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Chemistry

Valutazione dello stress ossidativo in campioni biologici utilizzando il test delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61122
Automatic Translation
1,
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Summary

L'obiettivo del test delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico è quello di valutare lo stress ossidativo in campioni biologici misurando la produzione di prodotti di perossidazione lipidica, principalmente malondialdeide, utilizzando la spettrofotometria a lunghezza d'onda visibile a 532 nm. Il metodo qui descritto può essere applicato al siero umano, ai lisati cellulari e alle lipoproteine a bassa densità.

Abstract

Nonostante la sua limitata specificità analitica e robustezza, il saggio delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS) è stato ampiamente utilizzato come metrica generica della perossidazione lipidica nei fluidi biologici. È spesso considerato un buon indicatore dei livelli di stress ossidativo all'interno di un campione biologico, a condizione che il campione sia stato correttamente maneggiato e conservato. Il test prevede la reazione di prodotti di perossidazione lipidica, principalmente malondialdeide (MDA), con acido tiobarbiturico (TBA), che porta alla formazione di addotti MDA-TBA2 chiamati TBARS. TBARS produce un colore rosso-rosa che può essere misurato spettrofotometricamente a 532 nm. Il test TBARS viene eseguito in condizioni acide (pH = 4) e a 95 °C. L'MDA puro è instabile, ma queste condizioni consentono il rilascio di MDA da MDA bis (dimetil acetale), che viene utilizzato come standard analitico in questo metodo. Il test TBARS è un metodo semplice che può essere completato in circa 2 ore. La preparazione dei reagenti di analisi è descritta in dettaglio qui. I ricercatori attenti al budget possono utilizzare questi reagenti per più esperimenti a basso costo piuttosto che acquistare un costoso kit di analisi TBARS che consente solo la costruzione di una singola curva standard (e quindi può essere utilizzato solo per un esperimento). L'applicabilità di questo test TBARS è dimostrata nel siero umano, nelle lipoproteine a bassa densità e nei lisati cellulari. Il test è coerente e riproducibile e possono essere raggiunti limiti di rilevazione di 1,1 μM. Vengono fornite raccomandazioni per l'uso e l'interpretazione del test spettrofotometrico TBARS.

Introduction

La perossidazione lipidica è un processo in cui i radicali liberi, come le specie reattive dell'ossigeno e le specie reattive dell'azoto, attaccano i doppi legami carbonio-carbonio nei lipidi, un processo che comporta l'estrazione di un idrogeno da un carbonio e l'inserimento di una molecola di ossigeno. Questo processo porta a una miscela di prodotti complessi tra cui radicali lipidici perossilici e idroperossidi come prodotti primari, nonché malondialdeide (MDA) e 4-idrossinonenale come prodotti secondari predominanti1.

MDA è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica come marcatore di perossidazione lipidica a causa della sua facile reazione con l'acido tiobarbiturico (TBA). La reazione porta alla formazione di MDA-TBA2, un coniugato che assorbe nello spettro visibile a 532 nm e produce un colore rosso-rosa2. Altre molecole derivate dalla perossidazione lipidica oltre all'MDA possono anche reagire con il TBA e assorbire la luce a 532 nm, contribuendo al segnale di assorbimento complessivo che viene misurato. Allo stesso modo, MDA può reagire con la maggior parte delle altre principali classi di biomolecole, limitando potenzialmente la sua accessibilità per la reazione con TBA3,4. Come tale, questo test tradizionale è semplicemente considerato per misurare "sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico" o TBARS5.

Se applicato e interpretato correttamente, il test TBARS è generalmente considerato un buon indicatore dei livelli complessivi di stress ossidativo in un campione biologico6. Sfortunatamente, come documentato da Khoubnasabjafari e altri, il test TBARS è spesso condotto e interpretato in modi che facilitano conclusioni dubbie3,4,7,8,9,10,11. Le cause di ciò sono radicate principalmente nelle variabili pre-analitiche correlate al campione e nella mancanza di robustezza del saggio che vieta variazioni apparentemente minori nel protocollo del saggio senza cambiamenti sostanziali nei risultati del test1,7,12,13.

Le variabili preanalitiche correlate alla manipolazione e alla conservazione dei biocampioni (ad esempio, plasma sanguigno mantenuto temporaneamente a -20 °C)14,15 possono avere un impatto importante sui risultati del test TBARS16,17; tanto che i risultati del test TBARS non dovrebbero essere confrontati tra diversi laboratori a meno che non siano garantiti da espliciti dati di convalida analitica interlaboratorio. Questa raccomandazione è simile a come i western blots sono comunemente usati e interpretati. I confronti delle densità di banda sono validi per gli studi all'interno del blot e forse all'interno del laboratorio, ma il confronto delle densità di banda tra i laboratori è generalmente considerato una pratica non valida.

Alcuni ricercatori hanno suggerito che l'MDA misurato dal test TBARS semplicemente non soddisfa i criteri analitici o clinici richiesti da un biomarcatore accettabile3,9,10,18,19. Infatti, se il saggio non fosse stato sviluppato oltre 50 anni fa, probabilmente non avrebbe ottenuto l'uso diffuso e la tacita accettabilità che ha oggi. Sebbene esistano altri saggi con maggiore sensibilità analitica, specificità e robustezza utilizzati per determinare lo stress ossidativo, il saggio TBARS basato sull'assorbanza a 532 nm rimane di gran lunga uno dei saggi più comunemente usati per la determinazione della perossidazione lipidica20 e quindi la valutazione dello stress ossidativo.

