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Chemistry

Bewertung von oxidativem Stress in biologischen Proben mit dem Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assay

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61122
Automatic Translation
1,
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Summary

Das Ziel des Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assays ist es, oxidativen Stress in biologischen Proben zu bewerten, indem die Produktion von Lipidperoxidationsprodukten, hauptsächlich Malondialdehyd, unter Verwendung der Spektrophotometrie der sichtbaren Wellenlänge bei 532 nm gemessen wird. Die hier beschriebene Methode kann auf menschliches Serum, Zelllysate und Lipoproteine niedriger Dichte angewendet werden.

Abstract

Trotz seiner begrenzten analytischen Spezifität und Robustheit wurde der Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) Assay weit verbreitet als generische Metrik der Lipidperoxidation in biologischen Flüssigkeiten verwendet. Es wird oft als ein guter Indikator für den Grad des oxidativen Stresses in einer biologischen Probe angesehen, vorausgesetzt, die Probe wurde ordnungsgemäß gehandhabt und gelagert. Der Assay beinhaltet die Reaktion von Lipidperoxidationsprodukten, hauptsächlich Malondialdehyd (MDA), mit Thiobarbitursäure (TBA), was zur Bildung von MDA-TBA2-Addukten namens TBARS führt. TBARS ergibt eine rot-rosa Farbe, die spektralphotometrisch bei 532 nm gemessen werden kann. Der TBARS-Assay wird unter sauren Bedingungen (pH = 4) und bei 95 °C durchgeführt. Reines MDA ist instabil, aber diese Bedingungen erlauben die Freisetzung von MDA aus MDA-Bis (Dimethylacetal), das als analytischer Standard in dieser Methode verwendet wird. Der TBARS-Assay ist eine einfache Methode, die in etwa 2 h abgeschlossen werden kann. Die Herstellung von Assay-Reagenzien wird hier ausführlich beschrieben. Budgetbewusste Forscher können diese Reagenzien für mehrere Experimente zu geringen Kosten verwenden, anstatt ein teures TBARS-Assay-Kit zu kaufen, das nur die Konstruktion einer einzigen Standardkurve erlaubt (und somit nur für ein Experiment verwendet werden kann). Die Anwendbarkeit dieses TBARS-Assays wird in humanem Serum, Lipoproteinen niedriger Dichte und Zelllysaten gezeigt. Der Assay ist konsistent und reproduzierbar, und es können Nachweisgrenzen von 1,1 μM erreicht werden. Es werden Empfehlungen für die Verwendung und Interpretation des spektralphotometrischen TBARS-Assays gegeben.

Introduction

Lipidperoxidation ist ein Prozess, bei dem freie Radikale, wie reaktive Sauerstoffspezies und reaktive Stickstoffspezies, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in Lipiden angreifen, ein Prozess, der die Abstraktion eines Wasserstoffs aus einem Kohlenstoff und die Insertion eines Sauerstoffmoleküls beinhaltet. Dieser Prozess führt zu einer Mischung komplexer Produkte, einschließlich Lipidperoxylreste und Hydroperoxide als Primärprodukte sowie Malondialdehyd (MDA) und 4-Hydroxynonenal als vorherrschende Sekundärprodukte1.

MDA wurde in der biomedizinischen Forschung aufgrund seiner einfachen Reaktion mit Thiobarbitursäure (TBA) häufig als Marker für die Lipidperoxidation verwendet. Die Reaktion führt zur Bildung von MDA-TBA2, einem Konjugat, das im sichtbaren Spektrum bei 532 nm absorbiert und eine rot-rosa Farbe erzeugt2. Andere Moleküle, die neben MDA aus der Lipidperoxidation stammen, können ebenfalls mit TBA reagieren und Licht bei 532 nm absorbieren, was zum gemessenen Gesamtabsorptionssignal beiträgt. In ähnlicher Weise kann MDA mit den meisten anderen wichtigen Klassen von Biomolekülen reagieren, was möglicherweise seine Zugänglichkeit für die Reaktion mit TBA3,4 einschränkt. Daher wird dieser traditionelle Assay einfach als Messung von "Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen" oder TBARS5 betrachtet.

Bei richtiger Anwendung und Interpretation wird der TBARS-Assay im Allgemeinen als guter Indikator für den Gesamtgehalt des oxidativen Stresses in einer biologischen Probe angesehen6. Leider, wie von Khoubnasabjafari und anderen dokumentiert, wird der TBARS-Assay oft auf eine Weise durchgeführt und interpretiert, die zweifelhafte Schlussfolgerungen ermöglicht3,4,7,8,9,10,11. Die Ursachen dafür liegen in erster Linie in probenbezogenen präanalytischen Variablen und einem Mangel an Assay-Robustheit, der scheinbar geringfügige Variationen im Assay-Protokoll ohne wesentliche Änderungen der Assay-Ergebnisse verbietet1,7,12,13.

Präanalytische Variablen im Zusammenhang mit der Handhabung und Lagerung von Bioproben (z. B. Blutplasma, das vorübergehend bei -20 °C gehalten wird)14,15 können einen großen Einfluss auf die TBARS-Testergebnisse haben16,17; so sehr, dass TBARS-Assay-Ergebnisse nicht zwischen verschiedenen Labors verglichen werden sollten, es sei denn, dies wird durch explizite analytische Validierungsdaten zwischen den Labors gerechtfertigt. Diese Empfehlung ähnelt der Art und Weise, wie Western Blots häufig verwendet und interpretiert werden. Vergleiche der Banddichten gelten für Studien innerhalb des Blots und vielleicht innerhalb des Labors, aber der Vergleich der Banddichten zwischen Laboratorien wird im Allgemeinen als ungültige Praxis angesehen.

Einige Forscher haben vorgeschlagen, dass MDA, gemessen mit dem TBARS-Assay, einfach nicht die analytischen oder klinischen Kriterien erfüllt, die für einen akzeptablen Biomarker erforderlich sind3,9,10,18,19. In der Tat, wenn der Assay nicht vor über 50 Jahren entwickelt worden wäre, hätte er wahrscheinlich nicht die weit verbreitete Verwendung und stillschweigende Akzeptanz erlangt, die er heute hat. Obwohl es andere Assays mit größerer analytischer Sensitivität, Spezifität und Robustheit gibt, die zur Bestimmung von oxidativem Stress verwendet werden, bleibt der TBARS-Assay, der auf der Absorption bei 532 nm basiert, bei weitem einer der am häufigsten verwendeten Assays zur Bestimmung der Lipidperoxidation20 und damit zur Bewertung von oxidativem Stress.

