Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Utvärdering av oxidativ stress i biologiska prover med hjälp av den tiobarbituriska syrareaktiva ämnena

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61122
Automatic Translation
1,
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Summary

Målet med de tiobarbituriska syrareaktiva ämnena är att bedöma oxidativ stress i biologiska prover genom att mäta produktionen av lipidperoxidationsprodukter, främst malondialdehyd, med hjälp av synlig våglängdsspektrotometri vid 532 nm. Metoden som beskrivs här kan tillämpas på humant serum, cell lysates och låg densitet lipoproteiner.

Abstract

Trots sin begränsade analytiska specificitet och robusthet har tbarbituriska syrareaktiva ämnen (TBARS) analys använts i stor utsträckning som ett generiskt mått på lipidperoxidation i biologiska vätskor. Det anses ofta vara en bra indikator på nivåerna av oxidativ stress i ett biologiskt prov, förutsatt att provet har hanterats och lagrats korrekt. Analysen innebär reaktion av lipidperoxidationsprodukter, främst malondialdehyd (MDA), med tiobarbitursyra (TBA), vilket leder till bildandet av MDA-TBA2-adduat som kallas TBARS. TBARS ger en rödrosa färg som kan mätas spektrofotometriskt vid 532 nm. TBARS-analysen utförs under sura förhållanden (pH = 4) och vid 95 °C. Ren MDA är instabil, men dessa villkor tillåter frisättning av MDA från MDA bis (dimetyl acetal), som används som analytisk standard i denna metod. TBARS-analysen är en enkel metod som kan slutföras på ca 2 timmar. Beredning av analysreagenser beskrivs i detalj här. Budgetmedvetna forskare kan använda dessa reagenser för flera experiment till en låg kostnad snarare än att köpa ett dyrt TBARS-analyskit som bara tillåter konstruktion av en enda standardkurva (och därmed endast kan användas för ett experiment). Tillämpligheten av denna TBARS-analys visas i humant serum, lipoproteiner med låg densitet och cell lysates. Analysen är konsekvent och reproducerbar, och gränsvärden för detektion av 1,1 μM kan uppnås. Rekommendationer för användning och tolkning av spektrofotometrisk TBARS-analysen ges.

Introduction

Lipidperoxidation är en process där fria radikaler, såsom reaktiva syrearter och reaktiva kvävearter, angriper kol-kol dubbelbindningar i lipider, en process som innebär abstraktion av ett väte från ett kol och införande av en syremolekyl. Denna process leder till en blandning av komplexa produkter inklusive lipidperoxyl radikaler, och hydroperoxider som primära produkter, liksom malondialdehyd (MDA) och 4-hydroxynonenal som dominerande sekundära produkter1.

MDA har använts i stor utsträckning inom biomedicinsk forskning som en markör för lipidperoxidation på grund av dess lättsamma reaktion med tiobarbitursyra (TBA). Reaktionen leder till bildandet av MDA-TBA2, en konjugat som absorberar i det synliga spektrumet vid 532 nm och producerar en rödrosa färg2. Andra molekyler som härrör från lipidperoxidation förutom MDA kan också reagera med TBA och absorbera ljus vid 532 nm, vilket bidrar till den totala absorptionssignalen som mäts. På samma sätt kan MDA reagera med de flesta andra stora klasser av biomolekyler, vilket potentiellt begränsar dess tillgänglighet för reaktion med TBA3,4. Som sådan anses denna traditionella analys helt enkelt mäta "tiobarbituriska syrareaktiva ämnen" eller TBARS5.

När TBARS-analysen tillämpas och tolkas korrekt anses den i allmänhet vara en bra indikator på de totala nivåerna av oxidativ stress i ett biologiskt prov6. Tyvärr, som dokumenterats av Khoubnasabjafari och andra, utförs och tolkas TBARS-analysen ofta på ett sätt som underlättar tvivelaktiga slutsatser3,4,7,8,9,10,11. Orsakerna till detta är främst rotade i provrelaterade föranalytiska variabler och en brist på analys robusthet som förbjuder till synes mindre variationer i analysprotokollet utan betydande förändringar i analysresultat1,7,12,13.

Preanalytiska variabler relaterade till hantering och lagring av biospecimen (t.ex. blodplasma som tillfälligt hålls vid -20 °C)14,15 kan ha en stor inverkan på TBARS-analysresultat16,17; så till den grad att TBARS-analysresultat inte bör jämföras mellan olika laboratorier om det inte motiveras av uttryckliga interlaboratory analytiska valideringsdata. Denna rekommendation liknar hur västerländska fläckar används och tolkas ofta. Jämförelser av bandtätheter gäller för inom-blot och kanske inom laboratoriestudier, men att jämföra bandtätheter mellan laboratorier anses i allmänhet vara en ogiltig praxis.

Vissa forskare har föreslagit att MDA mätt med TBARS-analysen helt enkelt inte uppfyller de analytiska eller kliniska kriterier som krävs för en acceptabel biomarkör3,9,10,18,19. Om analysen inte hade utvecklats för över 50 år sedan skulle den förmodligen inte ha fått den utbredda användning och underförstådda acceptans som den har i dag. Även om det finns andra analyser med större analytisk känslighet, specificitet och robusthet som används för att bestämma oxidativ stress, är TBARS-analys baserad på absorbans vid 532 nm fortfarande överlägset en av de mest använda analyserna för bestämning av lipidperoxidation20, och därmed bedömning av oxidativ stress.