Il test TBARS può essere trovato solo come un kit costoso (oltre 400 dollari USA), in cui le istruzioni non forniscono informazioni dettagliate sulla maggior parte delle concentrazioni dei reagenti utilizzati. Inoltre, i reagenti forniti possono essere utilizzati solo per un esperimento, perché è possibile realizzare una sola curva standard colorimetrica per kit. Questo può essere problematico per i ricercatori che intendono determinare i livelli di ossidazione all'interno di pochi campioni in diversi punti temporali, perché la stessa curva standard non può essere utilizzata più volte. Quindi, è necessario acquistare più kit per più esperimenti. Attualmente, a meno che non venga acquistato un kit costoso, non è disponibile un protocollo dettagliato su come eseguire un test TBARS. Alcuni ricercatori in passato hanno vagamente descritto come eseguire un test TBARS21,22, ma né un protocollo completamente dettagliato né un video completo su come condurre il test TBARS senza un kit costoso è disponibile in letteratura.

Qui riportiamo una metodologia dettagliata e convalidata analiticamente per lo scopo su come eseguire un test TBARS in modo semplice, riproducibile ed economico. I cambiamenti nella perossidazione lipidica del siero umano, dei lisati HepG2 e delle lipoproteine a bassa densità dopo il trattamento con ioni Cu(II) sono dimostrati come applicazioni illustrative per il test TBARS. I risultati dimostrano che questo test TBARS è coerente e riproducibile su base giornaliera.

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Protocol

I campioni di siero umano sono stati ottenuti da volontari consenzienti sotto l'approvazione dell'IRB e secondo i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki. I campioni sono stati codificati e de-identificati prima del trasferimento al laboratorio di analisi.

