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Chemistry

Thiobarbituric एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थ परख का उपयोग कर जैविक नमूनों में ऑक्सीडेटिव तनाव का मूल्यांकन

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61122
Automatic Translation
1,
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Summary

thiobarbituric एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थों परख का लक्ष्य लिपिड पेरोक्सीडेशन उत्पादों के उत्पादन को मापने के द्वारा जैविक नमूनों में ऑक्सीडेटिव तनाव का आकलन करने के लिए है, मुख्य रूप से malondialdehyde, 532 एनएम पर दृश्य तरंग दैर्ध्य spectrophotometry का उपयोग कर। यहां वर्णित विधि को मानव सीरम, सेल लिसेट और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन पर लागू किया जा सकता है।

Abstract

इसकी सीमित विश्लेषणात्मक विशिष्टता और बीहड़ता के बावजूद, थायोबार्बिट्यूरिक एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थ (TBARS) परख व्यापक रूप से जैविक तरल पदार्थों में लिपिड पेरोक्सीडेशन के एक सामान्य मीट्रिक के रूप में उपयोग किया गया है। इसे अक्सर जैविक नमूने के भीतर ऑक्सीडेटिव तनाव के स्तर का एक अच्छा संकेतक माना जाता है, बशर्ते कि नमूने को ठीक से संभाला और संग्रहीत किया गया हो। परख में लिपिड पेरोक्सीडेशन उत्पादों की प्रतिक्रिया शामिल है, मुख्य रूप से मैलोन्डिएल्डिहाइड (एमडीए), थायोबार्बिटुरिक एसिड (टीबीए) के साथ, जो टीबीएआरएस नामक एमडीए-टीबीए 2 एडक्ट्स के गठन की ओर जाता है। TBARS एक लाल-गुलाबी रंग उत्पन्न करता है जिसे 532 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से मापा जा सकता है। TBARS परख अम्लीय परिस्थितियों (पीएच = 4) और 95 डिग्री सेल्सियस पर के तहत किया जाता है। शुद्ध एमडीए अस्थिर है, लेकिन ये स्थितियां एमडीए बिस (डाइमिथाइल एसिटल) से एमडीए की रिहाई की अनुमति देती हैं, जिसका उपयोग इस विधि में विश्लेषणात्मक मानक के रूप में किया जाता है। TBARS परख एक सीधा तरीका है कि के बारे में 2 ज में पूरा किया जा सकता है. परख अभिकर्मकों की तैयारी यहाँ विस्तार से वर्णित कर रहे हैं. बजट-जागरूक शोधकर्ता इन अभिकर्मकों का उपयोग कम लागत पर कई प्रयोगों के लिए कर सकते हैं, बजाय एक महंगी TBARS परख किट खरीदने के जो केवल एक ही मानक वक्र के निर्माण की अनुमति देता है (और इस प्रकार केवल एक प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)। इस TBARS परख की प्रयोज्यता मानव सीरम, कम घनत्व लिपोप्रोटीन, और सेल lysates में दिखाया गया है. परख सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और 1.1 μM का पता लगाने की सीमा तक पहुँचा जा सकता है. उपयोग और spectrophotometric TBARS परख की व्याख्या के लिए सिफारिशें प्रदान की जाती हैं.

Introduction

लिपिड पेरोक्सीडेशन एक ऐसी प्रक्रिया है जिसमें मुक्त कण, जैसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां और प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियां, लिपिड में कार्बन-कार्बन डबल बॉन्ड पर हमला करती हैं, एक प्रक्रिया जिसमें कार्बन से हाइड्रोजन का अमूर्तन और ऑक्सीजन अणु का सम्मिलन शामिल होता है। यह प्रक्रिया जटिल उत्पादों के मिश्रण की ओर ले जाती है, जिसमें लिपिड पेरोक्सिल रेडिकल्स, और प्राथमिक उत्पादों के रूप में हाइड्रोपेरोक्साइड, साथ ही साथ मालोन्डिएल्डिहाइड (एमडीए) और 4-हाइड्रॉक्सीनोनेल प्रमुख माध्यमिक उत्पादों के रूप में शामिल हैं।

एमडीए व्यापक रूप से थायोबार्बिट्यूरिक एसिड (टीबीए) के साथ इसकी सरल प्रतिक्रिया के कारण लिपिड पेरोक्सीडेशन के मार्कर के रूप में बायोमेडिकल अनुसंधान में उपयोग किया गया है। प्रतिक्रिया एमडीए-टीबीए 2 के गठन की ओर ले जाती है, एक संयुग्मी जो 532 एनएम पर दृश्यमान स्पेक्ट्रम में अवशोषित करता है और एक लाल-गुलाबी रंग 2 का उत्पादन करता है। एमडीए के अलावा लिपिड पेरोक्सीडेशन से प्राप्त अन्य अणु भी टीबीए के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं और 532 एनएम पर प्रकाश को अवशोषित कर सकते हैं, जो मापा जाने वाले समग्र अवशोषण संकेत में योगदान देते हैं। इसी तरह, एमडीए बायोमोलेक्यूल्स के अधिकांश अन्य प्रमुख वर्गों के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है, संभावित रूप से टीबीए 3, 4 के साथ प्रतिक्रिया के लिए अपनी पहुंच को सीमित कर सकता है। जैसे, इस पारंपरिक परख बस "thiobarbituric एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थों" या TBARS5 को मापने के लिए माना जाता है।

जब सही ढंग से लागू किया और व्याख्या की, TBARS परख आम तौर पर एक जैविक नमूना 6 में ऑक्सीडेटिव तनाव के समग्र स्तर का एक अच्छा संकेतक माना जाता है. दुर्भाग्य से, के रूप में Khoubnasabjafari और दूसरों द्वारा प्रलेखित के रूप में, TBARS परख अक्सर आयोजित किया जाता है और उन तरीकों से व्याख्या की जाती है जो संदिग्ध निष्कर्षों की सुविधा प्रदान करते हैं3,4,7,8,9,10,11. इस के लिए कारणों को मुख्य रूप से नमूना से संबंधित पूर्व विश्लेषणात्मक चर और परख बीहड़ता की कमी है कि परख परिणामों में पर्याप्त परिवर्तन के बिना परख प्रोटोकॉल में प्रतीत होता है मामूली भिन्नताओं को प्रतिबंधित करता है में निहित हैं1,7,12,13.