TBARS-analysen kan endast hittas som ett dyrt kit (över 400 amerikanska dollar), där instruktionerna inte ger detaljerad information om de flesta koncentrationer av de reagenser som används. Dessutom kan de tillhandahållna reagenserna endast användas för ett experiment, eftersom endast en kolorimetrisk standardkurva kan göras per sats. Detta kan vara problematiskt för forskare som avser att bestämma oxidationsnivåer inom några få prover vid olika tidpunkter, eftersom samma standardkurva inte kan användas vid flera tillfällen. Därför måste flera kit köpas för flera experiment. För närvarande, om inte ett dyrt kit köps, finns det inte ett detaljerat protokoll tillgängligt för hur man utför en TBARS-analys. Vissa forskare har tidigare vagt beskrivit hur man utför en TBARS-analys21,22, men varken ett helt detaljerat protokoll eller omfattande video om hur man utför TBARS-analysen utan ett dyrt kit finns i litteraturen.

Här rapporterar vi en detaljerad, analytiskt validerad för-ändamål metodik om hur man utför en TBARS-analys på ett enkelt, reproducerbart och billigt sätt. Förändringar i lipidperoxidation av humant serum, HepG2 lysates och låg densitet lipoproteiner vid behandling med Cu(II) joner visas som illustrativa tillämpningar för TBARS-analysen. Resultaten visar att denna TBARS-analys är konsekvent och reproducerbar dagligen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Humana serumprover erhölls från frivilliga som samtyckte under IRB:s godkännande och enligt principerna i Helsingforsdeklarationen. Exemplaren kodades och avidentifierades innan de överfördes till analyslaboratoriet.