Der TBARS-Assay ist nur als teures Kit (über 400 US-Dollar) zu finden, in dem die Anleitung keine detaillierten Informationen über die meisten Konzentrationen der verwendeten Reagenzien liefert. Darüber hinaus können die bereitgestellten Reagenzien nur für ein Experiment verwendet werden, da nur eine kolorimetrische Standardkurve pro Kit hergestellt werden kann. Dies kann für Forscher problematisch sein, die beabsichtigen, den Oxidationsgrad innerhalb weniger Proben zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen, da die gleiche Standardkurve nicht mehrmals verwendet werden kann. Daher müssen mehrere Kits für mehrere Experimente gekauft werden. Derzeit gibt es kein detailliertes Protokoll für die Durchführung eines TBARS-Assays, es sei denn, es wird ein teures Kit gekauft. Einige Forscher haben in der Vergangenheit vage beschrieben, wie man einen TBARS-Assay durchführt21,22, aber weder ein vollständig detailliertes Protokoll noch ein umfassendes Video darüber, wie man den TBARS-Assay ohne ein teures Kit durchführt, ist in der Literatur verfügbar.

Hier berichten wir über eine detaillierte, analytisch validierte Methodik zur Durchführung eines TBARS-Assays auf einfache, reproduzierbare und kostengünstige Weise. Veränderungen in der Lipidperoxidation von humanem Serum, HepG2-Lysaten und Lipoproteinen niedriger Dichte bei der Behandlung mit Cu(II)-Ionen werden als illustrative Anwendungen für den TBARS-Assay nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser TBARS-Assay im Alltag konsistent und reproduzierbar ist.

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Protocol

Menschliche Serumproben wurden von einwilligenden Freiwilligen unter IRB-Zulassung und gemäß den in der Deklaration von Helsinki zum Ausdruck gebrachten Prinzipien erhalten. Die Proben wurden vor dem Transfer in das Analyselabor codiert und de-identifiziert.