Biospecimen हैंडलिंग और भंडारण से संबंधित preanalytical चर (उदाहरण के लिए, रक्त प्लाज्मा अस्थायी रूप से -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया)14,15 TBARS परख परिणामों पर एक बड़ा प्रभाव पड़ सकता है16,17; इतना है कि TBARS परख परिणामों की तुलना विभिन्न प्रयोगशालाओं में नहीं की जानी चाहिए जब तक कि स्पष्ट interlaboratory विश्लेषणात्मक सत्यापन डेटा द्वारा warranted. यह सिफारिश इस बात के समान है कि पश्चिमी धब्बों का आमतौर पर उपयोग और व्याख्या कैसे की जाती है। बैंड घनत्व की तुलना भीतर-धब्बा और शायद प्रयोगशाला अध्ययनों के भीतर के लिए मान्य है, लेकिन प्रयोगशालाओं के बीच बैंड घनत्व की तुलना आम तौर पर एक अमान्य अभ्यास माना जाता है।

कुछ शोधकर्ताओं ने सुझाव दिया है कि TBARS परख द्वारा मापा गया एमडीए बस एक स्वीकार्य बायोमार्कर 3,9,10,18,19 के लिए आवश्यक विश्लेषणात्मक या नैदानिक मानदंडों को पूरा नहीं करता है। दरअसल, अगर परख 50 साल पहले विकसित नहीं किया गया था, तो यह शायद व्यापक उपयोग और मौन स्वीकार्यता है कि यह आज है प्राप्त नहीं होता. यद्यपि अधिक से अधिक विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता, विशिष्टता, और ऑक्सीडेटिव तनाव का निर्धारण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बीहड़ता के साथ अन्य assays हैं, 532 एनएम पर absorbance के आधार पर TBARS परख लिपिड पेरोक्सीडेशन 20 के निर्धारण के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले assays में से एक है, और इस प्रकार ऑक्सीडेटिव तनाव का आकलन।

TBARS परख केवल एक महंगी किट (400 अमेरिकी डॉलर से अधिक) के रूप में पाया जा सकता है, जिसमें निर्देश उपयोग किए गए अभिकर्मकों की अधिकांश सांद्रता पर विस्तृत जानकारी प्रदान नहीं करते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रदान किए गए अभिकर्मकों का उपयोग केवल एक प्रयोग के लिए किया जा सकता है, क्योंकि प्रति किट केवल एक colorimetric मानक वक्र बनाया जा सकता है। यह उन शोधकर्ताओं के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है जो विभिन्न समय बिंदुओं पर कुछ नमूनों के भीतर ऑक्सीकरण के स्तर को निर्धारित करने का इरादा रखते हैं, क्योंकि एक ही मानक वक्र का उपयोग कई बार नहीं किया जा सकता है। इसलिए, कई प्रयोगों के लिए कई किट खरीदने की आवश्यकता है। वर्तमान में, जब तक एक महंगी किट खरीदा जाता है, वहाँ कैसे एक TBARS परख करने के लिए के लिए उपलब्ध एक विस्तृत प्रोटोकॉल नहीं है. अतीत में कुछ शोधकर्ताओं ने अस्पष्ट रूप से वर्णन किया है कि कैसे एक TBARS assay21,22 प्रदर्शन करने के लिए, लेकिन न तो एक पूरी तरह से विस्तृत प्रोटोकॉल या व्यापक वीडियो कैसे एक महंगी किट के बिना TBARS परख का संचालन करने के लिए साहित्य में उपलब्ध है.

यहाँ हम एक विस्तृत, विश्लेषणात्मक रूप से मान्य उद्देश्य पद्धति के लिए रिपोर्ट कैसे एक सरल, पुन: प्रस्तुत करने योग्य, और सस्ती तरीके से एक TBARS परख प्रदर्शन करने के लिए पर. मानव सीरम के लिपिड पेरोक्सीडेशन में परिवर्तन, HepG2 lysates, और Cu (II) आयनों के साथ उपचार पर कम घनत्व लिपोप्रोटीन TBARS परख के लिए उदाहरण अनुप्रयोगों के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं. परिणामों से पता चलता है कि इस TBARS परख एक दिन के लिए दिन के आधार पर लगातार और पुन: प्रस्तुत करने योग्य है.

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Protocol

मानव सीरम नमूने आईआरबी अनुमोदन के तहत सहमति देने वाले स्वयंसेवकों से और हेलसिंकी की घोषणा में व्यक्त सिद्धांतों के अनुसार प्राप्त किए गए थे। विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला में स्थानांतरित करने से पहले नमूनों को कोडित और डी-पहचाना गया था।