1. Provberedning

  1. HepG2-cellslyssor
    1. Frö ca 10 x 106 HepG2 celler per kolv i 16 T75 flaskor med 14 ml EMEM media kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och växa celler i 2 dagar.
    2. Förbered RIPA-bufferten: Tillsätt 1,5 ml 5 M NaCl, 2,5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL NP-40 reagens och för sedan den slutliga volymen till 50 ml med DI-vatten.
    3. Förbered lysbuffert: alikvot 20 ml RIPA-buffert i ett 50 ml rör och tillsätt 200 μL av en 100x proteashämmare för att hämma protein- och lipidnedbrytning. Förvara vid 4 °C.
      OBS: Lysis buffert är kompatibel med TBARS reagenser och stör inte absorbansen vid 532 nm. Om du planerar att använda en annan lysbuffert eller lägga till ytterligare ingredienser i lysbufferten, måste preliminära valideringsstudier göras för att verifiera att lysbuffertkomponenter är kompatibla med TBARS-analysen.
    4. Ta bort media som innehåller 10% FBS och tvätta cellerna 2x med 5 ml kallt, sterilt 1x PBS.
    5. Tillsätt 1 ml lysbuffert till T75-kolvarna som innehåller cellerna och inkubera dem i 10 minuter vid rumstemperatur (RT) med konstant virvlande för att säkerställa att bufferten är väl fördelad.
    6. Samla upp lysater i lämpligt märkta 2 ml snap-cap polypropylenrör och inkubera på is i 10 min.
    7. Snurra lysatesna på 5 000 x g i 10 minuter på RT för att samla cellrester och aspirera supernatanter i ett enda 15 mL-rör.
    8. Koncentrera cell lysat supernatant fyrfaldigt med en Speed Vac vid 50 °C och 3 mbar och gör alikvoter på 94 μL vardera till 2 mL snap-cap polypropylen rör. Förvara proverna vid -80 °C tills de används för oxidation in vitro och/eller TBARS-analys.
      OBS: För att undvika att koncentrera cellen lysate supernatant, celler kan också lossna med 3 ml 1x trypsin, neutraliseras med 6 ml media och tvättas 2x med 5 ml kall PBS. Cellpellets kan sedan rekonstitueras i 250 μL lysbuffert och steg 1.1.6 och 1.1.7 kan sedan utföras.
    9. Förbered en 35 mM CuCl2-stamlösning i ättiksyra (pH = 4).
      1. Förbered ättiksyralösning (pH = 4): Späd 1 μL ättiksyra i 100 ml DI-vatten (pH bör vara cirka 4 men bekräfta detta med ett pH-mätare). Tillsätt mer vatten eller ättiksyra för att justera pH-värdet till 4.
      2. Vikt ut ca 0,1936 g koppar II klorid och lös upp i 10 ml av ättiksyralösningen (pH = 4) för att göra ett 144 mM CuCl2-lager . Alikvot 490 μL från denna lösning och tillsätt till 1 510 μL ättiksyra (pH = 4) för att göra en 35 mM CuCl2-lösning .
    10. Aliquot 6 μL från 35 mM CuCl2-stamlösningen och tillsätt den till sex prover som innehåller 94 μL celllylyst för att göra en slutlig CuCl2-koncentration på ca 2 mM. Tillsätt 6 μL av en ättiksyralösning (pH = 4) som inte har CuCl2 till sex prover som innehåller 94 μL cell lysates att använda som kontroller. Den slutliga volymen cell lysate bör vara 100 μL, vilket är vad som kommer att användas för TBARS-analysen.
      OBS: Att göra 35 mM CuCl2-stamlösningen i ättiksyra (pH = 4) är nödvändig för att förhindra utfällning av kopparhydroxid.
    11. Inkubera prover i en ugn vid 37 °C i 24 timmar och utför en TBARS-analys på varje prov som innehåller en slutlig volym på 100 μL.
    12. Upprepa steg 1.1.9 och 1.1.11 2x på separata dagar för att kontrollera reproducerbarheten av TBARS-analysen för HepG2-cellslysst.
  2. Lipoproteiner med låg densitet
    OBS: Vanligtvis innehåller förrenat LDL (Low Density Lipoprotein) en viss mängd EDTA. LDL-prover som används här innehåller 0,01% EDTA. EDTA kan hämma den in vitro Cu(II)-medierade oxidationen av LDL. Därför kan det vara nödvändigt att avlägsna EDTA från LDL-prover före experiment eller analys. Steg 1.2.1–1.2.5 beskriver den här processen.
    VARNING: Natriumhydroxid är frätande och orsakar irritation i hud och ögon. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
    1. Alikvot 24 μL från ett LDL-bestånd på 5,51 mg/ml (proteinkoncentration bestämd med modifierad Lowry-metod med BSA som standard) till lämpligt märkta 1 mL snap-cap polypropylenrör. Gör så många alikvoter som behövs och förvara vid 4 °C tills de används i oxidations- och/eller TBARS-analys.
    2. Förbered en 10 mM HEPES-buffert i 0,15 M NaCl justerad till pH = 7 med NaOH-pärlor: lös 4,39 g NaCl i 0,49 L vatten och tillsätt sedan 1,19 g HEPES. Lös upp väl med en omrörbar. Tillsätt natriumhydroxidpärlor tills pH-värdet är 7. Späd till 0,5 L med vatten. Förvara bufferten vid 4 °C och använd inom 3 månader.
    3. Tillsätt 476 μL av 10 mM HEPES-bufferten i 0,15 M NaCl (pH = 7) till de alikvoterade LDL-proverna för att få slutvolymen till 500 μL. Tillsätt utspädd LDL-prov till en 0,5 ml centrifugalspinnfilterenhet med en 100K molekylviktsavstängning.
    4. Spinnprover vid 14 000 x g i 10 minuter vid RT, vilket ger en slutlig återintentvolym på ca 30 μL. Rekonstituera prover i 480 μL av 10 mM HEPES-bufferten i 0,15 M NaCl (pH = 7) och snurra igen vid 14 000 x g i 10 min vid RT. Utför detta steg 2x för totalt fyra genomgångar.
    5. Placera filterenheten upp och ner i ett nytt 2 ml snap-cap polypropylenrör och centrifugera vid 1000 x g i 2 minuter för att samla LDL-prov (slutlig volym = ca 30 μL).
    6. Aliquotprov i lämpligt märkt 1 ml-rör och tillsätt 20 μL vatten till varje prov för att uppnå en slutlig volym på 50 μL.
    7. Beredning av 200 μM CuCl2-stamlösning i ättiksyra (pH = 4)
      1. Förbered ättiksyralösning (pH = 4): se steg 1.1.9.1.
      2. Förbered en 144 mM CuCl2-lagerlösning (se steg 1.1.9.2), sedan alikvot 5,5 μL från 144 mM CuCl2-beståndet och lös upp i en slutlig volym på 4 ml ättiksyra (pH = 4) för att göra 200 μM-lösningen.
    8. Aliquot 2,7 μL från 200 μM CuCl2-stamlösningen och tillsätt den till sex prover som innehåller 50 μL LDL för att uppnå en slutlig CuCl2-koncentration på ~10 μM. Tillsätt 2,7 μL från en ättiksyralösning (pH = 4) som inte innehåller CuCl2 till sex prover som innehåller 50 μL LDL som ska användas för kontrollerna.
    9. Inkubera LDL-prover i 2 timmar i en ugn vid 37 °C. Efter 2 timmar, för den slutliga volymen till 100 μL för varje prov med 10 mM HEPES-buffert i 0,15 M NaCl (pH = 7). Utför omedelbart en TBARS-analys.
    10. Upprepa steg 1.2.3–1.2.9 2x under två olika dagar för att testa reproducerbarheten hos TBARS-analysen.
  3. Mänskligt serum
    1. Från ett humant serumprov, gör alikvoter på 94 μL vardera till 2 ml snap-cap polypropylenrör och lagra prover vid -80 °C.
    2. Förbered en 35 mM CuCl2-stamlösning i ättiksyra (pH = 4): se steg 1.1.9.
    3. Alikvot 6 μL från CuCl2-stamlösningen och tillsätt den till sex prover som innehåller 94 μL humant serum för att göra en slutlig CuCl2-koncentration på ca 2 mM. Tillsätt 6 μL av en ättiksyralösning (pH = 4) som inte har CuCl2 till sex prover som innehåller 94 μL humant serum som ska användas som kontroller.
    4. Inkubera humana serumprover i 24 timmar i en ugn vid 37 °C och bestäm oxidationsnivåer med TBARS-analys (avsnitt 4).
    5. Upprepa steg 1.3.2–1.3.4 2x på två separata dagar för att bestämma reproducerbarheten hos TBARS-analysen.

2. Reagensberedning

VARNING: Tiobarbitursyra orsakar hud- och ögonirritation och kan vara skadligt vid inandning eller hudabsorption. Ättiksyra kan skada inre organ vid inandning. Förbered alla syralösningar i en rökhuv.