1. Probenvorbereitung

  1. HepG2 Zelllysate
    1. Entkernen Sie etwa 10 x 106 HepG2-Zellen pro Kolben in 16 T75-Kolben mit 14 ml EMEM-Medien, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), und züchten Sie Zellen für 2 Tage.
    2. RIPA-Puffer vorbereiten: in einem 50-ml-Röhrchen 1,5 ml 5 M NaCl, 2,5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL NP-40-Reagenz hinzufügen und dann das endige Volumen mit DI-Wasser auf 50 ml bringen.
    3. Lysepuffer vorbereiten: Aliquot 20 ml RIPA-Puffer in ein 50 ml Röhrchen und 200 μL einer 100-fachen Proteaseinhibitorlösung hinzufügen, um den Protein- und Lipidabbau zu hemmen. Bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Der Lysepuffer ist mit TBARS-Reagenzien kompatibel und stört die Absorption bei 532 nm nicht. Wenn Sie planen, einen anderen Lysepuffer zu verwenden oder zusätzliche Inhaltsstoffe zum Lysepuffer hinzuzufügen, müssen vorläufige Validierungsstudien durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob die Lysepufferkomponenten mit dem TBARS-Assay kompatibel sind.
    4. Entfernen Sie Medien mit 10% FBS und waschzellen 2x mit 5 ml kaltem, sterilem 1x PBS.
    5. Geben Sie 1 ml Lysepuffer in die T75-Kolben, die die Zellen enthalten, und inkubieren Sie sie für 10 min bei Raumtemperatur (RT) mit konstanter Verwirbelung, um sicherzustellen, dass der Puffer gut verteilt ist.
    6. Sammeln Sie Lysate in entsprechend gekennzeichneten 2 ml Polypropylenröhrchen mit Schnappverschluss und inkubieren Sie 10 minuten lang auf Eis.
    7. Drehen Sie die Lysate bei 5.000 x g für 10 min bei RT, um Zelltrümmer zu sammeln, und aspirieren Sie Überstände in einem einzigen 15-ml-Rohr.
    8. Zelllysat-Überstand mit einem Speed Vac bei 50 °C und 3 mbar vierfach konzentrieren und Aliquots von je 94 μL zu 2 mL Snap-Cap-Polypropylenrohren herstellen. Lagern Sie die Proben bei -80 °C, bis sie für die In-vitro-Oxidation und/oder den TBARS-Test verwendet werden.
      HINWEIS: Um eine Konzentration des Zelllysat-Überstands zu vermeiden, können zellen auch mit 3 ml 1x Trypsin abgelöst, mit 6 ml Medien neutralisiert und 2x mit 5 ml kaltem PBS gewaschen werden. Zellpellets können dann in 250 μL Lysepuffer rekonstituiert werden, und die Schritte 1.1.6 und 1.1.7 können dann durchgeführt werden.
    9. Bereiten Sie eine 35 mM CuCl2-Stammlösung in Essigsäure (pH = 4) vor.
      1. Essigsäurelösung herstellen (pH = 4): Verdünnen Sie 1 μL Eisessig in 100 ml DI-Wasser (pH sollte ungefähr 4 betragen, aber bestätigen Sie dies mit einem pH-Meter). Fügen Sie mehr Wasser oder Essigsäure hinzu, um den pH-Wert auf 4 einzustellen.
      2. Etwa 0,1936 g Kupfer-II-Chlorid eingewichten und in 10 mL der Essigsäurelösung (pH = 4) zu einem 144 mM CuCl2-Stamm auflösen. Aliquot 490 μL aus dieser Lösung und fügen Sie zu 1.510 μL Essigsäure (pH = 4) hinzu, um eine 35 mM CuCl2-Lösung herzustellen.
    10. Aliquot 6 μL aus der 35 mM CuCl2-Stammlösung und geben Sie es zu sechs Proben, die 94 μL Zelllysat enthalten, um eine endgültige CuCl2-Konzentration von etwa 2 mM zu erhalten. 6 μL einer Essigsäurelösung (pH = 4), die kein CuCl2 enthält, werden sechs Proben mit 94 μL Zelllysaten als Kontrollen zugesetzt. Das endgültige Volumen des Zelllysats sollte 100 μL betragen, was für den TBARS-Assay verwendet wird.
      HINWEIS: Die Herstellung der 35 mM CuCl2-Stammlösung in Essigsäure (pH = 4) ist notwendig, um die Ausfällung von Kupferhydroxid zu verhindern.
    11. Inkubieren Sie Proben in einem Ofen bei 37 °C für 24 h und führen Sie einen TBARS-Assay an jeder Probe mit einem Endvolumen von 100 μL durch.
    12. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.9 und 1.1.11 2x an getrennten Tagen, um die Reproduzierbarkeit des TBARS-Assays für HepG2-Zelllysate zu überprüfen.
  2. Lipoproteine niedriger Dichte
    HINWEIS: Typischerweise enthält vorgereinigtes Low Density Lipoprotein (LDL) eine gewisse Menge an EDTA. Die hier verwendeten LDL-Proben enthalten 0,01% EDTA. EDTA kann die in vitro Cu(II)-vermittelte Oxidation von LDL hemmen. Daher kann es notwendig sein, EDTA vor Experimenten oder Analysen aus LDL-Proben zu entfernen. In den Schritten 1.2.1 bis 1.2.5 wird dieser Vorgang beschrieben.
    VORSICHT: Natriumhydroxid ist ätzend und verursacht Reizungen in Haut und Augen. Verwenden Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung.
    1. Aliquot 24 μL aus einem 5,51 mg/ml LDL-Stamm (Proteinkonzentration bestimmt durch modifizierte Lowry-Methode unter Verwendung von BSA als Standard) in entsprechend gekennzeichnete 1 mL Snap-Cap-Polypropylenröhrchen. Stellen Sie so viele Aliquots wie nötig her und lagern Sie sie bei 4 °C bis zur Verwendung in der Oxidation und/oder TBARS-Assay.
    2. Bereiten Sie einen 10 mM HEPES-Puffer in 0,15 M NaCl, eingestellt auf pH = 7, mit NaOH-Perlen vor: Lösen Sie 4,39 g NaCl in 0,49 l Wasser auf und fügen Sie dann 1,19 g HEPES hinzu. Mit einem Rührstab gut auflösen. Fügen Sie Natriumhydroxidperlen hinzu, bis der pH-Wert 7 beträgt. Mit Wasser auf 0,5 l verdünnen. Puffer bei 4 °C lagern und innerhalb von 3 Monaten verwenden.
    3. 476 μL des 10 mM HEPES-Puffers in 0,15 M NaCl (pH = 7) zu den aliquotedierten LDL-Proben geben, um das Endvolumen auf 500 μL zu bringen. Geben Sie eine verdünnte LDL-Probe in eine 0,5 ml Zentrifugalspinfiltervorrichtung mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 100 K.
    4. Spinnproben bei 14.000 x g für 10 min bei RT, wobei ein endgültiges Retentatvolumen von etwa 30 μL verbleibt. Rekonstituieren Sie Proben in 480 μL des 10 mM HEPES-Puffers in 0,15 M NaCl (pH = 7) und drehen Sie sich erneut bei 14.000 x g für 10 min bei RT. Führen Sie diesen Schritt 2x für insgesamt vier Spin-Throughs durch.
    5. Legen Sie die Filtervorrichtung verkehrt herum in ein neues 2-ml-Polypropylenröhrchen mit Schnappverschluss und zentrifugieren Sie bei 1000 x g für 2 min, um die LDL-Probe zu sammeln (Endvolumen = ca. 30 μL).
    6. Aliquote Probe in entsprechend markiertes 1 ml Röhrchen und 20 μL Wasser zu jeder Probe geben, um ein Endvolumen von 50 μL zu erreichen.
    7. Herstellung von 200 μM CuCl2 Stammlösung in Essigsäure (pH = 4)
      1. Essigsäurelösung (pH = 4) herstellen: siehe Schritt 1.1.9.1.
      2. Man bereitet eine 144 mM CuCl2 Stammlösung vor (siehe Schritt 1.1.9.2), dann aliquot 5,5 μL aus dem 144 mM CuCl2 Stamm und löst sich in einem Endvolumen von 4 mL Essigsäure (pH = 4) auf, um die 200 μM Lösung herzustellen.
    8. Aliquot 2,7 μL aus der 200 μM CuCl2 Stammlösung und geben Sie es zu sechs Proben mit 50 μL LDL, um eine endgültige CuCl2-Konzentration von ~ 10 μM zu erreichen. 2,7 μL aus einer Essigsäurelösung (pH = 4), die kein CuCl2 enthält, werden zu sechs Proben mit 50 μL LDL für die Kontrollen gegeben.
    9. Inkubieren Sie LDL-Proben für 2 h in einem Ofen bei 37 °C. Nach 2 h das Endvolumen auf 100 μL für jede Probe mit 10 mM HEPES-Puffer in 0,15 M NaCl (pH = 7) bringen. Führen Sie sofort einen TBARS-Assay durch.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.3–1.2.9 2x an zwei verschiedenen Tagen, um die Reproduktion des TBARS-Assays zu testen.
  3. Menschliches Serum
    1. Machen Sie aus einer menschlichen Serumprobe Aliquots von je 94 μL in 2 mL Snap-Cap Polypropylenröhrchen und lagern Sie die Proben bei -80 °C.
    2. Eine 35 mM CuCl2-Stammlösung in Essigsäure (pH = 4) herstellen: siehe Schritt 1.1.9.
    3. Aliquot 6 μL aus der CuCl2-Stammlösung und geben Sie es zu sechs Proben, die 94 μL menschliches Serum enthalten, um eine endgültige CuCl2-Konzentration von etwa 2 mM zu erhalten. Fügen Sie 6 μL einer Essigsäurelösung (pH = 4), die kein CuCl2 enthält, zu sechs Proben mit 94 μL humanem Serum hinzu, um sie als Kontrollen zu verwenden.
    4. Menschliche Serumproben 24 h lang in einem Ofen bei 37 °C inkubieren und den Oxidationsgrad mit TBARS-Assay bestimmen (Abschnitt 4).
    5. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2–1.3.4 2x an zwei verschiedenen Tagen, um die Reproduzierbarkeit des TBARS-Assays zu bestimmen.

2. Vorbereitung des Reagenzes

VORSICHT: Thiobarbitursäure verursacht Haut- und Augenreizungen und kann durch Einatmen oder Hautabsorption schädlich sein. Essigsäure kann innere Organe schädigen, wenn sie eingeatmet wird. Bereiten Sie alle Säurelösungen in einem Abzug vor.

