han sugerido que la MDA medida por el ensayo TBARS simplemente no cumple con los criterios analíticos o clínicos requeridos de un biomarcador aceptable3,9,10,18,19. De hecho, si el ensayo no se hubiera desarrollado hace más de 50 años, probablemente no habría ganado el uso generalizado y la aceptabilidad tácita que tiene hoy en día. Aunque existen otros ensayos con mayor sensibilidad analítica, especificidad y robustez utilizados para determinar el estrés oxidativo, el ensayo TBARS basado en la absorbancia a 532 nm sigue siendo, con mucho, uno de los ensayos más utilizados para la determinación de la peroxidación lipídica20 y, por lo tanto, la evaluación del estrés oxidativo.

El ensayo TBARS solo se puede encontrar como un kit costoso (más de 400 dólares estadounidenses), en el que las instrucciones no proporcionan información detallada sobre la mayoría de las concentraciones de los reactivos utilizados. Además, los reactivos proporcionados solo se pueden usar para un experimento, porque solo se puede hacer una curva estándar colorimétrica por kit. Esto puede ser problemático para los investigadores que tienen la intención de determinar los niveles de oxidación dentro de unas pocas muestras en diferentes puntos de tiempo, porque la misma curva estándar no se puede usar en múltiples momentos. Por lo tanto, es necesario comprar múltiples kits para múltiples experimentos. Actualmente, a menos que se compre un kit costoso, no hay un protocolo detallado disponible sobre cómo realizar un ensayo TBARS. Algunos investigadores en el pasado han descrito vagamente cómo realizar un ensayo TBARS21,22, pero no hay disponible en la literatura un protocolo completamente detallado o un video completo sobre cómo realizar el ensayo TBARS sin un kit costoso.

Aquí informamos una metodología detallada y analíticamente validada para el propósito sobre cómo realizar un ensayo TBARS de una manera simple, reproducible y económica. Los cambios en la peroxidación lipídica del suero humano, los lisados de HepG2 y las lipoproteínas de baja densidad tras el tratamiento con iones Cu(II) se demuestran como aplicaciones ilustrativas para el ensayo TBARS. Los resultados demuestran que este ensayo TBARS es consistente y reproducible en el día a día.

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Protocol

Los especímenes de suero humano se obtuvieron de voluntarios que consintieron bajo la aprobación del IRB y de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Las muestras fueron codificadas y desidentificadas antes de su transferencia al laboratorio analítico.