  1. Beredning av 8,1% (w/v) lösning för natriumdysulfat (SDS)
    1. Vikta ut 32,4 g SDS och lös upp i 350 ml DI-vatten i en bägare. Använd en magnetisk omrörning för att försiktigt lösa upp SDS och undvika att göra bubblor. Ta slutvolymen till 400 ml med DI-vatten och förvara SDS-lösningen på RT.
      OBS: Här förbereds överskott av 8,1% SDS-lösning; För 96 prover behövs dock endast cirka 20 ml av 8,1% SDS-lösningen. Förbered den här lösningen enligt antalet prover som analyseras.
  2. Beredning av 3,5 M natriumacetatbuffert (pH = 4)
    1. Späd 100 ml glaciär ättiksyra i 350 ml DI-vatten i en bägare. Använd en magnetrörsstång för att försiktigt lösa upp den.
    2. Förbered en 6,5 M NaOH-lösning med natriumhydroxidpärlor i vatten. Lös upp 13 g NaOH-pärlor i 40 ml DI-vatten och ta till en slutlig volym på 50 ml med DI-vatten.
    3. Tillsätt långsamt ca 46 ml av 6,5 M NaOH-lösningen till ättiksyralösningen medan du blandar med omrörningsstången (detta bör höja pH till 4, men bekräfta genom att långsamt tillsätta NaOH-lösningen medan du mäter med en pH-mätare).
    4. Ta den slutliga volymen till 500 ml med DI-vatten och förvara natriumacetatbufferten på RT.
  3. Beredning av 0,8% vattenlösning av tiobarbitursyra (justerad till pH = 4)
    OBS: I detta steg optimeras beredningen av tiobarbitursyra för stora volymer, eftersom ett stort antal prover kommer att analyseras (108 prover, exklusive standarderna). Förbered den här lösningen beroende på antalet prover som planeras för analys.
    1. Förbered en 5 M natriumhydroxidlösning med natriumhydroxidpärlor och vatten: lös upp 4 g natriumhydroxidpärlor i en slutlig volym av 20 ml vatten. Förvara i en plastbehållare. Denna lösning bör vara nyberedd för varje sats.
    2. Vikt 4 g tiobarbitursyra och tillsätt 450 ml DI-vatten. Använd en magnetrörsstång för att försiktigt lösa upp den.
      OBS: Denna lösning kommer så småningom att föras till en total volym på 500 ml.
    3. Vid upplösning av tiobarbitursyra med en omrörningsstång, tillsätt (långsamt och droppvis) ca 3 ml av 5 M NaOH-lösningen i steg om 100 μL. Efter tillsats av NaOH-lösningen börjar tiobarbitursyrapartiklarna att lösas upp.
    4. Om tiobarbitursyrapartiklarna fortfarande inte är helt upplösta, tillsätt mer av 5 M NaOH-lösningen i steg om 100 μL tills alla tiobarbituriska syrapartiklar är helt upplösta. För denna speciella lösningsvolym tillsätts totalt 4 ml av 5 M NaOH-lösningen för att helt lösa upp tiobarbituriska syrapartiklar.
      OBS: Vid denna koncentration löses inte tiobarbitursyra helt upp om inte pH-värdet är nästan 4.
    5. Sluta tillsätta NaOH efter att all tiobarbitursyra har lösts upp helt. Undvik att överskrida ett pH-pH på 4. Det slutliga pH-värdet kan verifieras genom att ta 1 μL från blandningen av tiobarbitursyralösning och placera den på pH-papper.
    6. Ta den slutliga volymen till 500 ml med DI-vatten och förvara vattenlösningen 0,8 % på tiajbitursyra på RT.

3. Malondialdehyd bis (dimetylacettal) standardprovpreparat

OBS: Malondialdehyd (MDA) är instabil och inte kommersiellt tillgänglig. Det finns dock olika kemiska former av MDA som är kommersiellt tillgängliga, såsom MDA tetrabutylammoniumsalt, MDA bis (dimetyl acetal) och MDA bis (dietyl acetal). Av dessa tre kemiska former används MDA bis (dimetylacettal) här, eftersom en majoritet av studierna använder samma standard21,22. Om du väljer att använda de andra två kemiska formerna av MDA bör deras lämplighet valideras i förväg.

  1. Förbered en 550 μM MDA bis(dimetylacettal) buljonglösning genom att späda ut 92 μL ren MDA bis (dimetylacatal) i 1 L DI-vatten. Använd en magnetisk omrörning för att blanda lösningen noggrant i 10 min. Förvara lösningen vid 4 °C och använd den inom 1 månad.
  2. Förbered en 200 μM MDA bis(dimetylacettal) genom att späda ut 726 μL från 550 μM MDA bis(dimetylacettal) i 1274 μL DI-vatten. Denna 200 μM MDA bis(dimetyl acetal) lösning bör beredas färsk varje gång en TBARS-analys utförs.
  3. Standard kurvberedning: ta åtta 2 mL snap-cap polypropylenrör och märka dem med bokstäverna A till H. Tillsätt MDA bis (dimetylacatal) från 200 μM-beståndet och späd i vatten enligt beskrivningen i tabell 1.
  4. Ta åtta glasrör (13 mm x 100 mm) och märk dem A-H och tillsätt sedan 100 μL standard till motsvarande rör. Utför sex replikat för den tomma standarden (exempel A) för att beräkna gränserna för detektion av TBARS-analysen.
    OBS: Protokollet kan pausas här i högst 1 h.

4. TBARS-analys

OBS: När TBARS-analysen har startats ska den vara klar utan att stoppas.