  1. Herstellung von 8,1% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung
    1. 32,4 g SDS auswiegen und in 350 ml DI-Wasser in einem Becherglas auflösen. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um SDS sanft aufzulösen und Blasen zu vermeiden. Bringen Sie das Endvolumen mit DI-Wasser auf 400 ml und lagern Sie die SDS-Lösung bei RT.
      HINWEIS: Hier wird überschüssige 8,1% SDS-Lösung vorbereitet; Für 96 Proben werden jedoch nur etwa 20 ml der 8,1% igen SDS-Lösung benötigt. Bereiten Sie diese Lösung entsprechend der Anzahl der analysierten Proben vor.
  2. Herstellung von 3,5 M Natriumacetatpuffer (pH = 4)
    1. Verdünnen Sie 100 ml Eisessig in 350 mL DI-Wasser in einem Becherglas. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um es vorsichtig aufzulösen.
    2. Bereiten Sie eine 6,5 M NaOH-Lösung unter Verwendung von Natriumhydroxidperlen in Wasser vor. 13 g NaOH-Perlen in 40 mL DI-Wasser lösen und mit DI-Wasser auf ein Endvolumen von 50 mL bringen.
    3. Langsam etwa 46 ml der 6,5 M NaOH-Lösung in die Essigsäurelösung geben, während Sie mit dem Rührstab mischen (dies sollte den pH-Wert auf 4 erhöhen, aber durch langsames Hinzufügen der NaOH-Lösung während der Messung mit einem pH-Meter bestätigen).
    4. Bringen Sie das Endvolumen mit DI-Wasser auf 500 ml und lagern Sie den Natriumacetatpuffer bei RT.
  3. Herstellung von 0,8% iger wässriger Lösung von Thiobarbitursäure (eingestellt auf pH = 4)
    HINWEIS: In diesem Schritt wird die Herstellung von Thiobarbitursäure für große Mengen optimiert, da eine große Anzahl von Proben analysiert wird (108 Proben, ohne die Standards). Bereiten Sie diese Lösung in Abhängigkeit von der Anzahl der für die Analyse geplanten Proben vor.
    1. Bereiten Sie eine 5 M Natriumhydroxidlösung mit Natriumhydroxidperlen und Wasser vor: Lösen Sie 4 g Natriumhydroxidperlen in einem Endvolumen von 20 ml Wasser auf. In einem Kunststoffbehälter aufbewahren. Diese Lösung sollte für jede Charge frisch zubereitet werden.
    2. Gewicht 4 g Thiobarbitursäure und 450 ml DI-Wasser hinzufügen. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um es vorsichtig aufzulösen.
      HINWEIS: Diese Lösung wird schließlich auf ein Gesamtvolumen von 500 ml gebracht.
    3. Beim Auflösen der Thiobarbitursäure mit einem Rührstab (langsam und tropfenweise) etwa 3 ml der 5 M NaOH-Lösung in 100 μL-Schritten zugeben. Nach Zugabe der NaOH-Lösung beginnen sich die Thiobarbitursäurepartikel aufzulösen.
    4. Wenn sich die Thiobarbitursäurepartikel noch nicht vollständig gelöst haben, fügen Sie mehr von der 5 M NaOH-Lösung in 100 μL-Schritten hinzu, bis alle Thiobarbitursäurepartikel vollständig gelöst sind. Für dieses spezielle Lösungsvolumen werden insgesamt 4 ml der 5 M NaOH-Lösung zugegeben, um die Thiobarbitursäurepartikel vollständig aufzulösen.
      HINWEIS: Bei dieser Konzentration löst sich Thiobarbitursäure nicht vollständig auf, es sei denn, der pH-Wert beträgt fast 4.
    5. Hören Sie auf, NaOH hinzuzufügen, nachdem sich die gesamte Thiobarbitursäure vollständig aufgelöst hat. Vermeiden Sie es, einen pH-Wert von 4 zu überschreiten. Der endgültige pH-Wert kann überprüft werden, indem 1 μL aus der mischenden Thiobarbitursäurelösung entnommen und auf pH-Papier gegeben wird.
    6. Bringen Sie das Endvolumen mit DI-Wasser auf 500 ml und lagern Sie wässrige 0,8% ige Thiobarbitursäurelösung bei RT.

3. Malondialdehyd-Bis(dimethylacetal)-Standardprobenvorbereitung

HINWEIS: Malondialdehyd (MDA) ist instabil und nicht im Handel erhältlich. Es gibt jedoch verschiedene chemische Formen von MDA, die kommerziell erhältlich sind, wie MDA-Tetrabutylammoniumsalz, MDA-Bis (Dimethylacetal) und MDA-Bis (Diethylacetal). Von diesen drei chemischen Formen wird hier MDA-Bis (Dimethylacetal) verwendet, da die Mehrheit der Studien denselben Standard verwendet21,22. Wenn Sie sich für die Verwendung der beiden anderen chemischen Formen von MDA entscheiden, sollte eine vorherige Validierung ihrer Eignung durchgeführt werden.

  1. Bereiten Sie eine 550 μM MDA-Bis (Dimethylacetal) Stammlösung vor, indem Sie 92 μL reines MDA-Bis (Dimethylacetal) in 1 L DI-Wasser verdünnen. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um die Lösung 10 Minuten lang gründlich zu mischen. Die Lösung bei 4 °C lagern und innerhalb von 1 Monat verwenden.
  2. Bereiten Sie ein 200 μM MDA-Bis (Dimethylacetal) vor, indem Sie 726 μL aus dem 550 μM MDA-Bis (Dimethylacetal) -Stamm in 1274 μL DI-Wasser verdünnen. Diese 200 μM MDA-Bis(dimethylacetal)-Lösung sollte bei jeder TBARS-Untersuchung frisch zubereitet werden.
  3. Standardkurvenvorbereitung: Nehmen Sie acht 2-ml-Polypropylenröhrchen mit Schnappverschluss und beschriften Sie sie mit den Buchstaben A bis H. Fügen Sie MDA-Bis (Dimethylacetal) aus dem 200-μM-Vorrat hinzu und verdünnen Sie es wie in Tabelle 1 beschrieben in Wasser.
  4. Nehmen Sie acht Glasröhren (13 mm x 100 mm) und beschriften Sie sie A–H, dann fügen Sie 100 μL Standard zu den entsprechenden Rohren hinzu. Führen Sie sechs Replikate für den Blankostandard (Probe A) durch, um die Nachweisgrenzen des TBARS-Assays zu berechnen.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier für nicht mehr als 1 h pausiert werden.