1. Preparazione del campione

  1. Lisati di cellule HepG2
    1. Semina circa 10 x 106 cellule HepG2 per pallone in 16 palloni T75 con 14 ml di emEM media integrati con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e coltiva le cellule per 2 giorni.
    2. Preparare il tampone RIPA: in un tubo da 50 mL, aggiungere 1,5 mL di 5 M NaCl, 2,5 mL di 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL di reagente NP-40, quindi portare il volume finale a 50 mL con acqua DI.
    3. Preparare il tampone di lisi: aliquota 20 mL di tampone RIPA in un tubo da 50 mL e aggiungere 200 μL di una soluzione inibitore della proteasi 100x per inibire la degradazione delle proteine e dei lipidi. Conservare a 4 °C.
      NOTA: il tampone di lisi è compatibile con i reagenti TBARS e non interferisce con l'assorbanza a 532 nm. Se si prevede di utilizzare un tampone di lisi diverso o di aggiungere ingredienti aggiuntivi al tampone di lisi, è necessario eseguire studi preliminari di convalida per verificare che i componenti del tampone di lisi siano compatibili con il test TBARS.
    4. Rimuovere i fluidi contenenti il 10% di FBS e lavare le celle 2x con 5 ml di PBS freddo e sterile 1x.
    5. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi ai palloni T75 contenenti le cellule e incubarli per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) con un vortice costante per garantire che il tampone sia ben distribuito.
    6. Raccogliere lisati in tubi di polipropilene a tappo a scatto da 2 mL opportunamente etichettati e incubare sul ghiaccio per 10 minuti.
    7. Ruotare i lisati a 5.000 x g per 10 minuti a RT per raccogliere i detriti cellulari e aspirare i supernatanti in un singolo tubo da 15 ml.
    8. Concentrare il surnatante di lisato cellulare quattro volte utilizzando uno Speed Vac a 50 °C e 3 mbar e fare aliquote di 94 μL ciascuna in tubi di polipropilene a tappo a scatto da 2 mL. Conservare i campioni a -80 °C fino a quando non vengono utilizzati per l'ossidazione in vitro e/o il test TBARS.
      NOTA: Per evitare di concentrare il surnatante di lisato cellulare, le cellule possono anche essere staccate usando 3 ml di 1x tripsina, neutralizzate con 6 mL di media e lavate 2x con 5 mL di PBS freddo. I pellet cellulari possono quindi essere ricostituiti in 250 μL di tampone di lisi e possono quindi essere eseguiti i passaggi 1.1.6 e 1.1.7.
    9. Preparare una soluzione madre di CuCl2 da 35 mM in acido acetico (pH = 4).
      1. Preparare la soluzione di acido acetico (pH = 4): diluire 1 μL di acido acetico glaciale in 100 ml di acqua DI (il pH dovrebbe essere di circa 4 ma confermarlo con un pHmetro). Aggiungere più acqua o acido acetico per regolare il pH a 4.
      2. Pesare circa 0,1936 g di cloruro di rame II e sciogliere in 10 ml della soluzione di acido acetico (pH = 4) per formare un brodo di CuCl2 da 144 mM. Aliquota 490 μL da questa soluzione e aggiungere a 1.510 μL di acido acetico (pH = 4) per ottenere una soluzione di CuCl2 da 35 mM.
    10. Aliquota 6 μL dalla soluzione madre cuCl2 da 35 mM e aggiungerla a sei campioni contenenti 94 μL di lisato cellulare per ottenere una concentrazione finale di CuCl2 di circa 2 mM. Aggiungere 6 μL di una soluzione di acido acetico (pH = 4) che non ha CuCl2 a sei campioni contenenti 94 μL di lisati cellulari da utilizzare come controlli. Il volume finale di lisato cellulare dovrebbe essere di 100 μL, che è quello che verrà utilizzato per il test TBARS.
      NOTA: La produzione della soluzione madre cuCl2 da 35 mM in acido acetico (pH = 4) è necessaria per evitare la precipitazione dell'idrossido di rame.
    11. Incubare i campioni in un forno a 37 °C per 24 ore ed eseguire un saggio TBARS su ciascun campione contenente un volume finale di 100 μL.
    12. Ripetere i passaggi 1.1.9 e 1.1.11 2x in giorni separati per verificare la riproducibilità del test TBARS per i lisati cellulari HepG2.
  2. Lipoproteine a bassa densità
    NOTA: In genere, la lipoproteina a bassa densità (LDL) pre-purificata contiene una certa quantità di EDTA. I campioni LDL utilizzati qui contengono lo 0,01% di EDTA. L'EDTA può inibire l'ossidazione in vitro mediata da Cu(II) delle LDL. Quindi, potrebbe essere necessario rimuovere EDTA dai campioni LDL prima di esperimenti o analisi. I passaggi 1.2.1–1.2.5 descrivono questo processo.
    ATTENZIONE: l'idrossido di sodio è corrosivo e provoca irritazione alla pelle e agli occhi. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale.
    1. Aliquota 24 μL da uno stock di LDL da 5,51 mg/mL (concentrazione proteica determinata con metodo Lowry modificato utilizzando BSA come standard) in tubi di polipropilene a tappo a scatto da 1 mL opportunamente etichettati. Effettuare tutte le aliquote necessarie e conservare a 4 °C fino all'uso nel test di ossidazione e/o TBARS.
    2. Preparare un tampone HEPES da 10 mM in 0,15 M NaCl regolato a pH = 7 con perline NaOH: sciogliere 4,39 g di NaCl in 0,49 L di acqua, quindi aggiungere 1,19 g di HEPES. Sciogliere bene con una barra di agitazione. Aggiungere perline di idrossido di sodio fino a quando il pH è 7. Diluire a 0,5 L con acqua. Conservare il tampone a 4 °C e utilizzare entro 3 mesi.
    3. Aggiungere 476 μL del tampone HEPES da 10 mM in 0,15 M NaCl (pH = 7) ai campioni LDL aliquotati per portare il volume finale a 500 μL. Aggiungere un campione LDL diluito a un dispositivo filtro centrifugo da 0,5 mL con un taglio di peso molecolare di 100K.
    4. Centrifuga i campioni a 14.000 x g per 10 minuti a RT, lasciando un volume finale di ripetizione di circa 30 μL. Ricostituire i campioni in 480 μL del tampone HEPES da 10 mM in 0,15 M NaCl (pH = 7) e ruotare nuovamente a 14.000 x g per 10 minuti a RT. Eseguire questa fase 2 volte per un totale di quattro spin-through.
    5. Posizionare il dispositivo filtrante capovolto in un nuovo tubo di polipropilene a scatto da 2 mL e centrifugare a 1000 x g per 2 minuti per raccogliere il campione LDL (volume finale = circa 30 μL).
    6. Aliquotare il campione in un tubo da 1 mL opportunamente etichettato e aggiungere 20 μL di acqua a ciascun campione per ottenere un volume finale di 50 μL.
    7. Preparazione di soluzione madre cuCl2 da 200 μM in acido acetico (pH = 4)
      1. Preparare la soluzione di acido acetico (pH = 4): vedere il punto 1.1.9.1.
      2. Preparare una soluzione madre cuCl2 da 144 mM (vedere punto 1.1.9.2), quindi aliquotare 5,5 μL dal brodo CuCl2 da 144 mM e sciogliere in un volume finale di 4 mL di acido acetico (pH = 4) per ottenere la soluzione da 200 μM.
    8. Aliquota 2,7 μL dalla soluzione madre CuCl2 da 200 μM e aggiungerla a sei campioni contenenti 50 μL di LDL per ottenere una concentrazione finale di CuCl2 di ~10 μM. Aggiungere 2,7 μL da una soluzione di acido acetico (pH = 4) che non contiene CuCl2 a sei campioni contenenti 50 μL di LDL da utilizzare per i controlli.
    9. Incubare campioni LDL per 2 ore in forno a 37 °C. Dopo 2 ore, portare il volume finale a 100 μL per ogni campione con tampone HEPES da 10 mM in 0,15 M NaCl (pH = 7). Eseguire immediatamente un test TBARS.
    10. Ripetere i passaggi 1.2.3–1.2.9 2x in due giorni diversi per testare la riproduttività del test TBARS.
  3. Siero umano
    1. Da un campione di siero umano, effettuare aliquote di 94 μL ciascuna in provette di polipropilene a tappo a scatto da 2 mL e conservare i campioni a -80 °C.
    2. Preparare una soluzione madre di CuCl2 da 35 mM in acido acetico (pH = 4): vedere il passaggio 1.1.9.
    3. Aliquota 6 μL dalla soluzione madre cuCl2 e aggiungerla a sei campioni contenenti 94 μL di siero umano per ottenere una concentrazione finale di CuCl2 di circa 2 mM. Aggiungere 6 μL di una soluzione di acido acetico (pH = 4) che non ha CuCl2 a sei campioni contenenti 94 μL di siero umano da utilizzare come controlli.
    4. Incubare campioni di siero umano per 24 ore in forno a 37 °C e determinare i livelli di ossidazione con il test TBARS (sezione 4).
    5. Ripetere i passaggi 1.3.2–1.3.4 2x in due giorni separati per determinare la riproducibilità del test TBARS.

2. Preparazione del reagente

ATTENZIONE: L'acido tiobarbiturico provoca irritazione della pelle e degli occhi e può essere dannoso per inalazione o assorbimento cutaneo. L'acido acetico può danneggiare gli organi interni se inalato. Preparare tutte le soluzioni acide in una cappa aspirante.