  1. Ta så många glasrör som behövs för att antalet prover ska analyseras och märka dem med namnen på proverna. Tillsätt sedan 100 μL av varje förberett prov (enligt beskrivningen ovan) till varje glasrör.
  2. Tillsätt 200 μL 8,1% SDS till varje prov och standard och snurra försiktigt glasröret i en cirkulär rörelse för att blanda provet.
  3. Tillsätt 1,5 ml natriumacetatbuffert på 3,5 M (pH = 4) till varje prov och standard.
  4. Tillsätt 1,5 ml vattenhaltig 0,8 % tiobarbitursyralösning (pH = 4) till varje prov och standard.
  5. För den slutliga volymen till 4 ml för varje prov och standard genom att tillsätta 700 μL DI-vatten.
  6. Håll tätt varje glasrör och inkubera i ett värmeblock inställt på 95 °C i 1 timme. Täck glasrören med aluminiumfolie för att förhindra kondens på toppen av rören.
  7. Ta bort glasrören från värmeblocket och inkubera på is i 30 minuter.
  8. Centrifugprover och standarder vid 1500 x g i 10 min vid 4 °C. Efter centrifugering, förvara glasrören som innehåller proverna och standarderna vid RT.
    OBS: Om proverna hålls på is eller vid 4 °C fälls hela provet eller standarden ut.
  9. Omedelbart efter centrifugering, alikvot 150 μL supernatant från varje rör och placera i en separat brunn på en 96 brunnsplatta.
  10. Ta bort eventuella bubblor från varje brunn med hjälp av en pipettspets.
    OBS: Förekomsten av bubblor kommer att ge inkonsekventa absorbansavläsningar, vilket leder till hög analysimprecision.
  11. Läs absorbanser vid 532 nm. Subtrahera den genomsnittliga absorbansavläsningen av de tomma proverna från alla andra absorbansavläsningar.
  12. Skapa en standardkurva genom att rita de tom subtraherade absorbansavläsningarna vid 532 nm jämfört med den kända koncentrationen för varje standard. Passa datapunkterna med linjär regression. Beräkna okända provkoncentrationer med hjälp av ekvationen för den linjära regressionslinjen som erhålls från standardkurvan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under sura förhållanden (pH = 4) och vid 95 °C ger malondialdehyd (MDA) bis (dimetylacetal) MDA23. MDA och närbesläktade kemiska kongener reagerar med två molekyler av tiobarbitursyra (TBA) för att producera föreningar som kallas tiobarbituriska syrareaktiva ämnen (TBARS), som ger en rödrosa färg och har en absorbans λmax vid 532 nm (figur 1, figur 2). Med MDA bis (dimetylacatal) som standard genererades standardkurvor (figur 3, tabell 1) för att fastställa gränserna för detektion och känslighet för analysen och oxidationsnivåerna i tre olika biologiska prover. Totalt nio TBARS-analyser utfördes för att fastställa oxidationsnivåerna i de tre olika proverna under olika dagar. Därför genererades totalt nio standardkurvor, vilket framgår av figur 3. Minsta kvadratprocedur24 användes för att bestämma standardavvikelserna för lutningen och y-intercept, som var 8,67 x 10-6 respektive 5,66 x 10-4.

Gränsvärdena för detektion av TBARS-analysen fastställdes enligt standardanalysförfaranden25 genom mätning av absorbanser av de tomma proverna (sex experimentella replikat med två tekniska replikat per experimentell replikat) under tre olika dagar. Minsta särskiljbara analytiska signal (Sm) bestämdes genom att summera medelvärdet av den tomma signalen (Sbl) plus en multipel k av standardavvikelsen för det tomma (ksbl), där k = 3. Det vill säga Sm = Sbl+ ksbl. Med hjälp av Sm och lutningen på standardkurvan (m) beräknades detektionsgränsen (cm) som cm = (Sm - Sbl)/m. De resulterande uppgifterna från de tomma proverna under tre olika dagar visar att den minsta koncentration av TBARS-ämne som behövs för att ge en påvisbar icke-brusabsorberingssignal är 1,1 μM (tabell 2). Känsligheten hos TBARS-analysen är ca 0,00160 absorbansenheter/μM, vilket är analysens förmåga att skilja skillnader i analytkoncentration (tabell 2).

För att illustrera tillämpligheten av TBARS-analysen för att upptäcka förändringar i lipidperoxidation i olika biologiska matriser, cucl2 användes för att inducera in vitro oxidation av humant serum, HepG2 cell lysates och låg densitet lipoproteiner. Dessa biologiska prover som används här är prototyper av biologiska matriser. Till exempel, baserat på de resultat som presenteras här för HepG2-celllyslystna, är det rimligt att förvänta sig att denna analys kommer att fungera med andra typer av cell lysate; Det skulle dock behöva valideras analytiskt för detta ändamål. Av de tre biologiska matriser som används här är det också vanligt att vissa typer av prover uppvisar låga endogena koncentrationer av TBARS. TBARS för HepG2-cellslystna som inte behandlades med CuCl2 var till exempel strax över gränsen för detektion av analysen (ca 2 μM; Figur 4). Som man kan förvänta sig i närvaro av låga signal-till-brus-förhållanden är standardavvikelsen och variationskoefficienten för just detta prov relativt hög (tabell 3). Men när signalen ökar till följd av Cu(II) medierad oxidation blir variationskoefficienten lägre. I allmänhet, när absorbansen ökar över detektionsgränsen, förbättras analysens reproducerbarhet (tabell 3).