1. नमूना तैयारी

  1. HepG2 सेल lysates
    1. 16 T75 फ्लास्क में प्रति फ्लास्क लगभग 10 x 106 हेपजी 2 कोशिकाओं के बीज 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक ईएमईएम मीडिया के 14 एमएल के साथ और 2 दिनों के लिए कोशिकाओं को विकसित करते हैं।
    2. RIPA बफर तैयार करें: एक 50 mL ट्यूब में, 5 M NaCl के 1.5 mL, 1 M Tris-HCl के 2.5 mL (pH = 7), NP-40 अभिकर्मक के 500 μL जोड़ें, फिर अंतिम आयतन को DI पानी के साथ 50 mL पर लाएं।
    3. लाइसिस बफर तैयार करें: 50 एमएल ट्यूब में आरआईपीए बफर के 20 मिलीलीटर को एलीकोट करें और प्रोटीन और लिपिड गिरावट को रोकने के लिए 100x प्रोटीज इनहिबिटर समाधान के 200 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: Lysis बफ़र TBARS अभिकर्मकों के साथ संगत है और 532 nm पर absorbance के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। यदि एक अलग लाइसिस बफर का उपयोग करने या लाइसिस बफर में अतिरिक्त सामग्री जोड़ने की योजना बना रहे हैं, तो प्रारंभिक सत्यापन अध्ययन यह सत्यापित करने के लिए किया जाना चाहिए कि लाइसिस बफर घटक TBARS परख के साथ संगत हैं।
    4. 10% FBS युक्त मीडिया निकालें और 5 मिलीलीटर ठंड, बाँझ 1x PBS के साथ 2x कोशिकाओं को धोएं।
    5. कोशिकाओं वाले T75 फ्लास्क में lysis बफर के 1 mL जोड़ें और उन्हें कमरे के तापमान (RT) पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि बफर अच्छी तरह से वितरित किया गया है।
    6. उचित रूप से लेबल 2 एमएल स्नैप-कैप पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में लिसेट एकत्र करें और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    7. सेल मलबे को इकट्ठा करने के लिए आरटी में 10 मिनट के लिए 5,000 x g पर lysates स्पिन, और एक एकल 15 मिलीलीटर ट्यूब में aspirate supernatants।
    8. ध्यान केंद्रित सेल lysate supernatant चार गुना 50 डिग्री सेल्सियस और 3 mbar पर एक स्पीड Vac का उपयोग कर और 94 μL के ऐलीकोट प्रत्येक 2 mL स्नैप-कैप polypropylene ट्यूब में बनाने के लिए. स्टोर नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर जब तक वे इन विट्रो ऑक्सीकरण और / या TBARS परख के लिए उपयोग किया जाता है.
      नोट: सेल lysate supernatant को केंद्रित करने से बचने के लिए, कोशिकाओं को 1x ट्रिप्सिन के 3 मिलीलीटर का उपयोग करके भी अलग किया जा सकता है, मीडिया के 6 मिलीलीटर के साथ बेअसर किया जा सकता है, और 5 मिलीलीटर ठंडे पीबीएस के साथ 2x धोया जा सकता है। सेल छर्रों को तब लाइसिस बफर के 250 μL में पुनर्गठित किया जा सकता है, और चरण 1.1.6 और 1.1.7 तब किया जा सकता है।
    9. एसिटिक एसिड (पीएच = 4) में एक 35 mM CuCl2 स्टॉक समाधान तैयार करें।
      1. एसिटिक एसिड समाधान तैयार करें (पीएच = 4): डीआई पानी के 100 मिलीलीटर में ग्लेशियल एसिटिक एसिड के 1 μL को पतला करें (पीएच लगभग 4 होना चाहिए लेकिन पीएच मीटर के साथ इसकी पुष्टि करें)। पीएच को 4 में समायोजित करने के लिए अधिक पानी या एसिटिक एसिड जोड़ें।
      2. कॉपर II क्लोराइड के बारे में 0.1936 ग्राम वजन और एसिटिक एसिड समाधान (पीएच = 4) के 10 मिलीलीटर में घुलने के लिए एक 144 mM CuCl2 स्टॉक बनाने के लिए। इस समाधान से 490 μL को एलीकोट करें और 35 mM CuCl2 समाधान बनाने के लिए एसिटिक एसिड (pH = 4) के 1,510 μL में जोड़ें।
    10. 35 mM CuCl2 स्टॉक समाधान से 6 μL को एलीकोट करें और इसे लगभग 2 mM की अंतिम CuCl2 एकाग्रता बनाने के लिए सेल लिसेट के 94 μL वाले छह नमूनों में जोड़ें। एक एसिटिक एसिड समाधान (pH = 4) का 6 μL जोड़ें जिसमें नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए सेल लिसेट के 94 μL वाले छह नमूनों में CuCl2 नहीं है। सेल lysate की अंतिम मात्रा 100 μL होना चाहिए, जो क्या TBARS परख के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
      नोट: एसिटिक एसिड (पीएच = 4) में 35 mM CuCl2 स्टॉक समाधान बनाना तांबे के हाइड्रॉक्साइड की वर्षा को रोकने के लिए आवश्यक है।
    11. 24 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में नमूने इनक्यूबेट और 100 μL की एक अंतिम मात्रा वाले प्रत्येक नमूने पर एक TBARS परख प्रदर्शन।
    12. HepG2 सेल lysates के लिए TBARS परख की reproducibility की जाँच करने के लिए अलग-अलग दिनों पर 1.1.9 और 1.1.11 2x चरणों को दोहराएँ।
  2. कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन
    नोट: आमतौर पर, पूर्व-शुद्ध कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) में ईडीटीए की कुछ मात्रा होती है। यहां उपयोग किए जाने वाले एलडीएल नमूनों में 0.01% ईडीटीए होता है। ईडीटीए इन विट्रो Cu (II) को बाधित कर सकता है - एलडीएल के मध्यस्थता ऑक्सीकरण। इसलिए, प्रयोगों या विश्लेषण से पहले एलडीएल नमूनों से ईडीटीए को हटाना आवश्यक हो सकता है। चरण 1.2.1–1.2.5 इस प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।
    सावधानी: सोडियम हाइड्रॉक्साइड संक्षारक है और त्वचा और आंखों में जलन पैदा करता है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें।
    1. एक 5.51 मिलीग्राम / एमएल एलडीएल स्टॉक (एक मानक के रूप में बीएसए का उपयोग करके संशोधित लोरी विधि द्वारा निर्धारित प्रोटीन एकाग्रता) से 24 μL को उचित रूप से लेबल किए गए 1 एमएल स्नैप-कैप पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में एलीकोट करें। के रूप में जरूरत के रूप में कई ऐलीकोट के रूप में बनाने के लिए और ऑक्सीकरण और / या TBARS परख में उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    2. NaOH मोतियों के साथ pH = 7 में समायोजित 0.15 M NaCl में एक 10 mM HEPES बफर तैयार करें: 0.49 लीटर पानी में NaCl के 4.39 ग्राम को भंग करें, फिर HEPES के 1.19 ग्राम जोड़ें। एक हलचल पट्टी के साथ अच्छी तरह से भंग. सोडियम हाइड्रॉक्साइड मोतियों को जोड़ें जब तक कि पीएच 7 न हो जाए। पानी के साथ 0.5 एल तक पतला करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर स्टोर करें और 3 महीने के भीतर उपयोग करें।
    3. 500 μL करने के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए एलीकोट किए गए LDL नमूनों में 0.15 M NaCl (pH = 7) में 10 mM HEPES बफर के 476 μL जोड़ें। एक 100K आणविक वजन कटऑफ के साथ एक 0.5 mL केन्द्रापसारक स्पिन फिल्टर डिवाइस के लिए पतला LDL नमूना जोड़ें।
    4. आरटी पर 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर स्पिन नमूने, लगभग 30 μL की अंतिम retentate मात्रा को छोड़कर। 0.15 M NaCl (pH = 7) में 10 mM HEPES बफर के 480 μL में नमूनों का पुनर्गठन करें और RT पर 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर फिर से स्पिन करें। इस चरण को कुल चार स्पिन-थ्रू के लिए 2x निष्पादित करें।
    5. एक नए 2 एमएल स्नैप-कैप पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में फ़िल्टर डिवाइस को उल्टा रखें, और एलडीएल नमूना (अंतिम मात्रा = लगभग 30 μL) एकत्र करने के लिए 2 मिनट के लिए 1000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. 1 एमएल ट्यूब को उचित रूप से लेबल में एलीकोट नमूना और 50 μL की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने में 20 μL पानी जोड़ें।
    7. एसिटिक एसिड में 200 μM CuCl2 स्टॉक समाधान की तैयारी (pH = 4)
      1. एसिटिक एसिड समाधान तैयार करें (pH = 4): चरण 1.1.9.1 देखें।
      2. एक 144 mM CuCl2 स्टॉक समाधान तैयार करें (चरण 1.1.9.2 देखें), फिर 144 mM CuCl2 स्टॉक से 5.5 μL को एलीकोट करें और 200 μM समाधान बनाने के लिए एसिटिक एसिड (pH = 4) के 4 mL की अंतिम मात्रा में भंग करें।
    8. 200 μM CuCl2 स्टॉक समाधान से 2.7 μL ऐलीकोट करें और इसे एलडीएल के 50 μL वाले छह नमूनों में जोड़ें ताकि ~ 10 μM की अंतिम CuCl2 एकाग्रता प्राप्त की जा सके। एक एसिटिक एसिड समाधान (pH = 4) से 2.7 μL जोड़ें जिसमें नियंत्रण के लिए उपयोग किए जाने वाले LDL के 50 μL वाले छह नमूनों के लिए CuCl2 नहीं होता है।
    9. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में 2 ज के लिए एलडीएल नमूनों को इनक्यूबेट करें। 2 घंटे के बाद, 0.15 M NaCl (pH = 7) में 10 mM HEPES बफर के साथ प्रत्येक नमूने के लिए अंतिम मात्रा को 100 μL पर लाएं। तुरंत एक TBARS परख प्रदर्शन.
    10. TBARS परख की reproductivity का परीक्षण करने के लिए दो अलग-अलग दिनों पर चरण 1.2.3–1.2.9 2x दोहराएँ।
  3. मानव सीरम
    1. एक मानव सीरम नमूने से, 94 μL के ऐलीकोट प्रत्येक को 2 एमएल स्नैप-कैप पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में बनाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
    2. एसिटिक एसिड (pH = 4) में एक 35 mM CuCl2 स्टॉक समाधान तैयार करें: चरण 1.1.9 देखें।
    3. CuCl2 स्टॉक समाधान से 6 μL ऐलीकोट करें और इसे मानव सीरम के 94 μL वाले छह नमूनों में जोड़ें ताकि लगभग 2 mM की अंतिम CuCl2 एकाग्रता बनाई जा सके। एक एसिटिक एसिड समाधान (पीएच = 4) के 6 μL जोड़ें जिसमें नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए मानव सीरम के 94 μL युक्त छह नमूनों में CuCl2 नहीं है।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में 24 ज के लिए मानव सीरम नमूनों को इनक्यूबेट करें और TBARS परख (अनुभाग 4) के साथ ऑक्सीकरण के स्तर का निर्धारण करें।
    5. TBARS परख की पुनरुत्पादन क्षमता निर्धारित करने के लिए दो अलग-अलग दिनों पर चरण 1.3.2–1.3.4 2x को दोहराएं।