  1. Preparazione di soluzione all'8,1% (p/v) di dodecilsolfato di sodio (SDS)
    1. Pesare 32,4 g di SDS e sciogliere in 350 ml di acqua DI in un becher. Utilizzare una barra di agitazione magnetica per sciogliere delicatamente la SDS ed evitare di creare bolle. Portare il volume finale a 400 ml con acqua DI e conservare la soluzione SDS presso RT.
      NOTA: qui viene preparata una soluzione SDS superiore all'8,1%; tuttavia, per 96 campioni, sono necessari solo circa 20 ml della soluzione SDS all'8,1%. Preparare questa soluzione in base al numero di campioni analizzati.
  2. Preparazione di tampone di acetato di sodio 3,5 M (pH = 4)
    1. Diluire 100 mL di acido acetico glaciale in 350 mL di acqua DI in un becher. Utilizzare una barra magnetica per scioglierla delicatamente.
    2. Preparare una soluzione di NaOH da 6,5 M utilizzando perline di idrossido di sodio in acqua. Sciogliere 13 g di perline NaOH in 40 ml di acqua DI e portare ad un volume finale di 50 ml con acqua DI.
    3. Aggiungere lentamente circa 46 mL della soluzione di NaOH da 6,5 M alla soluzione di acido acetico mentre si mescola con la barra di agitazione (questo dovrebbe aumentare il pH a 4, ma confermare aggiungendo lentamente la soluzione di NaOH durante la misurazione utilizzando un pHmetro).
    4. Portare il volume finale a 500 ml con acqua DI e conservare il tampone di acetato di sodio a RT.
  3. Preparazione di soluzione acquosa allo 0,8% di acido tiobarbiturico (aggiustata a pH = 4)
    NOTA: In questa fase, la preparazione dell'acido tiobarbiturico è ottimizzata per grandi volumi, poiché verrà analizzato un gran numero di campioni (108 campioni, esclusi gli standard). Preparare questa soluzione in base al numero di campioni pianificati per l'analisi.
    1. Preparare una soluzione di idrossido di sodio 5 M utilizzando perline di idrossido di sodio e acqua: sciogliere 4 g di perline di idrossido di sodio in un volume finale di 20 ml di acqua. Conservare in un contenitore di plastica. Questa soluzione deve essere preparata al momento per ogni lotto.
    2. Peso 4 g di acido tiobarbiturico e aggiungere 450 ml di acqua DI. Utilizzare una barra magnetica per scioglierla delicatamente.
      NOTA: questa soluzione verrà infine portata a un volume totale di 500 ml.
    3. Mentre si scioglie l'acido tiobarbiturico con una barra di agitazione, aggiungere (lentamente e in modo goccioso) circa 3 ml della soluzione di NaOH da 5 M con incrementi di 100 μL. Dopo aver aggiunto la soluzione di NaOH, le particelle di acido tiobarbiturico inizieranno a dissolversi.
    4. Se le particelle di acido tiobarbiturico non sono ancora completamente disciolte, aggiungere più della soluzione di NaOH 5 M con incrementi di 100 μL fino a quando tutte le particelle di acido tiobarbiturico sono completamente disciolte. Per questo particolare volume di soluzione, viene aggiunto un totale di 4 mL della soluzione di NaOH da 5 M per sciogliere completamente le particelle di acido tiobarbiturico.
      NOTA: A questa concentrazione, l'acido tiobarbiturico non si dissolve completamente a meno che il pH non sia quasi 4.
    5. Smettere di aggiungere NaOH dopo che tutto l'acido tiobarbiturico si è completamente sciolto. Evitare di superare un pH di 4. Il pH finale può essere verificato prendendo 1 μL dalla soluzione di acido tiobarbiturico miscelante e posizionandola su carta pH.
    6. Portare il volume finale a 500 ml con acqua DI e conservare la soluzione acquosa di acido tiobarbiturico allo 0,8% a RT.

3. Preparazione standard del campione di Malondialdeide bis(dimetilacetale)

NOTA: Malondialdeide (MDA) è instabile e non disponibile in commercio. Tuttavia, ci sono diverse forme chimiche di MDA che sono disponibili in commercio, come il sale di tetrabutilammonio MDA, MDA bis (dimetil acetale) e MDA bis (dietil acetale). Di queste tre forme chimiche, MDA bis (dimetilacetale) è usato qui, perché la maggior parte degli studi utilizza questo stesso standard21,22. Se si sceglie di utilizzare le altre due forme chimiche di MDA, è necessario effettuare una previa convalida della loro idoneità.

  1. Preparare una soluzione madre di MDA bis (dimetilacetale) da 550 μM diluendo 92 μL di MDA bis (dimetilacetale) puro in 1 L di acqua DI. Utilizzare una barra magnetica per mescolare accuratamente la soluzione per 10 minuti. Conservare la soluzione a 4 °C e utilizzarla entro 1 mese.
  2. Preparare un MDA bis (dimetilacetale) da 200 μM diluendo 726 μL dallo stock di 550 μM MDA bis (dimetilacetale) in 1274 μL di acqua DI. Questa soluzione di MDA bis (dimetilacetale) da 200 μM deve essere preparata fresca ogni volta che viene eseguito un test TBARS.
  3. Preparazione della curva standard: prendere otto tubi di polipropilene a scatto da 2 ml ed etichettarli con le lettere da A a H. Aggiungere MDA bis (dimetilacetale) dal brodo da 200 μM e diluire in acqua come descritto nella Tabella 1.
  4. Prendere otto tubi di vetro (13 mm x 100 mm) ed etichettarli A-H, quindi aggiungere 100 μL di standard ai tubi corrispondenti. Eseguire sei repliche per lo standard vuoto (campione A) per calcolare i limiti di rilevamento del test TBARS.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui per non più di 1 ora.