I detta protokoll fanns det ingen önskan att använda antioxidanter för att maskera in vitro Cu(II)-medierad oxidation av biologiska prover. Kommersiellt förberedda LDL (Low Density Lipoprotein) kan innehålla 0,01% EDTA. EDTA förhindrar Cu(II)-medierad oxidation av LDL men inte nödvändigtvis andra metallmedierade oxidationsreaktioner26,27. En TBARS-analys utfördes på LDL-prover som innehöll EDTA, och nivåerna av TBARS ändrades inte mellan de Cu(II)-behandlade och obehandlade LDL-proverna (figur 5A). Efter att EDTA avlägsnats genom spinnfiltrering (se steg 1.2.3–1.2.5) genomgick LDL emellertid Cu(II)-medierad oxidation, vilket detekterades av TBARS-analysen (figur 5B).

Det normala intervallet av lipidperoxidationsprodukter i humant serum från friska donatorer uttryckt i MDA är mellan 1,80–3,94 μM28. För att illustrera det dynamiska området för TBARS-analysen i humant serum tillsattes en koncentration av 2 mM Cu(II) joner till proverna, följt av inkubation för 24 h vid 37 °C. Detta resulterade i en 6x-7x ökning av TBARS (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Tiobarbituriska sura reaktiva ämnen analys schematiska.
Hundra mikroliter av prov eller standard tillsätts till ett 13 mm x 100 mm glasrör, följt av tillsats av tiobarbituriska syrareaktiva ämnen (TBARS) reagenser. Efter inkubation vid 95 °C i 1 tim inkuberas prover och standarder i is i 30 minuter och centrifugeras sedan vid 1 500 x g i 10 minuter vid 4 °C. Ett hundra femtio mikroliter prov eller standard supernatant laddas på en 96 brunnsplatta, och absorbansen mäts vid 532 nm. Okänd provkoncentration beräknas med hjälp av standardkurvans ekvation. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Arketyp tiobarbitursyra reaktiva ämnen reaktion.
Malondialdehyd bis (dimetylacettal) ger malondialdehyd under syrakatalyserad hydrolys1. Frisatt malondialdehyd (MDA) reagerar sedan med två molekyler av 2-tiobarbitursyra (TBA) (pH = 4 och 95 °C) för att bilda MDA-TBA2-adduat som ger en rödrosa färg och kan mätas spektrofotometriskt vid 532 nm. Eftersom andra molekyler förutom MDA som härrör från oxiderade lipider också kan reagera med TBA, kallas absorbansmätningen vid 532 nm helt enkelt som ett mått på tiobarbitursyrareaktiva ämnen, eller TBARS. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Malondialdehyd bis (dimetylacettal) kolorimetriska standardkurvor.
Figuren visar nio standardkurvor som skapats på olika dagar. Vissa punkter överlappar varandra och kan inte särskiljas från varandra. Malondialdehyd bis (dimetylacettal) befästes till kalibratorprover vid 0, 2, 5, 5, 10, 20, 40, 80 och 160 μM (enligt tabell 1; n = 1 per koncentrationspunkt per dag). Absorbansen mättes till 532 nm, med den genomsnittliga absorbansen av de tomma proverna subtraherade från alla mätningar i det partiet, inklusive okända. Varje dag användes ekvationen som genererades av minsta kvadrat linjär regression för att bestämma TBARS i biologiska prover. För alla nio standardkurvor tillsammans var standardavvikelsen för lutningen 8,67 x 10-6, och standardavvikelsen för y-intercept var 5,66 x 10-4. Standardavvikelserna för lutningen och y-intercept beräknades med hjälp av minsta kvadratprocedur24. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Oxidation i HepG2 lysates detekteras av TBARS.
Sex HepG2 cell lysate prover inkuberades med 2 mM CuCl2 [HepG2 cell lysate + 2 mM Cu(II)] och sex prover inkuberades i en lösning utan CuCl2 (HepG2 cell lysate) för 24 h vid 37 °C. Efter inkubation utfördes TBARS-analysen på de 12 proverna. Denna procedur upprepades 2x för totalt tre olika dagar. Felstaplar representerar SD. Asterisk anger statistiskt signifikanta skillnader mellan kontroll och Cu(II)-behandlade lysater (s < 0,001). Statistisk signifikans fastställdes med hjälp av ett Mann Whitney U-test i GraphPad. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Oxidation av lipoprotein med låg densitet som detekteras av TBARS.
A) TBARS-analys utförd i LDL-prover som innehåller 0,01% EDTA. Sex LDL-prover inkuberades med 10 μM CuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)], och sex prover inkuberades med en kontrolllösning utan CuCl2 tillsatt (inbyggt LDL) i 2 timmar vid 37 °C. Sedan utfördes en TBARS-analys på de 12 proverna. "ns" representerar ingen statistisk signifikans. B) LDL spinnfiltrerades med hjälp av en centrifugalspinnfilteranordning för att avlägsna EDTA. Därefter utfördes inkubation med och utan tillsatt Cu(II) igen enligt beskrivningen för (A). TBARS-analysen utfördes omedelbart efteråt. Samma förfarande upprepades 2x i totalt 3 dagar. Felstaplar representerar SD. Asterisk anger statistiskt signifikanta skillnader mellan kontroll och Cu(II)-behandlade LDL-prover (s < 0,001). Statistisk signifikans fastställdes med hjälp av Mann Whitney U-testet i GraphPad. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Lipidperoxidation i humana serumprover som detekteras av TBARS.
Sex humana serumprover inkuberades med 2 mM CuCl2 [serum + 2 mM Cu(II)], och sex prover inkuberades med en lösning som inte hade någon tillsatt CuCl2 (normalt serum) för 24 h vid 37 °C. Efter inkubation utfördes TBARS-analysen på de 12 proverna. Denna procedur upprepades på två ytterligare dagar. Felstaplar representerar SD. Asterisk indikerar statistiskt signifikanta skillnader mellan kontroll och Cu(II)-behandlade serumprover (s < 0,001). Statistisk signifikans fastställdes med hjälp av Mann Whitney U-testet i GraphPad. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Glasrör 200 μM MDA bis (dimetyl acetal) (μL) Vatten (μL) MDA bis (dimetylacettal) Slutlig koncentration (μM)
Aa 0 1000 0
B 12.5 987.5 2.5
C 25 975 5
D 50 950 10
E 100 900 20
F 200 800 40
G 400 600 80
H 800 200 160