2. अभिकर्मक तैयारी

सावधानी: Thiobarbituric एसिड त्वचा और आंखों की जलन का कारण बनता है और शायद साँस लेने या त्वचा अवशोषण द्वारा हानिकारक है। एसिटिक एसिड आंतरिक अंगों को नुकसान पहुंचा सकता है यदि साँस ली जाती है। एक धुएं हुड में सभी एसिड समाधान तैयार करें।

  1. 8.1% (w/ v) सोडियम डोडेसिलसल्फेट (SDS) समाधान की तैयारी
    1. एसडीएस के 32.4 ग्राम वजन और एक बीकर में DI पानी के 350 मिलीलीटर में भंग। एसडीएस को धीरे से भंग करने और बुलबुले बनाने से बचने के लिए एक चुंबकीय हलचल बार का उपयोग करें। डीआई पानी के साथ 400 एमएल के लिए अंतिम मात्रा लाएं और आरटी पर एसडीएस समाधान स्टोर करें।
      नोट: यहाँ, अतिरिक्त 8.1% SDS समाधान तैयार किया गया है; हालांकि, 96 नमूनों के लिए, 8.1% एसडीएस समाधान के केवल 20 मिलीलीटर की आवश्यकता होती है। विश्लेषण किए जा रहे नमूनों की संख्या के अनुसार इस समाधान को तैयार करें।
  2. 3.5 M सोडियम एसीटेट बफर की तैयारी (pH = 4)
    1. एक बीकर में डीआई पानी के 350 मिलीलीटर में ग्लेशियल एसिटिक एसिड के 100 मिलीलीटर को पतला करें। इसे धीरे से भंग करने के लिए एक चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग करें।
    2. पानी में सोडियम हाइड्रॉक्साइड मोतियों का उपयोग करके एक 6.5 M NaOH समाधान तैयार करें। डीआई पानी के 40 मिलीलीटर में NaOH मोतियों के 13 ग्राम भंग और DI पानी के साथ 50 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में लाने के लिए।
    3. धीरे-धीरे हलचल बार के साथ मिश्रण करते समय एसिटिक एसिड समाधान में 6.5 M NaOH समाधान के बारे में 46 मिलीलीटर जोड़ें (यह पीएच को 4 तक बढ़ाना चाहिए, लेकिन पीएच मीटर का उपयोग करके मापने के दौरान धीरे-धीरे NaOH समाधान को जोड़कर पुष्टि करें)।
    4. डीआई पानी के साथ 500 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाओ और आरटी पर सोडियम एसीटेट बफर स्टोर करें।
  3. थायोबार्बिटुरिक एसिड के 0.8% जलीय घोल की तैयारी (पीएच = 4 में समायोजित)
    नोट: इस चरण में, थायोबार्बिट्यूरिक एसिड की तैयारी को बड़ी मात्रा में अनुकूलित किया गया है, क्योंकि बड़ी संख्या में नमूनों का विश्लेषण किया जा रहा है (108 नमूने, मानकों सहित नहीं)। विश्लेषण के लिए नियोजित नमूनों की संख्या के आधार पर इस समाधान को तैयार करें।
    1. सोडियम हाइड्रॉक्साइड मोतियों और पानी का उपयोग करके एक 5 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान तैयार करें: 20 मिलीलीटर पानी की अंतिम मात्रा में 4 ग्राम सोडियम हाइड्रॉक्साइड मोतियों को भंग करें। प्लास्टिक के कंटेनर में स्टोर करें। इस समाधान को प्रत्येक बैच के लिए ताजा तैयार किया जाना चाहिए।
    2. थायोबार्बिट्यूरिक एसिड के 4 ग्राम वजन और डीआई पानी के 450 मिलीलीटर जोड़ें। इसे धीरे से भंग करने के लिए एक चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग करें।
      नोट:: यह समाधान अंततः एक 500 mL कुल मात्रा के लिए लाया जाएगा।
    3. एक हलचल बार के साथ thiobarbituric एसिड को भंग करते समय, 100 μL वृद्धि में 5 M NaOH समाधान के बारे में 3 mL (धीरे-धीरे और एक dropwise तरीके से) जोड़ें। NaOH समाधान जोड़ने के बाद, thiobarbituric एसिड कणों को भंग करने के लिए शुरू हो जाएगा।
    4. यदि थायोबार्बिट्यूरिक एसिड कण अभी भी पूरी तरह से भंग नहीं हुए हैं, तो 100 μL वृद्धि में 5 M NaOH समाधान के अधिक जोड़ें जब तक कि सभी thiobarbituric एसिड कणपूरी तरह से भंग न हो जाएं। समाधान की इस विशेष मात्रा के लिए, thiobarbituric एसिड कणों को पूरी तरह से भंग करने के लिए 5 M NaOH समाधान के कुल 4 mL जोड़ा जाता है।
      नोट: इस एकाग्रता पर, thiobarbituric एसिड पूरी तरह से भंग नहीं होगा जब तक कि पीएच लगभग 4 है।
    5. सभी thiobarbituric एसिड पूरी तरह से भंग हो गया है के बाद NaOH जोड़ने बंद करो. 4 के पीएच को पार करने से बचें। अंतिम पीएच को मिश्रण थायोबार्बिट्यूरिक एसिड समाधान से 1 μL लेकर और इसे पीएच पेपर पर रखकर सत्यापित किया जा सकता है।
    6. DI पानी के साथ 500 mL करने के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए और आरटी पर जलीय 0.8% thiobarbituric एसिड समाधान स्टोर।

3. Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) मानक नमूना तैयारी

नोट: Malondialdehyde (MDA) अस्थिर है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है। हालांकि, एमडीए के विभिन्न रासायनिक रूप हैं जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जैसे कि एमडीए टेट्राब्यूटिलामोनियम नमक, एमडीए बिस (डाइमिथाइल एसिटल), और एमडीए बिस (डायथिल एसिटल)। इन तीन रासायनिक रूपों में से, एमडीए बीआईएस (डाइमिथाइल एसिटल) का उपयोग यहां किया जाता है, क्योंकि अधिकांश अध्ययन इस समान मानक 21,22 का उपयोग करते हैं। यदि एमडीए के अन्य दो रासायनिक रूपों का उपयोग करना चुनते हैं, तो उनकी उपयुक्तता का पूर्व सत्यापन किया जाना चाहिए।

  1. डीआई पानी के 1 एल में शुद्ध एमडीए बिस (डाइमिथाइल एसिटल) के 92 μL को पतला करके एक 550 μM MDA bis (dimethyl acetal) स्टॉक समाधान तैयार करें। 10 मिनट के लिए समाधान को अच्छी तरह से मिलाने के लिए एक चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग करें। समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 1 महीने के भीतर उपयोग करें।
  2. डीआई पानी के 1274 μL में 550 μM MDA bis (dimethyl acetal) स्टॉक से 726 μL को पतला करके एक 200 μM MDA bis (dimethyl acetal) तैयार करें। इस 200 μM एमडीए bis (dimethyl acetal) समाधान हर बार एक TBARS परख प्रदर्शन किया जाता है ताजा तैयार किया जाना चाहिए.
  3. मानक वक्र तैयारी: आठ 2 एमएल स्नैप-कैप पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब लें और उन्हें एच के माध्यम से अक्षरों के साथ लेबल करें 200 μM स्टॉक से एमडीए बिस (डाइमिथाइल एसिटल) जोड़ें और तालिका 1 में वर्णित पानी में पतला करें।
  4. आठ ग्लास ट्यूब (13 मिमी x 100 मिमी) लें और उन्हें ए-एच लेबल करें, फिर संबंधित ट्यूबों में मानक के 100 μL जोड़ें। TBARS परख का पता लगाने की सीमाओं की गणना करने के लिए रिक्त मानक (नमूना एक) के लिए छह प्रतिकृति प्रदर्शन।
    नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ 1 घंटे से अधिक के लिए रोका जा सकता है।

4. TBARS परख

नोट: एक बार TBARS परख शुरू कर दिया है, यह रोकने के बिना समाप्त हो जाना चाहिए.