4. TBARS-Assay

HINWEIS: Sobald der TBARS-Assay gestartet ist, sollte er ohne Unterbrechung abgeschlossen sein.

  1. Nehmen Sie so viele Glasröhrchen wie nötig für die Anzahl der zu analysierenden Proben und beschriften Sie sie mit den Namen der Proben. Dann fügen Sie 100 μL jeder vorbereiteten Probe (wie oben beschrieben) zu jedem Glasröhrchen hinzu.
  2. Geben Sie 200 μL 8,1% SDS zu jeder Probe und jedem Standard hinzu und schwenken Sie das Glasröhrchen vorsichtig in einer kreisförmigen Bewegung, um die Probe zu mischen.
  3. Jeder Probe und jedem Standard werden 1,5 ml des 3,5 M Natriumacetatpuffers (pH = 4) zugesetzt.
  4. Jeder Probe und jedem Standard werden 1,5 ml der wässrigen 0,8%igen Thiobarbitursäurelösung (pH = 4) zugegeben.
  5. Bringen Sie das Endvolumen für jede Probe und jeden Standard auf 4 ml, indem Sie 700 μL DI-Wasser hinzufügen.
  6. Schließen Sie jedes Glasrohr fest ab und inkubieren Sie es in einem auf 95 °C eingestellten Heizblock für 1 h. Decken Sie die Glasröhren mit Aluminiumfolie ab, um Kondensation an den Oberseiten der Rohre zu vermeiden.
  7. Entfernen Sie die Glasröhren aus dem Heizblock und inkubieren Sie 30 min auf Eis.
  8. Zentrifugenproben und Standards bei 1500 x g für 10 min bei 4 °C. Bewahren Sie nach der Zentrifugation die Glasröhrchen mit den Proben und Standards bei RT auf.
    HINWEIS: Wenn Sie die Proben auf Eis oder bei 4 °C aufbewahren, wird die gesamte Probe oder Norm ausgefällt.
  9. Unmittelbar nach der Zentrifugation 150 μL Überstand aus jedem Rohr aliquotieren und in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte geben.
  10. Entfernen Sie alle Blasen aus jeder Vertiefung mit einer Pipettenspitze.
    HINWEIS: Das Vorhandensein von Blasen führt zu inkonsistenten Absorptionswerten, was zu einer hohen Assay-Ungenauigkeit führt.
  11. Ablesen der Absorptionsraten bei 532 nm. Subtrahieren Sie den durchschnittlichen Absorptionswert der leeren Proben von allen anderen Absorptionswerten.
  12. Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie die blank-subtrahierten Absorptionswerte bei 532 nm im Vergleich zur bekannten Konzentration jedes Standards darstellen. Passen Sie die Datenpunkte mithilfe der linearen Regression an. Berechnen Sie unbekannte Stichprobenkonzentrationen unter Verwendung der Gleichung der linearen Regressionslinie aus der Standardkurve.

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Representative Results

Unter sauren Bedingungen (pH = 4) und bei 95 °C ergibt Malondialdehyd (MDA) bis(dimethyl acetal) MDA23. MDA und eng verwandte chemische Kongenere reagieren mit zwei Molekülen Thiobarbitursäure (TBA), um Verbindungen zu produzieren, die als Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) bezeichnet werden, die eine rot-rosa Farbe ergeben und eine Absorption λmax bei 532 nm aufweisen (Abbildung 1, Abbildung 2). Unter Verwendung von MDA-Bis (Dimethylacetal) als Standard wurden Standardkurven generiert (Abbildung 3, Tabelle 1), um die Nachweisgrenzen und die Sensitivität des Assays sowie den Oxidationsgrad in drei verschiedenen biologischen Proben zu bestimmen. Insgesamt wurden neun TBARS-Assays durchgeführt, um den Oxidationsgrad in den drei verschiedenen Proben an verschiedenen Tagen zu bestimmen. So wurden insgesamt neun Standardkurven erzeugt, wie in Abbildung 3 dargestellt. Das Verfahren der kleinsten Quadrate24 wurde verwendet, um die Standardabweichungen der Steigung und des y-Schnittpunkts zu bestimmen, die 8,67 x 10-6 bzw. 5,66 x 10-4 betrugen.

Die Nachweisgrenzen des TBARS-Assays wurden nach Standardanalyseverfahren25 bestimmt, indem die Absorptionsraten der Blindproben (sechs experimentelle Replikate mit zwei technischen Replikaten pro experimentellem Replikat) an drei verschiedenen Tagen gemessen wurden. Das minimal unterscheidbare analytische Signal (Sm) wurde durch Summieren des Mittelwerts des Blanksignals (S̄bl) plus eines Vielfachen k der Standardabweichung des Rohlings (ksbl) bestimmt, wobei k = 3 ist. Das heißt, Sm = S̄bl+ ksbl. Unter Verwendung von Sm und der Steigung der Standardkurve (m) wurde die Nachweisgrenze (cm) als cm = (Sm - S̄bl)/m berechnet. Die resultierenden Daten der Blindproben an drei verschiedenen Tagen zeigen, dass die Mindestkonzentration der TBARS-Substanz, die benötigt wird, um ein nachweisbares nicht rauschendes Absorptionssignal zu liefern, 1,1 μM beträgt (Tabelle 2). Die Sensitivität des TBARS-Assays beträgt etwa 0,00160 Absorptionseinheiten/μM, was der Fähigkeit des Assays entspricht, Unterschiede in der Analytkonzentration zu unterscheiden (Tabelle 2).