1. Preparación de la muestra

  1. Lisados de células HepG2
    1. Sembrar alrededor de 10 x 106 células HepG2 por matraz en 16 matraces T75 con 14 ml de medios EMEM suplementados con suero bovino fetal al 10% (FBS) y células de crecimiento durante 2 días.
    2. Prepare el tampón RIPA: en un tubo de 50 ml, agregue 1.5 ml de NaCl de 5 M, 2.5 ml de Tris-HCl de 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL de reactivo NP-40, luego lleve el volumen final a 50 ml con agua DI.
    3. Preparar tampón de lisis: alícuota 20 ml de tampón RIPA en un tubo de 50 ml y agregue 200 μL de una solución inhibidora de la proteasa 100x para inhibir la degradación de proteínas y lípidos. Conservar a 4 °C.
      NOTA: El búfer de lisis es compatible con los reactivos TBARS y no interfiere con la absorbancia a 532 nm. Si planea usar un tampón de lisis diferente o agregar ingredientes adicionales al tampón de lisis, se deben realizar estudios de validación preliminares para verificar que los componentes del tampón de lisis sean compatibles con el ensayo TBARS.
    4. Retire los medios que contengan 10% de FBS y lave las células 2x con 5 ml de PBS frío y estéril 1x.
    5. Agregue 1 ml de tampón de lisis a los matraces T75 que contienen las células e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) con remolinos constantes para garantizar que el tampón esté bien distribuido.
    6. Recoger los lisados en tubos de polipropileno de tapa a presión de 2 ml debidamente etiquetados e incubar en hielo durante 10 min.
    7. Gire los lisados a 5.000 x g durante 10 minutos en RT para recoger los restos celulares y aspire los sobrenadantes en un solo tubo de 15 ml.
    8. Concentre el sobrenadante de lisado celular cuatro veces usando un Speed Vac a 50 °C y 3 mbar y haga alícuotas de 94 μL cada una en tubos de polipropileno de tapa a presión de 2 mL. Almacene las muestras a -80 °C hasta que se utilicen para la oxidación in vitro y/o el ensayo TBARS.
      NOTA: Para evitar concentrar el sobrenadante de lisado celular, las células también se pueden separar usando 3 ml de 1x tripsina, neutralizarse con 6 ml de medios y lavarse 2 veces con 5 ml de PBS frío. Los gránulos celulares se pueden reconstituir en 250 μL de tampón de lisis, y luego se pueden realizar los pasos 1.1.6 y 1.1.7.
    9. Preparar una solución madre de CuCl2 de 35 mM en ácido acético (pH = 4).
      1. Preparar solución de ácido acético (pH = 4): Diluir 1 μL de ácido acético glacial en 100 mL de agua DI (el pH debe ser aproximadamente 4 pero confirmar esto con un medidor de pH). Agregue más agua o ácido acético para ajustar el pH a 4.
      2. Pesa alrededor de 0,1936 g de cloruro de cobre II y disuelve en 10 ml de la solución de ácido acético (pH = 4) para hacer un stock de CuCl2 de 144 mM. Alícuota 490 μL de esta solución y añádala a 1.510 μL de ácido acético (pH = 4) para hacer una solución de CuCl2 de 35 mM.
    10. Alícuota 6 μL de la solución madre de CuCl2 de 35 mM y agréguela a seis muestras que contengan 94 μL de lisado celular para obtener una concentración final de CuCl2 de aproximadamente 2 mM. Añadir 6 μL de una solución de ácido acético (pH = 4) que no tenga CuCl2 a seis muestras que contengan 94 μL de lisados celulares para usar como controles. El volumen final de lisado celular debe ser de 100 μL, que es lo que se utilizará para el ensayo TBARS.
      NOTA: Hacer la solución madre de CuCl2 de 35 mM en ácido acético (pH = 4) es necesario para evitar la precipitación de hidróxido de cobre.
    11. Incubar muestras en un horno a 37 °C durante 24 h y realizar un ensayo TBARS en cada muestra que contenga un volumen final de 100 μL.
    12. Repita los pasos 1.1.9 y 1.1.11 2x en días separados para comprobar la reproducibilidad del ensayo TBARS para lisados de células HepG2.
  2. Lipoproteínas de baja densidad
    NOTA: Por lo general, la lipoproteína de baja densidad (LDL) prepurificada contiene cierta cantidad de EDTA. Las muestras de LDL utilizadas aquí contienen 0.01% de EDTA. El EDTA puede inhibir la oxidación in vitro mediada por Cu(II) de LDL. Por lo tanto, puede ser necesario eliminar el EDTA de las muestras de LDL antes de los experimentos o análisis. Los pasos 1.2.1–1.2.5 describen este proceso.
    PRECAUCIÓN: El hidróxido de sodio es corrosivo y causa irritación en la piel y los ojos. Use el equipo de protección personal adecuado.
    1. Alícuota de 24 μL de un stock de LDL de 5,51 mg/ml (concentración de proteína determinada por el método de Lowry modificado utilizando BSA como estándar) en tubos de polipropileno de tapa a presión de 1 ml debidamente etiquetados. Hacer tantas alícuotas como sea necesario y almacenar a 4 °C hasta su uso en el ensayo de oxidación y/o TBARS.
    2. Prepare un tampón HEPES de 10 mM en NaCl de 0,15 M ajustado a pH = 7 con perlas de NaOH: disuelva 4,39 g de NaCl en 0,49 L de agua, luego agregue 1,19 g de HEPES. Disolver bien con una barra de agitación. Agregue perlas de hidróxido de sodio hasta que el pH sea 7. Diluir a 0,5 L con agua. Guarde el tampón a 4 °C y úselo en un plazo de 3 meses.
    3. Añadir 476 μL del tampón HEPES de 10 mM en 0,15 M NaCl (pH = 7) a las muestras de LDL alicitadas para llevar el volumen final a 500 μL. Agregue una muestra de LDL diluida a un dispositivo de filtro de espín centrífugo de 0,5 ml con un límite de peso molecular de 100 K.
    4. Girar muestras a 14.000 x g durante 10 min en RT, dejando un volumen de retentura final de aproximadamente 30 μL. Reconstituir muestras en 480 μL del tampón HEPES de 10 mM en NaCl de 0,15 M (pH = 7) y girar de nuevo a 14.000 x g durante 10 min en RT. Realice este paso 2x para un total de cuatro giros.
    5. Coloque el dispositivo de filtro boca abajo en un nuevo tubo de polipropileno de tapa a presión de 2 ml y centrífuga a 1000 x g durante 2 minutos para recolectar la muestra de LDL (volumen final = aproximadamente 30 μL).
    6. Muestre alícuota en un tubo de 1 ml debidamente etiquetado y agregue 20 μL de agua a cada muestra para lograr un volumen final de 50 μL.
    7. Preparación de 200 μM de solución madre de CuCl2 en ácido acético (pH = 4)
      1. Preparar la solución de ácido acético (pH = 4): ver paso 1.1.9.1.
      2. Preparar una solución madre de CuCl2 de 144 mM (ver paso 1.1.9.2), luego alícuota 5.5 μL del caldo de CuCl2 de 144 mM y disolver en un volumen final de 4 mL de ácido acético (pH = 4) para hacer la solución de 200 μM.
    8. Alícuota 2,7 μL de la solución madre de CuCl2 de 200 μM y agréguela a seis muestras que contengan 50 μL de LDL para lograr una concentración final de CuCl2 de ~10 μM. Añadir 2,7 μL de una solución de ácido acético (pH = 4) que no contenga CuCl2 a seis muestras que contengan 50 μL de LDL que se utilizarán para los controles.
    9. Incubar muestras de LDL durante 2 h en un horno a 37 °C. Después de 2 h, llevar el volumen final a 100 μL para cada muestra con un tampón HEPES de 10 mM en 0,15 M de NaCl (pH = 7). Realice inmediatamente un ensayo TBARS.
    10. Repita los pasos 1.2.3–1.2.9 2x en dos días diferentes para probar la reproductividad del ensayo TBARS.
  3. Suero humano
    1. A partir de una muestra de suero humano, haga alícuotas de 94 μL cada una en tubos de polipropileno de tapa a presión de 2 ml y almacene las muestras a -80 °C.
    2. Preparar una solución madre de CuCl2 de 35 mM en ácido acético (pH = 4): ver paso 1.1.9.
    3. Alícuota 6 μL de la solución madre de CuCl2 y agréguela a seis muestras que contengan 94 μL de suero humano para obtener una concentración final de CuCl2 de aproximadamente 2 mM. Añadir 6 μL de una solución de ácido acético (pH = 4) que no tenga CuCl2 a seis muestras que contengan 94 μL de suero humano para usar como controles.
    4. Incubar muestras de suero humano durante 24 h en un horno a 37 °C y determinar los niveles de oxidación con el ensayo TBARS (sección 4).
    5. Repita los pasos 1.3.2–1.3.4 2x en dos días separados para determinar la reproducibilidad del ensayo TBARS.