  1. विश्लेषण किए जाने वाले नमूनों की संख्या के लिए आवश्यक के रूप में कई ग्लास ट्यूब लें और उन्हें नमूनों के नामों के साथ लेबल करें। फिर, प्रत्येक ग्लास ट्यूब में प्रत्येक तैयार नमूने (जैसा कि ऊपर वर्णित है) का 100 μL जोड़ें।
  2. प्रत्येक नमूने और मानक के लिए 8.1% SDS के 200 μL जोड़ें और धीरे से नमूने को मिलाने के लिए एक परिपत्र गति में ग्लास ट्यूब घुमाएं।
  3. प्रत्येक नमूने और मानक के लिए 3.5 एम सोडियम एसीटेट बफर (पीएच = 4) के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. प्रत्येक नमूने और मानक के लिए जलीय 0.8% थायोबार्बिट्यूरिक एसिड समाधान (पीएच = 4) के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  5. DI पानी के 700 μL जोड़कर प्रत्येक नमूने और मानक के लिए अंतिम मात्रा को 4 मिलीलीटर तक लाएं।
  6. कसकर प्रत्येक ग्लास ट्यूब कैप और एक हीटिंग ब्लॉक में इनक्यूबेट 1 घंटे के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कांच की ट्यूबों को कवर करने के लिए ट्यूबों के शीर्ष पर संघनन को रोकने के लिए।
  7. हीटिंग ब्लॉक से ग्लास ट्यूबों को हटा दें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  8. सेंट्रीफ्यूज नमूने और मानक 1500 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए। centrifugation के बाद, आरटी पर नमूनों और मानकों वाले ग्लास ट्यूबों को रखें।
    नोट: बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को रखने से पूरे नमूने या मानक को अवक्षेपित किया जाएगा।
  9. सेंट्रीफ्यूजेशन के तुरंत बाद, प्रत्येक ट्यूब से supernatant के 150 μL को एलीकोट करें और 96 अच्छी तरह से प्लेट के एक अलग कुएं में रखें।
  10. एक पिपेट टिप का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से किसी भी बुलबुले को हटा दें।
    नोट: बुलबुले की उपस्थिति असंगत absorbance रीडिंग उपज, उच्च परख imprecision के लिए अग्रणी होगा.
  11. 532 एनएम पर absorbances पढ़ें। अन्य सभी absorbance रीडिंग से रिक्त नमूनों के औसत absorbance पढ़ने घटाएँ।
  12. प्रत्येक मानक की ज्ञात एकाग्रता बनाम 532 एनएम पर रिक्त-घटाया अवशोषण रीडिंग प्लॉट करके एक मानक वक्र बनाएं। रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करके डेटा बिंदुओं को फ़िट करें. मानक वक्र से प्राप्त रैखिक प्रतिगमन रेखा के समीकरण का उपयोग करके अज्ञात नमूना सांद्रता की गणना करें।

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Representative Results

अम्लीय परिस्थितियों के तहत (पीएच = 4) और 95 डिग्री सेल्सियस पर, मालोन्डिएल्डिहाइड (एमडीए) बीआईएस (डाइमिथाइल एसिटल) एमडीए 23 की पैदावार करता है। एमडीए और निकटता से संबंधित रासायनिक congeners thiobarbituric एसिड (TBA) के दो अणुओं के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए thiobarbituric एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थ (TBARS) नामक यौगिकों का उत्पादन करने के लिए, जो एक लाल-गुलाबी रंग देते हैं और 532 एनएम (चित्रा 1, चित्रा 2) पर एक अवशोषण πmax है। मानक के रूप में एमडीए बीआईएस (डाइमिथाइल एसिटल) का उपयोग करते हुए, मानक वक्र उत्पन्न किए गए थे (चित्रा 3, तालिका 1) तीन अलग-अलग जैविक नमूनों में परख और ऑक्सीकरण के स्तर का पता लगाने और संवेदनशीलता की सीमाओं को निर्धारित करने के लिए। विभिन्न दिनों में तीन अलग-अलग नमूनों में ऑक्सीकरण के स्तर को निर्धारित करने के लिए कुल नौ TBARS assays किए गए थे। इसलिए, कुल नौ मानक वक्र उत्पन्न किए गए थे, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है। कम से कम वर्ग प्रक्रिया 24 का उपयोग ढलान और वाई-इंटरसेप्ट के मानक विचलन को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जो क्रमशः 8.67 x 10-6 और 5.66 x 10-4 थे।

TBARS परख का पता लगाने की सीमाओं को मानक विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं के अनुसार निर्धारित किया गया था25 रिक्त नमूनों के absorbances को मापने के द्वारा (प्रयोगात्मक प्रतिकृति प्रति दो तकनीकी प्रतिकृति के साथ छह प्रयोगात्मक प्रतिकृति) तीन अलग-अलग दिनों पर। न्यूनतम अलग-अलग विश्लेषणात्मक संकेत (Sm) को रिक्त संकेत (S̄bl) के माध्य को संक्षेप में प्रस्तुत करके निर्धारित किया गया था, साथ ही रिक्त (ksbl) के मानक विचलन के एकाधिक k, जहां k = 3। यही है, Sm = S̄bl + ksbl। Sm और मानक वक्र (m) की ढलान का उपयोग करते हुए, पता लगाने की सीमा (cm) की गणना cm = (Sm - S̄bl)/m के रूप में की गई थी। तीन अलग-अलग दिनों में रिक्त नमूनों के परिणामी डेटा से पता चलता है कि एक पता लगाने योग्य गैर-शोर अवशोषण संकेत देने के लिए आवश्यक TBARS पदार्थ की न्यूनतम एकाग्रता 1.1 μM (तालिका 2) है। TBARS परख की संवेदनशीलता के बारे में 0.00160 absorbance इकाइयों /

विभिन्न जैविक matrices में लिपिड पेरोक्सिडेशन में परिवर्तन का पता लगाने में TBARS परख की प्रयोज्यता को स्पष्ट करने के लिए, CuCl2 का उपयोग मानव सीरम, HepG2 सेल lysates, और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन के इन विट्रो ऑक्सीकरण को प्रेरित करने के लिए किया गया था। यहां उपयोग किए जाने वाले ये जैविक नमूने जैविक आव्यूहों के प्रोटोटाइप हैं। उदाहरण के लिए, HepG2 सेल lysates के लिए यहाँ प्रस्तुत परिणामों के आधार पर, यह उम्मीद करना उचित है कि यह परख सेल lysate के अन्य प्रकार के साथ काम करेगा; हालांकि, इसे इस उद्देश्य के लिए विश्लेषणात्मक रूप से मान्य करने की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, यहां उपयोग किए जाने वाले तीन जैविक आव्यूहों में से, कुछ प्रकार के नमूनों के लिए TBARS की कम अंतर्जात सांद्रता प्रदर्शित करना आम है। उदाहरण के लिए, HepG2 सेल lysates कि CuCl2 के साथ इलाज नहीं किया गया था के लिए TBARS परख का पता लगाने की सीमा से ऊपर थे (के बारे में 2 μM; चित्रा 4)। जैसा कि कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात की उपस्थिति में अपेक्षित होगा, इस विशेष नमूने के लिए मानक विचलन और भिन्नता का गुणांक अपेक्षाकृत अधिक है (तालिका 3)। हालांकि, जैसे-जैसे Cu (II) मध्यस्थता ऑक्सीकरण के परिणामस्वरूप संकेत बढ़ता है, भिन्नता का गुणांक कम हो जाता है। सामान्य तौर पर, के रूप में absorbance पता लगाने की सीमा से परे बढ़ जाती है, परख reproducibility में सुधार (तालिका 3).

इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, जैविक नमूनों के इन विट्रो Cu (II) -मध्यस्थता ऑक्सीकरण को मुखौटा करने के लिए एंटीऑक्सिडेंट का उपयोग करने की कोई इच्छा नहीं थी। व्यावसायिक रूप से तैयार कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) में 0.01% ईडीटीए हो सकता है। ईडीटीए Cu (II) को रोक देगा - एलडीएल के मध्यस्थता ऑक्सीकरण लेकिन जरूरी नहीं कि अन्य धातु-मध्यस्थता ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाएं 26,27। एक TBARS परख EDTA युक्त LDL नमूनों पर प्रदर्शन किया गया था, और TBARS के स्तर Cu (द्वितीय) के बीच नहीं बदला था इलाज और अनुपचारित LDL नमूनों (चित्रा 5A). हालांकि, ईडीटीए को स्पिन निस्पंदन द्वारा हटा दिए जाने के बाद (चरण 1.2.3-1.2.5 देखें), एलडीएल ने Cu (II) -मध्यस्थता ऑक्सीकरण किया, जैसा कि TBARS परख (चित्रा 5B) द्वारा पता लगाया गया था।

एमडीए के संदर्भ में व्यक्त स्वस्थ दाताओं से मानव सीरम में लिपिड पेरोक्सीडेशन उत्पादों की सामान्य सीमा 1.80-3.94 μM28 के बीच है। मानव सीरम में TBARS परख की गतिशील सीमा को स्पष्ट करने के लिए, 2 mM Cu (II) आयनों की एकाग्रता को नमूनों में जोड़ा गया था, इसके बाद 37 °C पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेशन किया गया था। इसके परिणामस्वरूप TBARS (चित्रा 6) में 6x-7x की वृद्धि हुई।

Figure 1
चित्रा 1: Thiobarbituric एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थ परख योजनाबद्ध.
नमूना या मानक के एक सौ माइक्रोलीटर को 13 मिमी x 100 मिमी ग्लास ट्यूब में जोड़ा जाता है, इसके बाद थायोबार्बिट्यूरिक एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थ (TBARS) अभिकर्मकों को जोड़ा जाता है। 1 घंटे के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद, नमूनों और मानकों को 30 मिनट के लिए बर्फ में इनक्यूबेट किया जाता है, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,500 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। नमूना या मानक supernatant के एक सौ पचास microliters एक 96 अच्छी तरह से प्लेट पर लोड कर रहे हैं, और absorbance 532 एनएम पर मापा जाता है। अज्ञात नमूना एकाग्रता की गणना मानक वक्र के समीकरण का उपयोग करके की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: आर्केटाइप थायोबार्बिट्यूरिक एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थों की प्रतिक्रिया।
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) एसिड-उत्प्रेरित हाइड्रोलिसिस 1 के तहत मालोंडिएल्डिहाइड की पैदावार करता है। जारी मालोन्डिएल्डिहाइड (एमडीए) तब एमडीए-टीबीए 2-टीबीए 2 एडक्ट्स बनाने के लिए 2-थायोबार्बिट्यूरिक एसिड (टीबीए) (पीएच = 4 और 95 डिग्री सेल्सियस) के दो अणुओं के साथ प्रतिक्रिया करता है जो लाल-गुलाबी रंग देते हैं और 532 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से मापा जा सकता है। क्योंकि एमडीए के अलावा अन्य अणु जो ऑक्सीकृत लिपिड से व्युत्पन्न होते हैं, टीबीए के साथ भी प्रतिक्रिया कर सकते हैं, 532 एनएम पर अवशोषण माप को बस थायोबार्बिट्यूरिक एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थों, या टीबीएआरएस के माप के रूप में संदर्भित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) colorimetric मानक घटता है।
चित्र विभिन्न दिनों में बनाए गए नौ मानक वक्रों को दर्शाता है। कुछ बिंदु ओवरलैप होते हैं और उन्हें एक दूसरे से अलग नहीं किया जा सकता है। Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) को 0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, और 160 μM पर कैलिब्रेटर नमूनों में मजबूत किया गया था (जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है; n = 1 प्रति दिन प्रति एकाग्रता बिंदु)। Absorbance को 532 nm पर मापा गया था, जिसमें खाली नमूनों के औसत अवशोषण को उस बैच में सभी मापों से घटाया गया था, जिसमें अज्ञात भी शामिल थे। प्रत्येक दिन, जैविक नमूनों में TBARS निर्धारित करने के लिए कम से कम वर्गों रैखिक प्रतिगमन द्वारा उत्पन्न समीकरण का उपयोग किया गया था। संयुक्त सभी नौ मानक वक्रों के लिए, ढलान का मानक विचलन 8.67 x 10-6 था, और y-इंटरसेप्ट का मानक विचलन 5.66 x 10-4 था। ढलान और y-इंटरसेप्ट के मानक विचलन की गणना कम से कम वर्ग प्रक्रिया 24 का उपयोग करके की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: HepG2 lysates में ऑक्सीकरण TBARS द्वारा पता लगाया.
छह HepG2 सेल lysate नमूनों को 2 mM CuCl2 [HepG2 सेल lysate + 2 mM Cu (II)] के साथ इनक्यूबेट किया गया था और छह नमूनों को CuCl2 (HepG2 सेल लिसेट) के बिना एक समाधान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। इनक्यूबेशन के बाद, TBARS परख 12 नमूनों पर प्रदर्शन किया गया था. इस प्रक्रिया को कुल तीन अलग-अलग दिनों के लिए 2x दोहराया गया था। त्रुटि पट्टियाँ SD का प्रतिनिधित्व करती हैं। तारांकन नियंत्रण और Cu(II) के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है- उपचारित लिसेट (p < 0.001). ग्राफपैड में मान व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: TBARS द्वारा पता लगाया कम घनत्व लिपोप्रोटीन में ऑक्सीकरण.
(ए) TBARS परख 0.01% EDTA युक्त एलडीएल नमूनों में आयोजित. छह एलडीएल नमूनों को 10 μM CuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)] के साथ इनक्यूबेट किया गया था, और छह नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए कोई CuCl2 जोड़ा (मूल एलडीएल) के साथ एक नियंत्रण समाधान के साथ इनक्यूबेट किया गया था। फिर, एक TBARS परख 12 नमूनों पर प्रदर्शन किया गया था. "एनएस" कोई सांख्यिकीय महत्व का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। (बी) एलडीएल को ईडीटीए को हटाने के लिए एक केन्द्रापसारक स्पिन फिल्टर डिवाइस का उपयोग करके स्पिन फ़िल्टर किया गया था। फिर, इनक्यूबेशन के साथ और बिना जोड़ा Cu (II) के साथ और बिना फिर से किया गया था के रूप में (ए) के लिए वर्णित के रूप में फिर से प्रदर्शन किया गया था। TBARS परख तुरंत बाद में प्रदर्शन किया गया था. यह एक ही प्रक्रिया कुल 3 दिनों के लिए 2x दोहराया गया था। त्रुटि पट्टियाँ SD का प्रतिनिधित्व करती हैं। तारांकन नियंत्रण और Cu(II)-उपचारित LDL नमूनों (p < 0.001) के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है। ग्राफपैड में मान व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: TBARS द्वारा पता लगाए गए मानव सीरम नमूनों में लिपिड पेरोक्सीडेशन।
छह मानव सीरम नमूनों को 2 mM CuCl2 [सीरम + 2 mM Cu (II)] के साथ इनक्यूबेट किया गया था, और छह नमूनों को एक समाधान के साथ इनक्यूबेट किया गया था जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोई जोड़ा CuCl2 (सामान्य सीरम) नहीं था। इनक्यूबेशन के बाद, TBARS परख 12 नमूनों पर प्रदर्शन किया गया था. इस प्रक्रिया को दो अतिरिक्त दिनों में दोहराया गया था। त्रुटि सलाखों एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं तारांकन नियंत्रण और Cu (II) के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है- सीरम नमूनों का इलाज (पी < 0.001)। ग्राफपैड में मान व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ग्लास ट्यूब 200 μM MDA bis (dimethyl acetal) (μL) पानी (μL) एमडीए bis (dimethyl acetal) अंतिम एकाग्रता (μM)
Aa 0 1000 0
B 12.5 987.5 2.5
C 25 975 5
D 50 950 10
E 100 900 20
F 200 800 40
G 400 600 80
H 800 200 160