Um die Anwendbarkeit des TBARS-Assays beim Nachweis von Veränderungen der Lipidperoxidation in verschiedenen biologischen Matrices zu veranschaulichen, wurde CuCl2 verwendet, um die In-vitro-Oxidation von menschlichem Serum, HepG2-Zelllysaten und Lipoproteinen niedriger Dichte zu induzieren. Diese hier verwendeten biologischen Proben sind Prototypen biologischer Matrizen. Zum Beispiel ist es aufgrund der hier vorgestellten Ergebnisse für HepG2-Zelllysat vernünftig zu erwarten, dass dieser Assay mit anderen Arten von Zelllysat funktionieren wird; zu diesem Zweck müsste es jedoch analytisch validiert werden. Auch von den drei hier verwendeten biologischen Matrizen ist es üblich, dass bestimmte Arten von Proben niedrige endogene Konzentrationen von TBARS aufweisen. Zum Beispiel lagen TBARS für HepG2-Zelllysate, die nicht mit CuCl2 behandelt wurden, knapp über der Nachweisgrenze des Assays (etwa 2 μM; Abbildung 4). Wie bei niedrigen Signal-Rausch-Verhältnissen zu erwarten, sind die Standardabweichung und der Variationskoeffizient für diese spezielle Probe relativ hoch (Tabelle 3). Wenn das Signal jedoch infolge der Cu(II)-vermittelten Oxidation zunimmt, wird der Variationskoeffizient niedriger. Im Allgemeinen verbessert sich die Reproduzierbarkeit des Assays, wenn die Absorption über die Nachweisgrenze hinaus zunimmt (Tabelle 3).

Für die Zwecke dieses Protokolls bestand kein Wunsch, Antioxidantien zu verwenden, um die in vitro Cu(II)-vermittelte Oxidation biologischer Proben zu maskieren. Kommerziell hergestelltes Low Density Lipoprotein (LDL) kann 0,01% EDTA enthalten. EDTA verhindert die Cu(II)-vermittelte Oxidation von LDL, aber nicht unbedingt andere metallvermittelte Oxidationsreaktionen26,27. Ein TBARS-Assay wurde an LDL-Proben durchgeführt, die EDTA enthielten, und die TBARS-Spiegel änderten sich nicht zwischen den mit Cu(II) behandelten und unbehandelten LDL-Proben (Abbildung 5A). Nachdem EDTA jedoch durch Spinfiltration entfernt wurde (siehe Schritt 1.2.3–1.2.5), wurde LDL einer Cu(II)-vermittelten Oxidation unterzogen, wie im TBARS-Assay nachgewiesen (Abbildung 5B).

Der normale Bereich der Lipidperoxidationsprodukte im menschlichen Serum von gesunden Spendern, ausgedrückt in MDA, liegt zwischen 1,80 und 3,94 μM28. Um den Dynamikbereich des TBARS-Assays in humanem Serum zu veranschaulichen, wurde den Proben eine Konzentration von 2 mM Cu(II)-Ionen zugesetzt, gefolgt von einer Inkubation für 24 h bei 37 °C. Dies führte zu einem 6-7-fachen Anstieg der TBARS (Abbildung 6).

Figure 1
Abbildung 1: Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen Assay schematisch.
Einhundert Mikroliter Probe oder Standard werden in ein 13 mm x 100 mm großes Glasröhrchen gegeben, gefolgt von Zugabe von Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS) Reagenzien. Nach der Inkubation bei 95 °C für 1 h werden Proben und Standards für 30 min in Eis inkubiert und dann bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Einhundertfünfzig Mikroliter Proben- oder Standardüberstand werden auf eine 96-Well-Platte geladen, und die Absorption wird bei 532 nm gemessen. Unbekannte Probenkonzentration wird unter Verwendung der Gleichung der Standardkurve berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Archetyp Thiobarbitursäure reaktive Substanzen Reaktion.
Malondialdehyd bis(dimethyl acetal) ergibt Malondialdehyd unter säurekatalysierter Hydrolyse1. Freigesetztes Malondialdehyd (MDA) reagiert dann mit zwei Molekülen 2-Thiobarbitursäure (TBA) (pH = 4 und 95 °C) zu MDA-TBA2-Addukten, die eine rot-rosa Farbe ergeben und spektralphotometrisch bei 532 nm gemessen werden können. Da neben MDA auch andere Moleküle, die aus oxidierten Lipiden gewonnen werden, mit TBA reagieren können, wird die Absorptionsmessung bei 532 nm einfach als Messung von Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen oder TBARS bezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Malondialdehyd-Bis(dimethylacetal)-kolorimetrische Standardkurven.
Abbildung zeigt neun Standardkurven, wie sie an verschiedenen Tagen erstellt wurden. Einige Punkte überschneiden sich und können nicht voneinander unterschieden werden. Malondialdehyd-bis(dimethylacetal) wurde zu Kalibratorproben bei 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 und 160 μM angereichert (wie in Tabelle 1 gezeigt; n = 1 pro Konzentrationspunkt und Tag). Die Absorption wurde bei 532 nm gemessen, wobei die durchschnittliche Absorption der Blindproben von allen Messungen in dieser Charge, einschließlich unbekannter Proben, subtrahiert wurde. Jeden Tag wurde die Gleichung, die durch lineare Regression der kleinsten Quadrate erzeugt wurde, verwendet, um TBARS in biologischen Proben zu bestimmen. Für alle neun Standardkurven zusammen betrug die Standardabweichung der Steigung 8,67 x 10-6 und die Standardabweichung des y-Abschnitts 5,66 x 10-4. Standardabweichungen der Steigung und des y-Schnittpunkts wurden nach dem Verfahren der kleinsten Quadrate berechnet24. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Oxidation in HepG2-Lysaten, nachgewiesen durch TBARS.
Sechs HepG2-Zell-Lysat-Proben wurden mit 2 mM CuCl2 [HepG2-Zelllysat + 2 mM Cu(II)] inkubiert und sechs Proben wurden in einer Lösung ohne CuCl2 (HepG2-Zelllysat) für 24 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der TBARS-Assay an den 12 Proben durchgeführt. Dieser Vorgang wurde 2x für insgesamt drei verschiedene Tage wiederholt. Fehlerbalken stellen SD dar. Sternchen zeigt statistisch signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und Cu(II)-behandelten Lysaten an (p < 0,001). Die statistische Signifikanz wurde mit einem Mann Whitney U-Test in GraphPad bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Oxidation im Low Density Lipoprotein, nachgewiesen durch TBARS.
(A) TBARS-Assay, durchgeführt in LDL-Proben, die 0,01% EDTA enthalten. Sechs LDL-Proben wurden mit 10 μM CuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)] inkubiert, und sechs Proben wurden mit einer Kontrolllösung ohne CuCl2-Zusatz (Native LDL) für 2 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde ein TBARS-Assay an den 12 Proben durchgeführt. "ns" stellt keine statistische Signifikanz dar. (B) LDL wurde mit einem Zentrifugalspinfiltergerät gefiltert, um EDTA zu entfernen. Dann wurde die Inkubation mit und ohne Zugabe von Cu(II) erneut wie für (A) beschrieben durchgeführt. Der TBARS-Assay wurde unmittelbar danach durchgeführt. Derselbe Vorgang wurde 2x für insgesamt 3 Tage wiederholt. Fehlerbalken stellen SD dar. Sternchen zeigt statistisch signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und Cu(II)-behandelten LDL-Proben an (p < 0,001). Die statistische Signifikanz wurde mit dem Mann Whitney U-Test in GraphPad bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Lipidperoxidation in menschlichen Serumproben, nachgewiesen durch TBARS.
Sechs humane Serumproben wurden mit 2 mM CuCl2 [Serum + 2 mM Cu(II)] inkubiert, und sechs Proben wurden mit einer Lösung inkubiert, die kein CuCl2 (normales Serum) für 24 h bei 37 °C enthielt. Nach der Inkubation wurde der TBARS-Assay an den 12 Proben durchgeführt. Dieser Vorgang wurde an zwei weiteren Tagen wiederholt. Fehlerbalken stellen SD dar. Sternchen zeigt statistisch signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und Cu(II)-behandelten Serumproben an (p < 0,001). Die statistische Signifikanz wurde mit dem Mann Whitney U-Test in GraphPad bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Glasröhre 200 μM MDA Bis (Dimethylacetal) (μL) Wasser (μL) MDA bis (Dimethylacetal) Endkonzentration (μM)
Aa 0 1000 0
B 12.5 987.5 2.5
C 25 975 5
D 50 950 10
E 100 900 20
F 200 800 40
G 400 600 80
H 800 200 160