2. Preparación de reactivos

PRECAUCIÓN: El ácido tiobarbitúrico causa irritación de la piel y los ojos y puede ser dañino por inhalación o absorción de la piel. El ácido acético puede dañar los órganos internos si se inhala. Prepare todas las soluciones ácidas en una campana extractora de humos.

  1. Preparación de solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 8,1% (p/v)
    1. Pesa 32,4 g de SDS y disuelve en 350 ml de agua DI en un vaso de precipitados. Use una barra de agitación magnética para disolver suavemente el SDS y evitar hacer burbujas. Lleve el volumen final a 400 ml con agua DI y almacene la solución SDS en RT.
      NOTA: Aquí, se prepara una solución SDS al 8,1% en exceso; sin embargo, para 96 muestras, solo se necesitan aproximadamente 20 ml de la solución SDS al 8,1%. Prepare esta solución de acuerdo con el número de muestras que se están analizando.
  2. Preparación de tampón de acetato de sodio 3.5 M (pH = 4)
    1. Diluya 100 ml de ácido acético glacial en 350 ml de agua DI en un vaso de precipitados. Use una barra de agitación magnética para disolverlo suavemente.
    2. Prepare una solución de NaOH de 6,5 M utilizando perlas de hidróxido de sodio en agua. Disolver 13 g de perlas de NaOH en 40 mL de agua DI y llevar a un volumen final de 50 mL con agua DI.
    3. Agregue lentamente aproximadamente 46 ml de la solución de NaOH de 6.5 M a la solución de ácido acético mientras se mezcla con la barra de agitación (esto debería elevar el pH a 4, pero confirme agregando lentamente la solución de NaOH mientras mide con un medidor de pH).
    4. Lleve el volumen final a 500 ml con agua DI y almacene el tampón de acetato de sodio en RT.
  3. Preparación de solución acuosa al 0,8% de ácido tiobarbitúrico (ajustada a pH = 4)
    NOTA: En este paso, la preparación del ácido tiobarbitúrico está optimizada para grandes volúmenes, ya que se va a analizar un gran número de muestras (108 muestras, sin incluir los estándares). Prepare esta solución en función del número de muestras previstas para el análisis.
    1. Prepare una solución de hidróxido de sodio de 5 M utilizando perlas de hidróxido de sodio y agua: disuelva 4 g de perlas de hidróxido de sodio en un volumen final de 20 ml de agua. Almacenar en un recipiente de plástico. Esta solución debe estar recién preparada para cada lote.
    2. Pesa 4 g de ácido tiobarbitúrico y añade 450 ml de agua DI. Use una barra de agitación magnética para disolverlo suavemente.
      NOTA: Esta solución eventualmente se llevará a un volumen total de 500 ml.
    3. Mientras disuelve el ácido tiobarbitúrico con una barra de agitación, agregue (lentamente y de manera superficial) aproximadamente 3 ml de la solución de NaOH de 5 M en incrementos de 100 μL. Después de agregar la solución de NaOH, las partículas de ácido tiobarbitúrico comenzarán a disolverse.
    4. Si las partículas de ácido tiobarbitúrico aún no se han disuelto por completo, agregue más de la solución de NaOH de 5 M en incrementos de 100 μL hasta que todas las partículas de ácido tiobarbitúrico se disuelvan por completo. Para este volumen particular de solución, se agrega un total de 4 ml de la solución de NaOH de 5 M para disolver completamente las partículas de ácido tiobarbitúrico.
      NOTA: A esta concentración, el ácido tiobarbitúrico no se disolverá completamente a menos que el pH sea de casi 4.
    5. Deje de agregar NaOH después de que todo el ácido tiobarbitúrico se haya disuelto por completo. Evite exceder un pH de 4. El pH final se puede verificar tomando 1 μL de la solución de ácido tiobarbitúrico mezclada y colocándola sobre papel de pH.
    6. Lleve el volumen final a 500 ml con agua DI y almacene la solución acuosa de ácido tiobarbitúrico al 0,8% en RT.

3. Preparación estándar de muestras de malondialdehído bis (dimetil acetal)

NOTA: El malondialdehído (MDA) es inestable y no está disponible comercialmente. Sin embargo, hay diferentes formas químicas de MDA que están disponibles comercialmente, como la sal de tetrabutilamonio MDA, MDA bis (dimetil acetal) y MDA bis (dietil acetal). De estas tres formas químicas, MDA bis(dimetil acetal) se utiliza aquí, porque la mayoría de los estudios utilizan este mismo estándar21,22. Si se opta por utilizar las otras dos formas químicas de MDA, se debe llevar a cabo una validación previa de su idoneidad.

  1. Prepare una solución madre de MDA bis(dimetilacetal) de 550 μM diluyendo 92 μL de MDA bis(dimetil acetal) puro en 1 L de agua DI. Use una barra de agitación magnética para mezclar bien la solución durante 10 minutos. Guarde la solución a 4 °C y úsela en un plazo de 1 mes.
  2. Preparar un 200 μM MDA bis(dimetil acetal) diluyendo 726 μL de la cepa de 550 μM MDA bis(dimetil acetal) en 1274 μL de agua DI. Esta solución de 200 μM MDA bis(dimetil acetal) debe prepararse fresca cada vez que se realice un ensayo TBARS.
  3. Preparación de la curva estándar: tome ocho tubos de polipropileno de tapa a presión de 2 ml y etiquételos con letras A a H. Agregue MDA bis (dimetil acetal) del stock de 200 μM y diluya en agua como se describe en la Tabla 1.
  4. Tome ocho tubos de vidrio (13 mm x 100 mm) y etiquételos de la A a la H, luego agregue 100 μL de estándar a los tubos correspondientes. Realice seis réplicas para el estándar en blanco (muestra A) para calcular los límites de detección del ensayo TBARS.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí por no más de 1 h.

4. Ensayo TBARS

NOTA: Una vez que se inicia el ensayo TBARS, debe terminarse sin detenerse.

  1. Tome tantos tubos de vidrio como sea necesario para el número de muestras a analizar y etiquételos con los nombres de las muestras. Luego, agregue 100 μL de cada muestra preparada (como se describió anteriormente) a cada tubo de vidrio.
  2. Agregue 200 μL de SDS al 8.1% a cada muestra y haga girar suavemente el tubo de vidrio en un movimiento circular para mezclar la muestra.
  3. Agregue 1.5 ml del tampón de acetato de sodio de 3.5 M (pH = 4) a cada muestra y estándar.
  4. Añadir 1,5 ml de la solución acuosa de ácido tiobarbitúrico al 0,8% (pH = 4) a cada muestra y estándar.
  5. Lleve el volumen final a 4 ml para cada muestra y estándar agregando 700 μL de agua DI.
  6. Tapa herméticamente cada tubo de vidrio e incuba en un bloque calefactor a 95 °C durante 1 h. Cubra los tubos de vidrio con papel de aluminio para evitar la condensación en la parte superior de los tubos.
  7. Retire los tubos de vidrio del bloque de calentamiento e incube en hielo durante 30 minutos.
  8. Muestras de centrífugas y estándares a 1500 x g durante 10 min a 4 °C. Después de la centrifugación, mantenga los tubos de vidrio que contienen las muestras y los estándares en RT.
    NOTA: Mantener las muestras en hielo o a 4 °C hará que toda la muestra o estándar precipite.
  9. Inmediatamente después de la centrifugación, alícuota 150 μL de sobrenadante de cada tubo y colóquelo en un pozo separado de una placa de 96 pocillos.
  10. Retire las burbujas de cada pozo con una punta de pipeta.
    NOTA: La presencia de burbujas producirá lecturas de absorbancia inconsistentes, lo que llevará a una alta imprecisión del ensayo.
  11. Absorbancias de lectura a 532 nm. Reste la lectura de absorbancia promedio de las muestras en blanco de todas las demás lecturas de absorbancia.
  12. Cree una curva estándar trazando las lecturas de absorbancia restadas en blanco a 532 nm frente a la concentración conocida de cada estándar. Ajuste los puntos de datos mediante regresión lineal. Calcular concentraciones de muestra desconocidas utilizando la ecuación de la línea de regresión lineal obtenida de la curva estándar.