तालिका 1: Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) मानक नमूना तैयारी। ताजा तैयार 200 μM malondialdehyde bis (dimethyl acetal) से, मानक वक्र के लिए अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए सुझाए गए वॉल्यूम को एलीकोट करें। विधि का पता लगाने की सीमा निर्धारित करने के लिए प्रति दिन रिक्त नमूने (ए) की कम से कम छह प्रतिकृतियां करने की सिफारिश की जाती है।

दिन Absorbancea Sblb Smc संवेदनशीलता (absorbance units/μM)d cm (μM)e
1 (n = 6) 0.0412 0.000612 0.0430 0.00160 1.14
2 (n = 6) 0.0415 0.000632 0.0433 0.00160 1.18
3 (n = 6) 0.0413 0.000605 0.0431 0.00160 1.13
सभी तीन दिन (n = 18) 0.0413 0.000589 0.0431 0.00160 1.10
एक प्रति दिन 6 प्रतिकृतियों के साथ तीन अलग-अलग दिनों में रिक्त नमूनों का अवशोषण।
bSbl = खाली नमूनों के अवशोषण का मानक विचलन।
cSm = न्यूनतम अलग-अलग विश्लेषणात्मक संकेत, जो रिक्त संकेत (S̄bl) के माध्य को संक्षेप में प्रस्तुत करके निर्धारित किया गया था, साथ ही रिक्त (ksbl) के मानक विचलन के एक से अधिक k, जहां k = 3। वह है; Sm = S̄bl + ksbl.
d TBARS परख की संवेदनशीलता, जो मानक वक्र की ढलान है.
ecm = पता लगाने की सीमा, जिसकी गणना cm = (Sm - S̄bl)π m के रूप में की गई थी, जहां m = मानक वक्र की ढलान।

तालिका 2: TBARS परख की पहचान सीमा.

कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन मानव सीरम HepG2 सेल Lysate
दिन % CV दिन % CV दिन % CV
1 (n = 6) 5.6 1 (n = 6) 7.9 1 (n = 6) 12.6
2 (n = 6) 5.4 2 (n = 6) 7.2 2 (n = 6) 15.8
3 (n = 6) 3.9 3 (n = 6) 7.0 3 (n = 6) 17.7
सभी तीन दिन (n = 18)a 7.4 सभी तीन दिन (n = 18) 9.8 सभी तीन दिन (n = 18) 15.5b
10 μM CuCl2 के साथ 2 mM CuCl2 के साथ 2 mM CuCl2 के साथ
1 (n = 6) 4.5 1 (n = 6) 6.0 1 (n = 6) 5.8
2 (n = 6) 6.5 2 (n = 6) 4.3 2 (n = 6) 6.0
3 (n = 6) 6.7 3 (n = 6) 6.2 3 (n = 6) 8.0
सभी तीन दिन (n = 18) 6.1 सभी तीन दिन (n = 18) 5.6 सभी तीन दिन (n = 18) 7.3
एक Interday परिशुद्धता सभी तीन दिनों से डेटा पूलिंग द्वारा गणना की गई थी।
b परिशुद्धता परख LOD के पास होने के परिणामों के कारण सीमित था.

तालिका 3: तीन अलग-अलग जैविक नमूनों में TBARS की विश्लेषणात्मक पुनरुत्पादकता।

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Discussion

इसकी सीमाओं के बावजूद1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 और प्रयोगशालाओं के बीच तुलना के लिए उपयुक्तता की कमी के बावजूद, TBARS परख सबसे पुराने 29,30 में से एक है लेकिन जैविक नमूनों में ऑक्सीडेटिव तनाव को मापने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले assays। TBARS परख एक सीधा तरीका है कि केवल के बारे में 2 ज प्रदर्शन करने के लिए लेता है, एक बार सभी आवश्यक अभिकर्मकों को तैयार किया गया है. यहां, हमने विस्तार से वर्णन किया है कि मानक वक्र सहित यह परख, कई बार किफायती तरीके से प्रदर्शन किया जा सकता है (96 नमूनों के लिए लगभग $ 3.50 अमरीकी डालर), नमूनों के हर बैच के लिए एक महंगी किट खरीदने के बिना।

परख के सभी कदम महत्वपूर्ण हैं, लेकिन कुछ कदम हैं जिन्हें अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, थायोबार्बिटुरिक एसिड का पीएच 4 से अधिक नहीं होना चाहिए। थायोबार्बिट्यूरिक एसिड में सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान जोड़ते समय सावधानी बरतनी चाहिए और 4 से अधिक का पीएच प्राप्त करने से बचें। एमडीए और टीबीए के बीच प्रतिक्रिया के लिए एक अम्लीय वातावरण की आवश्यकता होती है, और एमडीए मानक एसिड-उत्प्रेरित हाइड्रोलिसिस द्वारा एमडीए बीआईएस (डाइमिथाइल एसिटल) से जारी किया जाता है। इसलिए, एक उच्च पीएच अप्रत्याशित और अत्यधिक परिवर्तनीय परिणामों को जन्म दे सकता है31।