Tabelle 1: Malondialdehyd-Bis(dimethylacetal)-Standardprobenvorbereitung. Aus den frisch zubereiteten 200 μM Malondialdehyd bis(dimethyl acetal) aliquotieren die vorgeschlagenen Volumina, um die Endkonzentration für die Standardkurve zu erreichen. Es wird empfohlen, mindestens sechs Wiederholungen der Blindprobe (A) pro Tag durchzuführen, um die Nachweisgrenzen der Methode zu bestimmen.

Tag Absorptiona Sblb Smc Empfindlichkeit (Absorptionseinheiten/μM)d cm (μM)e
1 (n = 6) 0.0412 0.000612 0.0430 0.00160 1.14
2 (n = 6) 0.0415 0.000632 0.0433 0.00160 1.18
3 (n = 6) 0.0413 0.000605 0.0431 0.00160 1.13
Alle drei Tage (n = 18) 0.0413 0.000589 0.0431 0.00160 1.10
ein Absorption der Blindproben an drei verschiedenen Tagen mit 6 Replikaten pro Tag.
bSbl = Standardabweichung der Absorption der Blindproben.
cSm = Minimum distinguishable analytical signal, das durch Summieren des Mittelwerts des Blanksignals (S̄bl) plus eines Vielfachen k der Standardabweichung des Rohlings (ksbl) bestimmt wurde, wobei k = 3 ist. Das heißt; Sm = S̄bl + ksbl.
d Sensitivität des TBARS-Assays, d. h. die Steigung der Standardkurve.
ecm = Nachweisgrenzen, die als cm = (Sm - S̄bl)⁄m berechnet wurde, wobei m = die Steigung der Standardkurve ist.

Tabelle 2: Nachweisgrenzen des TBARS-Assays.

Lipoprotein niedriger Dichte Menschliches Serum HepG2 Zelllysat
Tag % CV Tag % CV Tag % CV
1 (n = 6) 5.6 1 (n = 6) 7.9 1 (n = 6) 12.6
2 (n = 6) 5.4 2 (n = 6) 7.2 2 (n = 6) 15.8
3 (n = 6) 3.9 3 (n = 6) 7.0 3 (n = 6) 17.7
Alle drei Tage (n = 18)a 7.4 Alle drei Tage (n = 18) 9.8 Alle drei Tage (n = 18) 15,5 Mrd.
Mit 10 μM CuCl2 Mit 2 mM CuCl2 Mit 2 mM CuCl2
1 (n = 6) 4.5 1 (n = 6) 6.0 1 (n = 6) 5.8
2 (n = 6) 6.5 2 (n = 6) 4.3 2 (n = 6) 6.0
3 (n = 6) 6.7 3 (n = 6) 6.2 3 (n = 6) 8.0
Alle drei Tage (n = 18) 6.1 Alle drei Tage (n = 18) 5.6 Alle drei Tage (n = 18) 7.3
ein Die Interday-Genauigkeit wurde berechnet, indem daten aus allen drei Tagen gepoolt wurden.
b) Die Präzision war begrenzt, da die Ergebnisse in der Nähe der Assay-LOD lagen.

Tabelle 3: Analytische Reproduzierbarkeit von TBARS in drei verschiedenen biologischen Proben.

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Discussion

Trotz seiner Einschränkungen1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 und mangelnder Eignung für Vergleiche zwischen Laboratorien ist der TBARS-Assay einer der ältesten29,30 aber die am weitesten verbreiteten Assays zur Messung von oxidativem Stress in biologischen Proben. Der TBARS-Assay ist eine einfache Methode, die nur etwa 2 h in Anspruch nimmt, nachdem alle erforderlichen Reagenzien hergestellt wurden. Hier haben wir detailliert beschrieben, wie dieser Assay, einschließlich der Standardkurve, viele Male auf wirtschaftliche Weise durchgeführt werden kann (ca. 3,50 USD für 96 Proben), ohne für jede Probencharge ein teures Kit kaufen zu müssen.

Alle Schritte des Assays sind kritisch, aber es gibt einige Schritte, die zusätzliche Aufmerksamkeit erfordern. Zum Beispiel sollte der pH-Wert der Thiobarbitursäure nicht höher als 4 sein. Bei Zugabe der Natronlauge zur Thiobarbitursäure sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, und es ist zu vermeiden, einen pH-Wert von mehr als 4 zu erreichen. Für die Reaktion zwischen MDA und TBA ist eine saure Umgebung erforderlich, und der MDA-Standard wird durch säurekatalysierte Hydrolyse aus MDA-Bis (Dimethylacetal) freigesetzt. Daher kann ein hoher pH-Wert zu unvorhersehbaren und sehr variablen Ergebnissen führen31.

Auch wenn dies für einige Leser offensichtlich sein mag, ist es auch wichtig, Blasen in der 96-Well-Platte zu entfernen, bevor die Absorption gemessen wird. Das Vorhandensein von Blasen führt zu hohen Absorptionswerten und Unterschieden zwischen den Replikaten, was zu einem hohen Prozentsatz an Lebensläufen führt. Darüber hinaus sollten die Proben nach der 1-stündigen Inkubation bei 95 °C nicht länger als 30 min auf Eis inkubiert werden, da dies die gesamte Probe ausfällt und das Sammeln eines niederschlagsfreien Überstands schwierig zu bewerkstelligen ist. Bemerkenswert ist, dass es keine guten Haltepunkte gibt, sobald der TBARS-Assay gestartet wurde. Es sollte abgeschlossen sein, sobald es initiiert wurde. Schließlich gibt es viele mögliche methodische Variationen, die auf diesen Assay angewendet werden können. Das hier beschriebene allgemeine Protokoll kann für spezifische Anwendungen weiter angepasst (und validiert) werden, einschließlich solcher, bei denen die Zugabe von Radikalfängern oder anderen Arten von Antioxidantien vor der Analyse erforderlich ist.

Während der TBARS-Assay beliebt ist, ist es wichtig zu erkennen, dass es sich nicht um einen molekular spezifischen Assay handelt. Zahlreiche chemisch reaktive carbonylhaltige organische Moleküle, einschließlich solcher, die aus anderen oxidierten Biomolekülen als Lipiden gewonnen werden, können mit TBA reagieren und werden daher als TBARS1,32,33,34 gezählt. Darüber hinaus werden die Nachweisgrenzen des absorptionsbasierten TBARS-Assays nicht viel besser als etwa 1,1 μM, wie mit dieser Methode bestimmt. Die Nachweisgrenzen können jedoch durch den Einsatz anderer Nachweismethoden verbessert werden. Zum Beispiel bietet die Spektrofluorometrie mit Anregung bei 520 nm und Emission bei 550 nm eine höhere Empfindlichkeit und bessere Nachweisgrenzen, wie zuvor von Jo und Ahn35 vorgeschlagen. Massenspektrometrie-basierte Methoden können sowohl die Spezifität als auch die Nachweisgrenzen drastisch verbessern. Beispielsweise wurde eine GC-MS/MS mit ECNICI-Methode (Electron-Capture Negative-Ion Chemical Ionization) verwendet, um das Pentafluorbenzylderivat von MDA in menschlichen Serum- und Urinproben nachzuweisen, mit Nachweisgrenzen von 2 x 10-18 mol MDA in Spalte36. Hier verbessert die chromatographische Trennung in Kombination mit der Tandem-Massenspektrometrie auch die molekulare Spezifität des Assays dramatisch.

Dennoch ist wie bei anderen Messungen oxidativer Prozesse in biologischen Proben37,38 die präanalytische Probenhandhabung entscheidend für das Ergebnis von TBARS-Messungen. Beispielsweise führt die Lagerung von Blutplasma bei -20 °C zu einem langsamen, aber dramatischen Anstieg der MDA-Konzentrationen39,40. Daher sollte davon ausgegangen werden, dass die Exposition biologischer Proben gegenüber aufgetauten oder sogar teilweise aufgetauten Bedingungen für eine andere als eine minimale Zeitspanne zu einer künstlichen Erhöhung der TBARS-Spiegel führt. Das bedeutet, dass selbst moderate Variabilitäten in der präanalytischen Handhabung und Lagerung von Bioproben, die mit dem TBARS-Assay verglichen werden sollen, vermieden werden müssen.

Angesichts dieser Vorbehalte im Zusammenhang mit der präanalytischen Variabilität sowie der begrenzten Sensitivität und Spezifität wird empfohlen, den absorptionsbasierten TBARS-Assay nur für die allgemeine Beurteilung innerhalb des Labors oder für Experimente zur Bereichsbestimmung zu verwenden. Zu diesen Anwendungen gehören Studien, in denen die relativen TBARS-Spiegel direkt zwischen einer oder mehreren Gruppen biologisch ähnlicher Proben verglichen werden, die zusammen verarbeitet oder gelagert und durch nur eine einzige Variable getrennt werden, die von den Forschern vollständig kontrolliert wird.

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Disclosures

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die hier berichtete Forschung wurde zum Teil vom National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Award-Nr. R33 CA217702 und das Programm Initiative for Maximizing Student Development (IMSD). Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Ansicht der National Institutes of Health dar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L VWR, PA 101642--262 cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube Corning, NY CLS430897 General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile Thermo Fisher Scientific, MA 280895 To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device Fisher Scientific, NH UFC510024 LDL purification
Caps for glass tubes Thermo Fisher Scientific, MA 14-930-15D for TBARS assay
Copper II Chloride SIGMA, MO 222011-250G to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) VWR, PA 53283-800 for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ATCC, VA HB-8065 HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL eppendorf, NY 22363204 General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Genesee Sceitific, CA 22363352 General material
Fetal Bovine Serum US Source Omega Scientific, CA FB-11 for cell culture
Glacial Acetic Acid SIGMA, MO 27225-1L-R TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific, MA 87786 cell lysis reagent
HEPES SIGMA, MO H3375-250G LDL solvent
HepG2 Cells ATCC, VA HB-8065 Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl) Fisher Scientific, NH A144-212 cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge Thermo Scientific, MA 75002431 General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma Athens Research & Technology, GA 12-16-120412 Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment VWR, PA 58948-025 General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) SIGMA, MO 8207560250 TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer Fisher Scientific, NH 51119200 To measure absorbance
NP-40 EMD Millipore Corp, MA 492016-100ML cell lysis reagent
Sodium Chloride SIGMA, MO S7653-1KG cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA, MO 436143-100G TBARS Reagent
Sodium hydroxide SIGMA, MO 367176-2.5KG TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific, MA SC250EXP For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap USA Scientific, FL 658175 cell culture
Thiobarbituric Acid SIGMA, MO T5500-100G TBARS Reagent
TRIS base Fluka, GA 93362 cell lysis reagent
Trypsin (1x) VWR, PA 16777-166 To detach HepG2 cells

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Chemie Ausgabe 159 Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen TBARS Oxidation Lipidperoxidation Malondialdehyd MDA Thiobarbitursäure TBA oxidativer Stress
Bewertung von oxidativem Stress in biologischen Proben mit dem Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assay
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Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. R. Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay. J. Vis. Exp. (159), e61122, doi:10.3791/61122 (2020).

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