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Representative Results

En condiciones ácidas (pH = 4) y a 95 °C, el malondialdehído (MDA) bis(dimetil acetal) produce MDA23. MDA y congéneres químicos estrechamente relacionados reaccionan con dos moléculas de ácido tiobarbitúrico (TBA) para producir compuestos llamados sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), que dan un color rojo-rosa y tienen una absorbancia λmax a 532 nm (Figura 1, Figura 2). Utilizando MDA bis (dimetil acetal) como estándar, se generaron curvas estándar (Figura 3, Tabla 1) para determinar los límites de detección y sensibilidad del ensayo y los niveles de oxidación en tres muestras biológicas diferentes. Se realizaron un total de nueve ensayos TBARS para determinar los niveles de oxidación en las tres muestras diferentes en diferentes días. Por lo tanto, se generaron un total de nueve curvas estándar, como se muestra en la Figura 3. Se utilizó el procedimiento de mínimos cuadrados24 para determinar las desviaciones estándar de la pendiente y la intersección y, que fueron de 8,67 x 10-6 y 5,66 x 10-4, respectivamente.

Los límites de detección del ensayo TBARS se determinaron de acuerdo con procedimientos analíticos estándar25 midiendo absorbancias de las muestras en blanco (seis réplicas experimentales con dos réplicas técnicas por réplica experimental) en tres días diferentes. La señal analítica mínima distinguible (Sm) se determinó sumando la media de la señal en blanco (S̄bl) más un múltiplo k de la desviación estándar del blanco (ksbl), donde k = 3. Es decir, Sm = S̄bl+ ksbl. Usando Sm y la pendiente de la curva estándar (m), el límite de detección (cm) se calculó como cm = (Sm - S̄bl)/m. Los datos resultantes de las muestras en blanco en tres días diferentes muestran que la concentración mínima de sustancia TBARS necesaria para dar una señal detectable de no absorbancia de ruido es de 1,1 μM (Tabla 2). La sensibilidad del ensayo TBARS es de aproximadamente 0,00160 unidades de absorbancia/μM, que es la capacidad del ensayo para distinguir diferencias en la concentración de analitos (Tabla 2).

Para ilustrar la aplicabilidad del ensayo TBARS en la detección de cambios en la peroxidación lipídica en diversas matrices biológicas, se utilizó CuCl2 para inducir la oxidación in vitro del suero humano, lisados de células HepG2 y lipoproteínas de baja densidad. Estas muestras biológicas utilizadas aquí son prototipos de matrices biológicas. Por ejemplo, sobre la base de los resultados presentados aquí para los lisados de células HepG2, es razonable esperar que este ensayo funcione con otros tipos de lisado celular; sin embargo, tendría que ser validado analíticamente para este propósito. Además, de las tres matrices biológicas utilizadas aquí, es común que ciertos tipos de muestras exhiban bajas concentraciones endógenas de TBARS. Por ejemplo, TBARS para lisados de células HepG2 que no fueron tratados con CuCl2 estaban justo por encima del límite de detección del ensayo (aproximadamente 2 μM; Figura 4). Como era de esperar en presencia de bajas relaciones señal-ruido, la desviación estándar y el coeficiente de variación para esta muestra en particular es relativamente alto (Tabla 3). Sin embargo, a medida que la señal aumenta como resultado de la oxidación mediada por Cu(II), el coeficiente de variación se vuelve más bajo. En general, a medida que la absorbancia aumenta más allá del límite de detección, la reproducibilidad del ensayo mejora (Tabla 3).

A los efectos de este protocolo, no hubo deseo de utilizar antioxidantes para enmascarar la oxidación in vitro mediada por Cu(II) de muestras biológicas. La lipoproteína de baja densidad (LDL) preparada comercialmente puede contener 0.01% de EDTA. El EDTA evitará la oxidación mediada por Cu(II) de LDL, pero no necesariamente otras reacciones de oxidación mediadas por metales26,27. Se realizó un ensayo de TBARS en muestras de LDL que contenían EDTA, y los niveles de TBARS no cambiaron entre las muestras de LDL tratadas con Cu(II) y no tratadas (Figura 5A). Sin embargo, después de que el EDTA se eliminó por filtración de espín (ver paso 1.2.3–1.2.5), el LDL se sometió a oxidación mediada por Cu(II), según lo detectado por el ensayo TBARS (Figura 5B).

El rango normal de productos de peroxidación lipídica en el suero humano de donantes sanos expresado en términos de MDA está entre 1,80-3,94 μM28. Para ilustrar el rango dinámico del ensayo TBARS en suero humano, se añadió a las muestras una concentración de 2 iones mM Cu(II), seguida de una incubación durante 24 h a 37 °C. Esto resultó en un aumento de 6x–7x en TBARS (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Esquema de ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico.
Cien microlitros de muestra o estándar se agregan a un tubo de vidrio de 13 mm x 100 mm, seguido de la adición de reactivos de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). Después de la incubación a 95 °C durante 1 h, las muestras y los estándares se incuban en hielo durante 30 min, luego se centrifugan a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C. Ciento cincuenta microlitros de muestra o sobrenadante estándar se cargan en una placa de 96 pocillos, y la absorbancia se mide a 532 nm. La concentración de muestra desconocida se calcula utilizando la ecuación de la curva estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Reacción de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico arquetipo.
El malondialdehído bis(dimetil acetal) produce malondialdehído bajo hidrólisis catalizada por ácido1. El malondialdehído liberado (MDA) reacciona con dos moléculas de ácido 2-tiobarbitúrico (TBA) (pH = 4 y 95 °C) para formar aductos MDA-TBA2 que dan un color rojo-rosa y se pueden medir espectrofotométricamente a 532 nm. Debido a que otras moléculas además de MDA que se derivan de lípidos oxidados también pueden reaccionar con TBA, la medición de absorbancia a 532 nm se conoce simplemente como una medición de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, o TBARS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Curvas estándar colorimétricas de malondialdehído bis(dimetil acetal).
La figura muestra nueve curvas estándar creadas en diferentes días. Algunos puntos se superponen y no se pueden distinguir entre sí. El malondialdehído bis (dimetil acetal) se fortificó en muestras de calibradores a 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 y 160 μM (como se muestra en la Tabla 1; n = 1 por punto de concentración por día). La absorbancia se midió a 532 nm, con la absorbancia promedio de las muestras en blanco restada de todas las mediciones en ese lote, incluidas las incógnitas. Cada día, se utilizó la ecuación generada por la regresión lineal de mínimos cuadrados para determinar TBARS en muestras biológicas. Para las nueve curvas estándar combinadas, la desviación estándar de la pendiente fue de 8,67 x 10-6, y la desviación estándar de la intersección y fue de 5,66 x 10-4. Las desviaciones estándar de la pendiente y la intersección y se calcularon mediante el procedimiento de mínimos cuadrados24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Oxidación en lisados HepG2 detectados por TBARS.
Seis muestras de lisado de células HepG2 se incubaron con 2 mM CuCl2 [lisado de células HepG2 + 2 mM Cu(II)] y seis muestras se incubaron en una solución sin CuCl2 (lisado de células HepG2) durante 24 h a 37 °C. Después de la incubación, se realizó el ensayo TBARS en las 12 muestras. Este procedimiento se repitió 2 veces durante un total de tres días diferentes. Las barras de error representan SD. El asterisco indica diferencias estadísticamente significativas entre el control y los lisados tratados con Cu(II) (p < 0,001). La significación estadística se determinó mediante una prueba U de Mann Whitney en GraphPad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Oxidación en lipoproteínas de baja densidad detectadas por TBARS.
(A) Ensayo TBARS realizado en muestras de LDL que contienen 0,01% de EDTA. Seis muestras de LDL se incubaron con 10 μM CuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)], y seis muestras se incubaron con una solución de control sin CuCl2 añadido (LDL nativo) durante 2 h a 37 °C. Luego, se realizó un ensayo TBARS en las 12 muestras. "ns" no representa significación estadística. (B) El LDL se filtró por espín utilizando un dispositivo de filtro de espín centrífugo para eliminar el EDTA. Luego, la incubación con y sin Cu(II) agregado se realizó nuevamente como se describe para (A). El ensayo TBARS se realizó inmediatamente después. Este mismo procedimiento se repitió 2 veces durante un total de 3 días. Las barras de error representan SD. El asterisco indica diferencias estadísticamente significativas entre las muestras de LDL tratadas con control y Cu(II) (p < 0,001). La significación estadística se determinó mediante la prueba U de Mann Whitney en GraphPad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Peroxidación lipídica en muestras de suero humano detectadas por TBARS.
Seis muestras de suero humano se incubaron con 2 mM CuCl2 [suero + 2 mM Cu(II)], y seis muestras se incubaron con una solución que no tenía ningún CuCl2 añadido (suero normal) durante 24 h a 37 °C. Después de la incubación, se realizó el ensayo TBARS en las 12 muestras. Este procedimiento se repitió en dos días adicionales. Las barras de error representan SD. El asterisco indica diferencias estadísticamente significativas entre las muestras de suero tratadas con Control y Cu(II) (p < 0,001). La significación estadística se determinó mediante la prueba U de Mann Whitney en GraphPad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tubo de vidrio 200 μM MDA bis (dimetil acetal) (μL) Agua (μL) Concentración final de MDA bis (dimetil acetal) (μM)
Aa 0 1000 0
B 12.5 987.5 2.5
C 25 975 5
D 50 950 10
E 100 900 20
F 200 800 40
G 400 600 80
H 800 200 160

Tabla 1: Preparación estándar de muestras de malondialdehído bis(dimetil acetal). A partir del recién preparado 200 μM de malondialdehído bis(dimetil acetal), alícuota los volúmenes sugeridos para alcanzar la concentración final para la curva estándar. Se recomienda realizar al menos seis réplicas de la muestra en blanco (A) por día para determinar los límites de detección del método.

Día Absorbancia Sblb Smc Sensibilidad (unidades de absorbancia/μM)d cm (μM)e
1 (n = 6) 0.0412 0.000612 0.0430 0.00160 1.14
2 (n = 6) 0.0415 0.000632 0.0433 0.00160 1.18
3 (n = 6) 0.0413 0.000605 0.0431 0.00160 1.13
Los tres días (n = 18) 0.0413 0.000589 0.0431 0.00160 1.10
un Absorbancia de las muestras en blanco en tres días diferentes con 6 réplicas por día.
bSbl = Desviación estándar de la absorbancia de las muestras en blanco.
cSm = Señal analítica distinguible mínima, que se determinó sumando la media de la señal en blanco (S̄bl) más un múltiplo k de la desviación estándar del blanco (ksbl), donde k = 3. Es decir; Sm = S̄bl + ksbl.
d Sensibilidad del ensayo TBARS, que es la pendiente de la curva estándar.
ecm = Límites de detección, que se calculó como cm = (Sm - S̄bl)⁄m, donde m = la pendiente de la curva estándar.

Tabla 2: Límites de detección del ensayo TBARS.

Lipoproteína de baja densidad Suero humano Lisado celular HepG2
Día % CV Día % CV Día % CV
1 (n = 6) 5.6 1 (n = 6) 7.9 1 (n = 6) 12.6
2 (n = 6) 5.4 2 (n = 6) 7.2 2 (n = 6) 15.8
3 (n = 6) 3.9 3 (n = 6) 7.0 3 (n = 6) 17.7
Los tres días (n = 18)a 7.4 Los tres días (n = 18) 9.8 Los tres días (n = 18) 15,5b
Con 10 μM CuCl2 Con 2 mM CuCl2 Con 2 mM CuCl2
1 (n = 6) 4.5 1 (n = 6) 6.0 1 (n = 6) 5.8
2 (n = 6) 6.5 2 (n = 6) 4.3 2 (n = 6) 6.0
3 (n = 6) 6.7 3 (n = 6) 6.2 3 (n = 6) 8.0
Los tres días (n = 18) 6.1 Los tres días (n = 18) 5.6 Los tres días (n = 18) 7.3
un La precisión entre días se calculó agrupando los datos de los tres días.
b La precisión fue limitada debido a que los resultados estaban cerca del ensayo LOD.

Tabla 3: Reproducibilidad analítica de TBARS en tres muestras biológicas diferentes.

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Discussion

A pesar de sus limitaciones1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 y la falta de idoneidad para la comparación entre laboratorios, el ensayo TBARS es uno de los más antiguos29,30 pero los ensayos más utilizados para medir el estrés oxidativo en muestras biológicas. El ensayo TBARS es un método sencillo que solo tarda unas 2 horas en realizarse, una vez que se han preparado todos los reactivos necesarios. Aquí, hemos descrito en detalle cómo este ensayo, incluida la curva estándar, se puede realizar muchas veces de una manera económica (alrededor de $ 3.50 USD por 96 muestras), sin tener que comprar un kit costoso para cada lote de muestras.

Todos los pasos del ensayo son críticos, pero hay algunos pasos que requieren atención adicional. Por ejemplo, el pH del ácido tiobarbitúrico no debe ser superior a 4. Se deben tomar precauciones al agregar la solución de hidróxido de sodio al ácido tiobarbitúrico y evitar obtener un pH superior a 4. Se requiere un ambiente ácido para que ocurra la reacción entre MDA y TBA, y el estándar MDA se libera de MDA bis (acetal de dimetilo) por hidrólisis catalizada por ácido. Por lo tanto, un pH alto puede conducir a resultados impredecibles y altamente variables31.

Además, si bien esto puede ser obvio para algunos lectores, también es fundamental eliminar cualquier burbuja en la placa de 96 pocillos antes de medir la absorbancia. La presencia de burbujas producirá altos valores de absorbancia y diferencias entre las réplicas, lo que dará lugar a un alto porcentaje de CV. Además, después de la incubación de 1 h a 95 °C, las muestras no deben incubarse más de 30 minutos en hielo, ya que esto precipitará toda la muestra, y la recolección de un sobrenadante libre de precipitados será difícil de lograr. En particular, no hay buenos puntos de parada una vez que se ha iniciado el ensayo TBARS. Debe completarse una vez iniciado. Finalmente, hay muchas variaciones metodológicas posibles que se pueden aplicar a este ensayo. El protocolo general descrito aquí puede adaptarse (y validarse) para aplicaciones específicas, incluidas aquellas en las que se requiere la adición de eliminadores de radicales u otros tipos de antioxidantes antes del análisis.

Si bien el ensayo TBARS es popular, es importante darse cuenta de que no es un ensayo molecularmente específico. Numerosas moléculas orgánicas que contienen carbonilo químicamente reactivas, incluidas las derivadas de biomoléculas oxidadas distintas de los lípidos, pueden reaccionar con TBA y, por lo tanto, se cuentan como TBARS1,32,33,34. Además, los límites de detección del ensayo TBARS basado en absorbancia no mejoran mucho más que aproximadamente 1,1 μM, según lo determinado por este método. Sin embargo, los límites de detección se pueden mejorar mediante el uso de otros métodos de detección. Por ejemplo, la espectrofluorometría con excitación a 520 nm y emisión a 550 nm ofrece una mayor sensibilidad y mejores límites de detección, como sugirieron previamente Jo y Ahn35. Los métodos basados en espectrometría de masas pueden mejorar drásticamente tanto la especificidad como los límites de detección. Por ejemplo, se ha utilizado un método GC-MS/MS con ionización química de iones negativos de captura de electrones (ECNICI) para detectar el derivado pentafluorobencilo de MDA en muestras humanas de suero y orina, con límites de detección de 2 x 10-18 mol MDA en la columna36. Aquí, la separación cromatográfica, en combinación con la espectrometría de masas en tándem, también mejora drásticamente la especificidad molecular del ensayo.

Sin embargo, al igual que con otras mediciones de procesos oxidativos dentro de muestras biológicas37,38, el manejo preanalítico de muestras es crítico para el resultado de las mediciones de TBARS. Por ejemplo, el almacenamiento de plasma sanguíneo a -20 °C da lugar a aumentos lentos pero dramáticos en las concentraciones de MDA39,40. Por lo tanto, se debe suponer que la exposición de muestras biológicas a condiciones descongeladas o incluso parcialmente descongeladas durante cualquier cosa menos una cantidad mínima de tiempo causa una elevación artificiosa de los niveles de TBARS. Esto significa que incluso se debe evitar una variabilidad modesta en el manejo y almacenamiento preanalítico de bioespecímenes que deben compararse utilizando el ensayo TBARS.

Dadas estas advertencias relacionadas con la variabilidad preanalítica, así como con la sensibilidad y especificidad limitadas, se recomienda que el ensayo TBARS basado en absorbancia solo se use para la evaluación general intralaboratorio o experimentos de búsqueda de rango. Estas aplicaciones incluyen estudios en los que los niveles relativos de TBARS se comparan directamente entre uno o más grupos de muestras biológicamente similares que se procesan o almacenan juntas y separadas por una sola variable que está totalmente controlada por los investigadores.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses financieros en competencia u otros conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

La investigación reportada aquí fue apoyada en parte por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio no. R33 CA217702 y el programa iniciativa para maximizar el desarrollo estudiantil (IMSD). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L VWR, PA 101642--262 cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube Corning, NY CLS430897 General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile Thermo Fisher Scientific, MA 280895 To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device Fisher Scientific, NH UFC510024 LDL purification
Caps for glass tubes Thermo Fisher Scientific, MA 14-930-15D for TBARS assay
Copper II Chloride SIGMA, MO 222011-250G to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) VWR, PA 53283-800 for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ATCC, VA HB-8065 HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL eppendorf, NY 22363204 General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Genesee Sceitific, CA 22363352 General material
Fetal Bovine Serum US Source Omega Scientific, CA FB-11 for cell culture
Glacial Acetic Acid SIGMA, MO 27225-1L-R TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific, MA 87786 cell lysis reagent
HEPES SIGMA, MO H3375-250G LDL solvent
HepG2 Cells ATCC, VA HB-8065 Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl) Fisher Scientific, NH A144-212 cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge Thermo Scientific, MA 75002431 General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma Athens Research & Technology, GA 12-16-120412 Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment VWR, PA 58948-025 General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) SIGMA, MO 8207560250 TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer Fisher Scientific, NH 51119200 To measure absorbance
NP-40 EMD Millipore Corp, MA 492016-100ML cell lysis reagent
Sodium Chloride SIGMA, MO S7653-1KG cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA, MO 436143-100G TBARS Reagent
Sodium hydroxide SIGMA, MO 367176-2.5KG TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific, MA SC250EXP For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap USA Scientific, FL 658175 cell culture
Thiobarbituric Acid SIGMA, MO T5500-100G TBARS Reagent
TRIS base Fluka, GA 93362 cell lysis reagent
Trypsin (1x) VWR, PA 16777-166 To detach HepG2 cells

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Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. R. Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay. J. Vis. Exp. (159), e61122, doi:10.3791/61122 (2020).

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