इसके अलावा, जबकि यह कुछ पाठकों के लिए स्पष्ट हो सकता है, अवशोषण को मापने से पहले 96 अच्छी तरह से प्लेट में किसी भी बुलबुले को हटाना भी महत्वपूर्ण है। बुलबुले की उपस्थिति उच्च अवशोषण मूल्यों और प्रतिकृतियों के बीच अंतर पैदा करेगी, जिससे सीवी का उच्च प्रतिशत हो जाएगा। इसके अतिरिक्त, 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, नमूनों को बर्फ पर 30 मिनट से अधिक समय तक इनक्यूबेट नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि यह पूरे नमूने को अवक्षेपित करेगा, और एक अवक्षेप-मुक्त supernatant एकत्र करना पूरा करना मुश्किल होगा। विशेष रूप से, वहाँ कोई अच्छा रोक अंक एक बार TBARS परख शुरू कर दिया गया है रहे हैं. इसे एक बार शुरू करने के बाद पूरा किया जाना चाहिए। अंत में, वहाँ कई संभव methodological विविधताओं है कि इस परख के लिए लागू किया जा सकता है रहे हैं. यहां वर्णित सामान्य प्रोटोकॉल को विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए आगे अनुकूलित (और मान्य) किया जा सकता है, जिसमें वे भी शामिल हैं जिनमें विश्लेषण से पहले कट्टरपंथी मैला ढोने वालों या अन्य प्रकार के एंटीऑक्सिडेंट के अलावा की आवश्यकता होती है।

जबकि TBARS परख लोकप्रिय है, यह महसूस करने के लिए महत्वपूर्ण है कि यह एक आणविक रूप से विशिष्ट परख नहीं है. कई रासायनिक रूप से प्रतिक्रियाशील कार्बोनिल युक्त कार्बनिक अणु, जिनमें लिपिड के अलावा अन्य ऑक्सीकरण बायोमोलेक्यूल्स से व्युत्पन्न अणु शामिल हैं, टीबीए के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं और इस प्रकार TBARS1,32,33,34 के रूप में गिना जाता है। इसके अलावा, absorbance-आधारित TBARS परख का पता लगाने की सीमा के बारे में 1.1 μM, के बारे में इस विधि द्वारा निर्धारित की तुलना में बहुत बेहतर नहीं मिलता है. हालांकि, अन्य डिटेक्शन विधियों का उपयोग करके पता लगाने की सीमाओं में सुधार किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 520 एनएम पर उत्तेजना और 550 एनएम पर उत्सर्जन के साथ स्पेक्ट्रोफ्लोरोमेट्री उच्च संवेदनशीलता और पता लगाने की बेहतर सीमा प्रदान करता है, जैसा कि पहले जो और एहन 35 द्वारा सुझाया गया था। मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित तरीके नाटकीय रूप से विशिष्टता और पहचान की सीमा दोनों में सुधार कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रॉन-कैप्चर नकारात्मक-आयन रासायनिक आयनीकरण (ECNICI) विधि के साथ एक जीसी-एमएस / एमएस का उपयोग मानव सीरम और मूत्र के नमूनों में एमडीए के पेंटाफ्लोरोबेंजिल व्युत्पन्न का पता लगाने के लिए किया गया है, जिसमें कॉलम 36 पर 2 x 10-18 मोल एमडीए का पता लगाने की सीमा है। यहां, क्रोमैटोग्राफिक जुदाई, अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में, नाटकीय रूप से परख की आणविक विशिष्टता में सुधार करती है, साथ ही साथ।

फिर भी, जैविक नमूनों के भीतर ऑक्सीडेटिव प्रक्रियाओं के अन्य मापों के साथ 37,38, पूर्व-विश्लेषणात्मक नमूना हैंडलिंग TBARS माप के परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर रक्त प्लाज्मा भंडारण के परिणामस्वरूप एमडीए सांद्रता 39,40 में धीमी लेकिन नाटकीय वृद्धि होती है। इस प्रकार, जैविक नमूनों के संपर्क में पिघला हुआ या यहां तक कि आंशिक रूप से पिघलने वाली स्थितियों के लिए कुछ भी लेकिन समय की एक न्यूनतम राशि को TBARS स्तरों के आर्टिफिशियल ऊंचाई का कारण माना जाना चाहिए। इसका मतलब यह है कि भी preanalytical हैंडलिंग और biospecimens के भंडारण में मामूली परिवर्तनशीलता है कि TBARS परख का उपयोग कर तुलना की जा करने के लिए कर रहे हैं से बचा जाना चाहिए.

इन चेतावनियों को देखते हुए जो पूर्व-विश्लेषणात्मक परिवर्तनशीलता के साथ-साथ सीमित संवेदनशीलता और विशिष्टता से संबंधित हैं, यह सिफारिश की जाती है कि अवशोषण-आधारित TBARS परख का उपयोग केवल इंट्रा-प्रयोगशाला सामान्य मूल्यांकन या रेंज-खोज प्रयोगों के लिए किया जाए। इन अनुप्रयोगों में ऐसे अध्ययन शामिल हैं जिनमें सापेक्ष TBARS स्तरों की तुलना सीधे जैविक रूप से समान नमूनों के एक या अधिक समूहों के बीच की जाती है जो संसाधित या एक साथ संग्रहीत किए जाते हैं और केवल एक ही चर द्वारा अलग किए जाते हैं जो शोधकर्ताओं द्वारा पूरी तरह से नियंत्रित होता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या हितों के अन्य संघर्ष नहीं हैं।

Acknowledgments

यहां रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या के तहत भाग में समर्थित किया गया था। R33 CA217702 और छात्र विकास (IMSD) कार्यक्रम को अधिकतम करने के लिए पहल। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L VWR, PA 101642--262 cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube Corning, NY CLS430897 General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile Thermo Fisher Scientific, MA 280895 To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device Fisher Scientific, NH UFC510024 LDL purification
Caps for glass tubes Thermo Fisher Scientific, MA 14-930-15D for TBARS assay
Copper II Chloride SIGMA, MO 222011-250G to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) VWR, PA 53283-800 for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ATCC, VA HB-8065 HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL eppendorf, NY 22363204 General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Genesee Sceitific, CA 22363352 General material
Fetal Bovine Serum US Source Omega Scientific, CA FB-11 for cell culture
Glacial Acetic Acid SIGMA, MO 27225-1L-R TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific, MA 87786 cell lysis reagent
HEPES SIGMA, MO H3375-250G LDL solvent
HepG2 Cells ATCC, VA HB-8065 Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl) Fisher Scientific, NH A144-212 cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge Thermo Scientific, MA 75002431 General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma Athens Research & Technology, GA 12-16-120412 Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment VWR, PA 58948-025 General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) SIGMA, MO 8207560250 TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer Fisher Scientific, NH 51119200 To measure absorbance
NP-40 EMD Millipore Corp, MA 492016-100ML cell lysis reagent
Sodium Chloride SIGMA, MO S7653-1KG cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA, MO 436143-100G TBARS Reagent
Sodium hydroxide SIGMA, MO 367176-2.5KG TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific, MA SC250EXP For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap USA Scientific, FL 658175 cell culture
Thiobarbituric Acid SIGMA, MO T5500-100G TBARS Reagent
TRIS base Fluka, GA 93362 cell lysis reagent
Trypsin (1x) VWR, PA 16777-166 To detach HepG2 cells

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रसायन विज्ञान मुद्दा 159 thiobarbituric एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थ TBARS ऑक्सीकरण लिपिड पेरोक्सीडेशन malondialdehyde एमडीए thiobarbituric एसिड टीबीए ऑक्सीडेटिव तनाव
Thiobarbituric एसिड प्रतिक्रियाशील पदार्थ परख का उपयोग कर जैविक नमूनों में ऑक्सीडेटिव तनाव का मूल्यांकन
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Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. … More

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. R. Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay. J. Vis. Exp. (159), e61122, doi:10.3791/61122 (2020).

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