4. Test TBARS

NOTA: una volta avviato il test TBARS, deve essere terminato senza fermarsi.

  1. Prendi tutti i tubi di vetro necessari per il numero di campioni da analizzare ed etichettali con i nomi dei campioni. Quindi, aggiungere 100 μL di ciascun campione preparato (come descritto sopra) a ciascun tubo di vetro.
  2. Aggiungere 200 μL di SDS all'8,1% a ciascun campione e standard e ruotare delicatamente il tubo di vetro con un movimento circolare per mescolare il campione.
  3. Aggiungere 1,5 mL del tampone di acetato di sodio 3,5 M (pH = 4) a ciascun campione e standard.
  4. Aggiungere 1,5 mL della soluzione acquosa di acido tiobarbiturico allo 0,8% (pH = 4) a ciascun campione e standard.
  5. Portare il volume finale a 4 mL per ogni campione e standard aggiungendo 700 μL di acqua DI.
  6. Tappare saldamente ogni tubo di vetro e incubare in un blocco riscaldante impostato a 95 °C per 1 ora. Coprire i tubi di vetro con un foglio di alluminio per evitare la formazione di condensa nella parte superiore dei tubi.
  7. Rimuovere i tubi di vetro dal blocco riscaldante e incubare sul ghiaccio per 30 minuti.
  8. Centrifugare campioni e standard a 1500 x g per 10 min a 4 °C. Dopo la centrifugazione, mantenere i tubi di vetro contenenti i campioni e gli standard a RT.
    NOTA: mantenere i campioni su ghiaccio o a 4 °C farà precipitare l'intero campione o standard.
  9. Immediatamente dopo la centrifugazione, aliquota 150 μL di surnatante da ciascun tubo e mettere in un pozzo separato di una piastra da 96 pozzetti.
  10. Rimuovere eventuali bolle da ciascun pozzetto utilizzando una punta della pipetta.
    NOTA: la presenza di bolle produrrà letture di assorbanza incoerenti, portando a un'elevata imprecisione del saggio.
  11. Leggere assorbanze a 532 nm. Sottrarre la lettura media di assorbanza dei campioni in bianco da tutte le altre letture di assorbanza.
  12. Create una curva standard tracciando le letture di assorbanza sottratte in bianco a 532 nm rispetto alla concentrazione nota di ciascuno standard. Adatta i punti dati utilizzando la regressione lineare. Calcolare concentrazioni di campioni sconosciute utilizzando l'equazione della linea di regressione lineare ottenuta dalla curva standard.

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Representative Results

In condizioni acide (pH = 4) e a 95 °C, la malondialdeide (MDA) bis(dimetil acetale) produce MDA23. MDA e congeneri chimici strettamente correlati reagiscono con due molecole di acido tiobarbiturico (TBA) per produrre composti chiamati sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS), che danno un colore rosso-rosa e hanno un λmax di assorbanza a 532 nm (Figura 1, Figura 2). Utilizzando MDA bis (dimetilacetale) come standard, sono state generate curve standard (Figura 3, Tabella 1) per determinare i limiti di rilevazione e sensibilità del saggio e i livelli di ossidazione in tre diversi campioni biologici. Sono stati eseguiti un totale di nove saggi TBARS per determinare i livelli di ossidazione nei tre diversi campioni in giorni diversi. Quindi, sono state generate un totale di nove curve standard, come mostrato nella Figura 3. La procedura dei minimi quadrati24 è stata utilizzata per determinare le deviazioni standard della pendenza e dell'intercetta y, che erano rispettivamente 8,67 x 10-6 e 5,66 x 10-4.

I limiti di rilevazione del saggio TBARS sono stati determinati secondo procedure analitiche standard25 misurando le assorbanze dei campioni in bianco (sei repliche sperimentali con due repliche tecniche per replica sperimentale) in tre giorni diversi. Il segnale analitico minimo distinguibile (Sm) è stato determinato sommando la media del segnale vuoto (S̄bl) più un multiplo k della deviazione standard del bianco (ksbl), dove k = 3. Cioè, Sm = S̄bl + ksbl. Utilizzando Sm e la pendenza della curva standard (m), il limite di rilevamento (cm) è stato calcolato come cm = (Sm - S̄bl)/m. I dati risultanti dei campioni in bianco in tre giorni diversi mostrano che la concentrazione minima di sostanza TBARS necessaria per fornire un segnale di non assorbimento del rumore rilevabile è di 1,1 μM (Tabella 2). La sensibilità del test TBARS è di circa 0,00160 unità di assorbanza/μM, che è la capacità del saggio di distinguere le differenze nella concentrazione di analita (Tabella 2).

Per illustrare l'applicabilità del test TBARS nel rilevare cambiamenti nella perossidazione lipidica in varie matrici biologiche, CuCl2 è stato utilizzato per indurre l'ossidazione in vitro di siero umano, lisati di cellule HepG2 e lipoproteine a bassa densità. Questi campioni biologici utilizzati qui sono prototipi di matrici biologiche. Ad esempio, sulla base dei risultati qui presentati per i lisati cellulari HepG2, è ragionevole aspettarsi che questo test funzioni con altri tipi di lisato cellulare; tuttavia, dovrebbe essere convalidato analiticamente a tal fine. Inoltre, delle tre matrici biologiche utilizzate qui, è comune che alcuni tipi di campioni mostrino basse concentrazioni endogene di TBARS. Ad esempio, TBARS per lisati cellulari HepG2 che non sono stati trattati con CuCl2 erano appena al di sopra del limite di rilevazione del test (circa 2 μM; Figura 4). Come ci si aspetterebbe in presenza di bassi rapporti segnale-rumore, la deviazione standard e il coefficiente di variazione per questo particolare campione sono relativamente elevati (Tabella 3). Tuttavia, quando il segnale aumenta a causa dell'ossidazione mediata da Cu(II), il coefficiente di variazione diventa più basso. In generale, man mano che l'assorbanza aumenta oltre il limite di rilevazione, la riproducibilità del saggio migliora (Tabella 3).

Ai fini di questo protocollo, non vi era alcun desiderio di utilizzare antiossidanti per mascherare l'ossidazione in vitro mediata da Cu(II) di campioni biologici. Le lipoproteine a bassa densità (LDL) preparate commercialmente possono contenere lo 0,01% di EDTA. L'EDTA previene l'ossidazione mediata da Cu(II) dell'LDL, ma non necessariamente altre reazioni di ossidazione mediate da metalli26,27. Un test TBARS è stato eseguito su campioni LDL contenenti EDTA e i livelli di TBARS non sono cambiati tra i campioni LDL trattati con Cu(II) e non trattati (Figura 5A). Tuttavia, dopo che l'EDTA è stato rimosso mediante filtrazione spin (vedere fase 1.2.3-1.2.5), LDL è stato sottoposto a ossidazione mediata da Cu(II), come rilevato dal test TBARS (Figura 5B).

La gamma normale di prodotti di perossidazione lipidica nel siero umano da donatori sani espressa in termini di MDA è compresa tra 1,80 e 3,94 μM28. Per illustrare la gamma dinamica del test TBARS nel siero umano, è stata aggiunta ai campioni una concentrazione di ioni Cu(II) di 2 mM, seguita da incubazione per 24 ore a 37 °C. Ciò ha comportato un aumento di 6x-7x di TBARS (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Schema di analisi delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico.
Cento microlitri di campione o standard vengono aggiunti a un tubo di vetro da 13 mm x 100 mm, seguiti dall'aggiunta di reagenti di sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS). Dopo l'incubazione a 95 °C per 1 ora, i campioni e gli standard vengono incubati nel ghiaccio per 30 minuti, quindi centrifugati a 1.500 x g per 10 minuti a 4 °C. Centocinquanta microlitri di campione o surnatante standard vengono caricati su una piastra a 96 pozzetti e l'assorbanza viene misurata a 532 nm. La concentrazione sconosciuta del campione viene calcolata utilizzando l'equazione della curva standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Reazione delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico archetipo.
La malondialdeide bis (dimetil acetale) produce malondialdeide sotto idrolisi catalizzata dall'acido1. La Malondialdeide rilasciata (MDA) reagisce quindi con due molecole di acido 2-tiobarbiturico (TBA) (pH = 4 e 95 °C) per formare addotti MDA-TBA2 che danno un colore rosso-rosa e possono essere misurati spettrofotometricamente a 532 nm. Poiché altre molecole oltre all'MDA derivate da lipidi ossidati possono anche reagire con TBA, la misurazione dell'assorbanza a 532 nm è semplicemente indicata come una misurazione delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico o TBARS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Malondialdeide bis(dimetil acetale) curve standard colorimetriche.
La figura mostra nove curve standard create in giorni diversi. Alcuni punti si sovrappongono e non possono essere distinti l'uno dall'altro. La malondialdeide bis (dimetil acetale) è stata fortificata in campioni di calibratore a 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 μM (come mostrato nella Tabella 1; n = 1 per punto di concentrazione al giorno). L'assorbanza è stata misurata a 532 nm, con l'assorbanza media dei campioni in bianco sottratta da tutte le misurazioni in quel lotto, comprese le incognite. Ogni giorno, l'equazione generata dalla regressione lineare dei minimi quadrati è stata utilizzata per determinare TBARS in campioni biologici. Per tutte e nove le curve standard combinate, la deviazione standard della pendenza era 8,67 x 10-6 e la deviazione standard dell'intercetta y era 5,66 x 10-4. Le deviazioni standard della pendenza e dell'intercetta y sono state calcolate utilizzando la procedura dei minimi quadrati24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Ossidazione nei lisati HepG2 rilevata da TBARS.
Sei campioni di lisato cellulare HepG2 sono stati incubati con 2 mM CuCl2 [lisato cellulare HepG2 + 2 mM Cu(II)] e sei campioni sono stati incubati in una soluzione senza CuCl2 (lisato cellulare HepG2) per 24 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, il test TBARS è stato eseguito sui 12 campioni. Questa procedura è stata ripetuta 2 volte per un totale di tre giorni diversi. Le barre di errore rappresentano SD. L'asterisco indica differenze statisticamente significative tra il controllo e i lisati trattati con Cu(II) (p < 0,001). La significatività statistica è stata determinata utilizzando un test di Mann Whitney U in GraphPad. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Ossidazione in lipoproteine a bassa densità rilevata da TBARS.
(A) Saggio TBARS condotto su campioni LDL contenenti lo 0,01% di EDTA. Sei campioni LDL sono stati incubati con 10 μM CuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)], e sei campioni sono stati incubati con una soluzione di controllo senza CuCl2 aggiunto (LDL nativo) per 2 ore a 37 °C. Quindi, è stato eseguito un test TBARS sui 12 campioni. "ns" non rappresenta alcuna significatività statistica. (B) LDL è stato filtrato utilizzando un dispositivo di filtro centrifugo per rimuovere l'EDTA. Quindi, l'incubazione con e senza Cu aggiunto (II) è stata eseguita di nuovo come descritto per (A). Il test TBARS è stato eseguito immediatamente dopo. Questa stessa procedura è stata ripetuta 2 volte per un totale di 3 giorni. Le barre di errore rappresentano SD. L'asterisco indica differenze statisticamente significative tra il controllo e i campioni LDL trattati con Cu(II) (p < 0,001). La significatività statistica è stata determinata utilizzando il test Mann Whitney U in GraphPad. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Perossidazione lipidica in campioni di siero umano rilevati da TBARS.
Sei campioni di siero umano sono stati incubati con 2 mM CuCl2 [siero + 2 mM Cu(II)], e sei campioni sono stati incubati con una soluzione che non aveva aggiunto CuCl2 (siero normale) per 24 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, il test TBARS è stato eseguito sui 12 campioni. Questa procedura è stata ripetuta in altri due giorni. Le barre di errore rappresentano la SD. L'asterisco indica differenze statisticamente significative tra i campioni di siero trattati con Cu(II) di controllo (p < 0,001). La significatività statistica è stata determinata utilizzando il test Mann Whitney U in GraphPad. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tubo di vetro 200 μM MDA bis (dimetil acetale) (μL) Acqua (μL) MDA bis (dimetil acetale) Concentrazione finale (μM)
Aa · 0 1000 0
B 12.5 987.5 2.5
C 25 975 5
D 50 950 10
E 100 900 20
F 200 800 40
G 400 600 80
H 800 200 160

Tabella 1: Preparazione standard del campione di Malondialdeide bis(dimetilacetale). Dalla malondialdeide bis(dimetilacetale) appena preparata da 200 μM, aliquota i volumi suggeriti raggiungono la concentrazione finale per la curva standard. Si raccomanda di eseguire almeno sei repliche del campione bianco (A) al giorno per determinare i limiti di rilevazione del metodo.

Giorno Assorbanza Sblb · Smc · Sensibilità (unità di assorbanza/μM)d cm (μM)e
1 (n = 6) 0.0412 0.000612 0.0430 0.00160 1.14
2 (n = 6) 0.0415 0.000632 0.0433 0.00160 1.18
3 (n = 6) 0.0413 0.000605 0.0431 0.00160 1.13
Tutti e tre i giorni (n = 18) 0.0413 0.000589 0.0431 0.00160 1.10
un Assorbanza dei campioni in bianco in tre giorni diversi con 6 repliche al giorno.
bSbl = Deviazione standard dell'assorbanza dei campioni in bianco.
cSm = Segnale analitico minimo distinguibile, che è stato determinato sommando la media del segnale vuoto (S̄bl) più un multiplo k della deviazione standard del bianco (ksbl), dove k = 3. Cioè; Sm = S̄bl + ksbl.
d Sensibilità del test TBARS, che è la pendenza della curva standard.
ecm = Limiti di rilevazione, che è stato calcolato come cm = (Sm - S̄bl)⁄m, dove m = la pendenza della curva standard.

Tabella 2: Limiti di rilevamento del test TBARS.

Lipoproteina a bassa densità Siero Umano Lisato cellulare HepG2
Giorno % CV Giorno % CV Giorno % CV
1 (n = 6) 5.6 1 (n = 6) 7.9 1 (n = 6) 12.6
2 (n = 6) 5.4 2 (n = 6) 7.2 2 (n = 6) 15.8
3 (n = 6) 3.9 3 (n = 6) 7.0 3 (n = 6) 17.7
Tutti e tre i giorni (n = 18)a 7.4 Tutti e tre i giorni (n = 18) 9.8 Tutti e tre i giorni (n = 18) 15,5b
Con CuCl2 da 10 μM Con 2 mM CuCl2 Con 2 mM CuCl2
1 (n = 6) 4.5 1 (n = 6) 6.0 1 (n = 6) 5.8
2 (n = 6) 6.5 2 (n = 6) 4.3 2 (n = 6) 6.0
3 (n = 6) 6.7 3 (n = 6) 6.2 3 (n = 6) 8.0
Tutti e tre i giorni (n = 18) 6.1 Tutti e tre i giorni (n = 18) 5.6 Tutti e tre i giorni (n = 18) 7.3
un La precisione interday è stata calcolata raggruppando i dati di tutti e tre i giorni.
b La precisione è stata limitata a causa dei risultati vicini al loD del test.

Tabella 3: Riproducibilità analitica di TBARS in tre diversi campioni biologici.

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Discussion

Nonostante i suoi limiti1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 e la mancanza di idoneità al confronto tra laboratori, il test TBARS è uno dei più vecchi29,30 ma i saggi più utilizzati per misurare lo stress ossidativo in campioni biologici. Il test TBARS è un metodo semplice che richiede solo circa 2 ore per essere eseguito, una volta che tutti i reagenti richiesti sono stati preparati. Qui, abbiamo descritto in dettaglio come questo test, compresa la curva standard, può essere eseguito molte volte in modo economico (circa $ 3,50 USD per 96 campioni), senza dover acquistare un kit costoso per ogni lotto di campioni.

Tutte le fasi del test sono critiche, ma ci sono alcuni passaggi che richiedono un'attenzione extra. Ad esempio, il pH dell'acido tiobarbiturico non deve essere superiore a 4. Devono essere prese precauzioni quando si aggiunge la soluzione di idrossido di sodio all'acido tiobarbiturico ed evitare di ottenere un pH superiore a 4. È necessario un ambiente acido per la reazione tra MDA e TBA e lo standard MDA viene rilasciato da MDA bis (dimetilacetale) mediante idrolisi catalizzata da acido. Pertanto, un pH elevato può portare a risultati imprevedibili e altamente variabili31.

Inoltre, mentre questo può essere ovvio per alcuni lettori, è anche fondamentale rimuovere eventuali bolle nella piastra del pozzo 96 prima di misurare l'assorbanza. La presenza di bolle produrrà alti valori di assorbanza e differenze tra le repliche, portando ad un'alta percentuale di CV. Inoltre, dopo l'incubazione di 1 ora a 95 °C, i campioni non devono essere incubati più di 30 minuti sul ghiaccio, poiché ciò farà precipitare l'intero campione e la raccolta di un surnatante privo di precipitati sarà difficile da realizzare. In particolare, non ci sono buoni punti di arresto una volta che il test TBARS è stato avviato. Dovrebbe essere completato una volta avviato. Infine, ci sono molte possibili variazioni metodologiche che possono essere applicate a questo test. Il protocollo generale qui descritto può essere ulteriormente adattato (e convalidato) per applicazioni specifiche, comprese quelle in cui è richiesta l'aggiunta di spazzini radicali o altri tipi di antiossidanti prima dell'analisi.

Mentre il test TBARS è popolare, è importante rendersi conto che non è un test molecolare specifico. Numerose molecole organiche chimicamente reattive contenenti carbonile, comprese quelle derivate da biomolecole ossidate diverse dai lipidi, possono reagire con TBA e sono quindi conteggiate come TBARS1,32,33,34. Inoltre, i limiti di rilevamento del saggio TBARS basato sull'assorbanza non migliorano molto di circa 1,1 μM, come determinato da questo metodo. Tuttavia, i limiti di rilevamento possono essere migliorati utilizzando altri metodi di rilevamento. Ad esempio, la spettrofluorometria con eccitazione a 520 nm ed emissione a 550 nm offre una maggiore sensibilità e migliori limiti di rilevamento, come precedentemente suggerito da Jo e Ahn35. I metodi basati sulla spettrometria di massa possono migliorare notevolmente sia la specificità che i limiti di rilevamento. Ad esempio, un metodo GC-MS/MS con ionizzazione chimica a ioni negativi a cattura elettronica (ECNICI) è stato utilizzato per rilevare il derivato pentafluorobenzile dell'MDA in campioni di siero e urina umani, con limiti di rilevazione di 2 x 10-18 mol MDA su colonna36. Qui, la separazione cromatografica, in combinazione con la spettrometria di massa tandem, migliora notevolmente anche la specificità molecolare del test.

Tuttavia, come per altre misurazioni dei processi ossidativi all'interno di campioni biologici37,38, la gestione preanalitica dei campioni è fondamentale per l'esito delle misurazioni TBARS. Ad esempio, la conservazione del plasma sanguigno a -20 °C provoca aumenti lenti ma drammatici delle concentrazioni di MDA39,40. Pertanto, l'esposizione di campioni biologici a condizioni scongelate o anche parzialmente scongelate per qualsiasi cosa tranne una quantità minima di tempo dovrebbe essere assunta per causare un aumento artefatto dei livelli di TBARS. Ciò significa che deve essere evitata anche una modesta variabilità nella manipolazione preanalitica e nella conservazione dei biocampioni che devono essere confrontati utilizzando il test TBARS.

Dati questi avvertimenti relativi alla variabilità preanalitica e alla sensibilità e specificità limitate, si raccomanda di utilizzare il test TBARS basato sull'assorbanza solo per la valutazione generale intra-laboratorio o per esperimenti di range-finding. Queste applicazioni includono studi in cui i livelli relativi di TBARS vengono confrontati direttamente tra uno o più gruppi di campioni biologicamente simili che vengono elaborati o conservati insieme e separati da una sola variabile che è completamente controllata dai ricercatori.

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Disclosures

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

La ricerca qui riportata è stata sostenuta in parte dal National Cancer Institute del National Institutes of Health sotto il premio no. R33 CA217702 e il programma IMSD (Initiative for Maximizing Student Development). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L VWR, PA 101642--262 cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube Corning, NY CLS430897 General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile Thermo Fisher Scientific, MA 280895 To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device Fisher Scientific, NH UFC510024 LDL purification
Caps for glass tubes Thermo Fisher Scientific, MA 14-930-15D for TBARS assay
Copper II Chloride SIGMA, MO 222011-250G to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) VWR, PA 53283-800 for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ATCC, VA HB-8065 HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL eppendorf, NY 22363204 General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Genesee Sceitific, CA 22363352 General material
Fetal Bovine Serum US Source Omega Scientific, CA FB-11 for cell culture
Glacial Acetic Acid SIGMA, MO 27225-1L-R TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific, MA 87786 cell lysis reagent
HEPES SIGMA, MO H3375-250G LDL solvent
HepG2 Cells ATCC, VA HB-8065 Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl) Fisher Scientific, NH A144-212 cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge Thermo Scientific, MA 75002431 General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma Athens Research & Technology, GA 12-16-120412 Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment VWR, PA 58948-025 General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) SIGMA, MO 8207560250 TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer Fisher Scientific, NH 51119200 To measure absorbance
NP-40 EMD Millipore Corp, MA 492016-100ML cell lysis reagent
Sodium Chloride SIGMA, MO S7653-1KG cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA, MO 436143-100G TBARS Reagent
Sodium hydroxide SIGMA, MO 367176-2.5KG TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific, MA SC250EXP For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap USA Scientific, FL 658175 cell culture
Thiobarbituric Acid SIGMA, MO T5500-100G TBARS Reagent
TRIS base Fluka, GA 93362 cell lysis reagent
Trypsin (1x) VWR, PA 16777-166 To detach HepG2 cells

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References

  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

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Valutazione dello stress ossidativo in campioni biologici utilizzando il test delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico
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