Tabell 1: Standardprovpreparat av malondialdehyd (dimetylacasal). Från den nyberedda 200 μM malondialdehyd bis (dimetylacatal) alikvoterade de föreslagna volymerna för att nå den slutliga koncentrationen för standardkurvan. Det rekommenderas att utföra minst sex replikat av det tomma provet (A) per dag för att bestämma gränserna för detektion av metoden.

Dag Absorbans Sblb Smc Känslighet (absorbansenheter/μM)d cm (μM)e
1 (n = 6) 0.0412 0.000612 0.0430 0.00160 1.14
2 (n = 6) 0.0415 0.000632 0.0433 0.00160 1.18
3 (n = 6) 0.0413 0.000605 0.0431 0.00160 1.13
Alla tre dagarna (n = 18) 0.0413 0.000589 0.0431 0.00160 1.10
a Absorbans av de tomma proverna på tre olika dagar med 6 replikat per dag.
bSbl = Standardavvikelse för absorbansen av de tomma proverna.
cSm = Minsta särskiljbara analytiska signal, som bestämdes genom att summera medelvärdet av den tomma signalen (Sbl) plus en multipel k av standardavvikelsen för blindvärdet (ksbl), där k = 3. Det vill ha; Sm = Sbl + ksbl.
d Känslighet för TBARS-analysen, som är standardkurvans lutning.
ecm = Detektionsgränser, som beräknades som cm = (Sm - Sbl)▼m, där m = standardkurvans lutning.

Tabell 2: Detektionsgränser för TBARS-analysen.

Lipoprotein med låg densitet Mänskligt serum HepG2 Cell Lysate
Dag % CV Dag % CV Dag % CV
1 (n = 6) 5.6 1 (n = 6) 7.9 1 (n = 6) 12.6
2 (n = 6) 5.4 2 (n = 6) 7.2 2 (n = 6) 15.8
3 (n = 6) 3.9 3 (n = 6) 7.0 3 (n = 6) 17.7
Alla tre dagarna (n = 18)a 7.4 Alla tre dagarna (n = 18) 9.8 Alla tre dagarna (n = 18) 15.5b
Med 10 μM CuCl2 Med 2 mM CuCl2 Med 2 mM CuCl2
1 (n = 6) 4.5 1 (n = 6) 6.0 1 (n = 6) 5.8
2 (n = 6) 6.5 2 (n = 6) 4.3 2 (n = 6) 6.0
3 (n = 6) 6.7 3 (n = 6) 6.2 3 (n = 6) 8.0
Alla tre dagarna (n = 18) 6.1 Alla tre dagarna (n = 18) 5.6 Alla tre dagarna (n = 18) 7.3
a Interday precision beräknades genom att samla data från alla tre dagarna.
b Precisionen var begränsad på grund av att resultaten var nära analysen LOD.

Tabell 3: Analytisk reproducerbarhet av TBARS i tre olika biologiska prover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trots sina begränsningar1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 och brist på lämplighet för jämförelse mellan laboratorier, är TBARS-analysen en av de äldsta29,30 men mest använda analyser för att mäta oxidativ stress i biologiska prover. TBARS-analysen är en enkel metod som bara tar ca 2 timmar att utföra, när alla nödvändiga reagenser har förberetts. Här har vi beskrivit i detalj hur denna analys, inklusive standardkurva, kan utföras många gånger på ett ekonomiskt sätt (cirka $ 3.50 USD för 96 prover), utan att behöva köpa ett dyrt kit för varje parti prover.

Alla steg i analysen är kritiska, men det finns några steg som kräver extra uppmärksamhet. Till exempel bör pH för tiobarbitursyra inte vara högre än 4. Försiktighetsåtgärder bör vidtas vid tillsats av natriumhydroxidlösningen till tiobarbitursyran och undvika att få ett pH-pH på mer än 4. En sur miljö krävs för att reaktionen mellan MDA och TBA ska uppstå, och MDA-standarden frigörs från MDA bis (dimetylacatal) genom syrakatalyserad hydrolys. Därför kan ett högt pH leda till oförutsägbara och mycket varierande resultat31.

Även om detta kan vara uppenbart för vissa läsare, är det också viktigt att ta bort eventuella bubblor i 96-brunnsplattan innan du mäter absorbansen. Förekomsten av bubblor kommer att ge höga absorbansvärden och skillnader mellan replikat, vilket leder till en hög andel cv: n. Dessutom, efter 1 h inkubation vid 95 °C, bör prover inte inkuberas längre än 30 min på is, eftersom detta kommer att fälla ut hela provet, och insamling av en fällningsfri supernatant kommer att vara svår att uppnå. Noterbart är att det inte finns några bra stopppunkter när TBARS-analysen har startats. Den bör slutföras när den har initierats. Slutligen finns det många möjliga metodvariationer som kan tillämpas på denna analys. Det allmänna protokollet som beskrivs här kan ytterligare anpassas (och valideras) för specifika tillämpningar, inklusive de där tillsats av radikala asätare eller andra typer av antioxidanter före analys krävs.

Även om TBARS-analysen är populär, är det viktigt att inse att det inte är en molekylärt specifik analys. Många kemiskt reaktiva kolylhaltiga organiska molekyler, inklusive de som härrör från oxiderade biomolekyler andra än lipider, kan reagera med TBA och räknas därmed som TBARS1,32,33,34. Dessutom blir gränserna för detektion av absorbansbaserad TBARS-analys inte mycket bättre än ca 1,1 μM, enligt denna metod. Gränserna för detektion kan dock förbättras med hjälp av andra identifieringsmetoder. Till exempel erbjuder spektrofluorometri med excitation vid 520 nm och utsläpp vid 550 nm högre känslighet och bättre gränser för detektion, som tidigare föreslagits av Jo och Ahn35. Masspektrometribaserade metoder kan dramatiskt förbättra både specificitet och gränser för detektion. Till exempel har en GC-MS/MS med elektronfångstdedeativ jonkemisk joniseringsmetod (ECNICI) använts för att detektera pentafluorobenzylderivatet av MDA i humant serum och urinprov, med gränsvärden för detektion av 2 x 10-18 mol MDA på kolumn36. Här förbättrar den kromatografiska separationen, i kombination med tandemmasspektrometri, också analysens molekylära specificitet dramatiskt.

I likhet med andra mätningar av oxidativa processer inom biologiska prover37,38 är dock preanalytisk provhantering avgörande för resultatet av TBARS-mätningar. Till exempel resulterar blodplasmalagring vid -20 °C i långsamma men dramatiska ökningar av MDA-koncentrationerna39,40. Exponering av biologiska prover för tinade eller till och med delvis tinade förhållanden under allt annat än en minimal tid bör därför antas orsaka artefaktuell höjning av TBARS-nivåerna. Detta innebär att även en blygsam variation i den preanalytiska hanteringen och lagringen av biospecimens som ska jämföras med hjälp av TBARS-analysen måste undvikas.

Med tanke på dessa varningar som rör preanalytisk variabilitet samt begränsad känslighet och specificitet rekommenderas att absorbansbaserad TBARS-analys endast används för allmän bedömning inom laboratoriet eller intervallsökningsexperiment. Dessa tillämpningar omfattar studier där relativa TBARS-nivåer jämförs direkt mellan en eller flera grupper av biologiskt liknande prover som bearbetas eller lagras tillsammans och separeras av endast en enda variabel som är helt kontrollerad av forskare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Forskningen som rapporterades här stöddes delvis av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under tilldelning nr. R33 CA217702 och initiativet för att maximera studentutveckling (IMSD) programmet. Innehållet är endast författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella synen på National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L VWR, PA 101642--262 cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube Corning, NY CLS430897 General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile Thermo Fisher Scientific, MA 280895 To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device Fisher Scientific, NH UFC510024 LDL purification
Caps for glass tubes Thermo Fisher Scientific, MA 14-930-15D for TBARS assay
Copper II Chloride SIGMA, MO 222011-250G to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) VWR, PA 53283-800 for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ATCC, VA HB-8065 HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL eppendorf, NY 22363204 General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Genesee Sceitific, CA 22363352 General material
Fetal Bovine Serum US Source Omega Scientific, CA FB-11 for cell culture
Glacial Acetic Acid SIGMA, MO 27225-1L-R TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific, MA 87786 cell lysis reagent
HEPES SIGMA, MO H3375-250G LDL solvent
HepG2 Cells ATCC, VA HB-8065 Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl) Fisher Scientific, NH A144-212 cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge Thermo Scientific, MA 75002431 General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma Athens Research & Technology, GA 12-16-120412 Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment VWR, PA 58948-025 General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) SIGMA, MO 8207560250 TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer Fisher Scientific, NH 51119200 To measure absorbance
NP-40 EMD Millipore Corp, MA 492016-100ML cell lysis reagent
Sodium Chloride SIGMA, MO S7653-1KG cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA, MO 436143-100G TBARS Reagent
Sodium hydroxide SIGMA, MO 367176-2.5KG TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific, MA SC250EXP For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap USA Scientific, FL 658175 cell culture
Thiobarbituric Acid SIGMA, MO T5500-100G TBARS Reagent
TRIS base Fluka, GA 93362 cell lysis reagent
Trypsin (1x) VWR, PA 16777-166 To detach HepG2 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

Tags

Kemi nummer 159 tiobarbituriska syrareaktiva ämnen TBARS oxidation lipidperoxidation malondialdehyd MDA tiobarbitursyra TBA oxidativ stress
Utvärdering av oxidativ stress i biologiska prover med hjälp av den tiobarbituriska syrareaktiva ämnena
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. … More

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. R. Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay. J. Vis. Exp. (159), e61122, doi:10.3791/61122 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter