Summary
هنا ، نقدم ونصف منهجيات يمكن الوصول إليها على نطاق واسع باستخدام بعض نماذج الديدان الخيطية متعددة الاستخدامات ، بما في ذلك النخر الناجم عن القناة الأيونية المفرطة التنشيط وتكسية الأعصاب الناتجة عن البروتين ، لرصد وتشريح الأسس الخلوية والجزيئية للأمراض العصبية المرتبطة بالعمر.
Abstract
أصبحت مكافحة الأمراض العصبية البشرية وإدارة تأثيرها الاجتماعي والاقتصادي المتفشي أولوية عالمية. وعلى الرغم من آثارها الضارة على نوعية حياة الإنسان ونظام الرعاية الصحية، فإن غالبية الاضطرابات العصبية البشرية لا تزال غير قابلة للشفاء ولا يمكن الوقاية منها. ولذلك، فإن تطوير تدخلات علاجية جديدة لمكافحة هذه الأمراض أصبح أمرا ملحا. التدهور المرتبط بالعمر في الدوائر العصبية والوظيفة يتم الحفاظ عليه تطوريا في الكائنات الحية المتنوعة مثل الدودة المنخفضة Caenorhabditis elegans والبشر ، مما يدل على أوجه التشابه في الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية. C. elegans هو نموذج وراثي مرن للغاية، والذي يوفر نظامًا عصبيًا يتميز جيدًا وشفافية الجسم وذخيرة متنوعة من التقنيات الجينية والتصويرية لتقييم نشاط الخلايا العصبية ومراقبة الجودة أثناء الشيخوخة. هنا، نقدم ونصف المنهجيات التي تستخدم بعض نماذج الديدان الخيطية متعددة الاستخدامات، بما في ذلك النخر الناجم عن القناة الأيونية (على سبيل المثال، deg-3(d) و mec-4(d)) وتجميع البروتين (على سبيل المثال، α-syunclein و Poly-glutamate) -الناجم عن السمية العصبية، لرصد وتشريح الأسس الخلوية والجزيئية للانهيار العصبي المرتبط بالعمر. وسيؤدي الجمع بين هذه النماذج العصبية الحيوانية، إلى جانب الشاشات الوراثية والدوائية لمُعَدِّات موت الخلايا إلى فهم غير مسبوق للانهيار المرتبط بالعمر لوظيفة الخلايا العصبية، وسوف يوفر رؤى حاسمة ذات صلة واسعة بصحة الإنسان ونوعية الحياة.
Introduction
على مدى العقدين الماضيين، وقد استخدمت على نطاق واسع C. elegans ككائن حي نموذجي للتحقيق في الآليات الجزيئية لوفيات الخلايا النخرية. C. elegans يقدم نظام عصبي بشكل استثنائي يتميز بشكل جيد ورسم الخرائط، وهيكل الجسم شفافة وذخيرة متنوعة من الأساليب الوراثية والتصوير لرصد في وظيفة الخلية الجسم الحي والبقاء على قيد الحياة طوال الشيخوخة. وهكذا، تم بالفعل تطوير العديد من النماذج الجينية C. elegans من التنكس العصبي لتقييم صلاحية الخلايا العصبية. على وجه الخصوص، نماذج النيماتودا الموصوفة جيدا والمستخدمة تشمل النخر الناجم عن قناة الأيونات فرط النشاط1،2،3 وموت الخلايا الناجمة عن زيادة تجميع البروتين4،5،6،7،8،9،10 والسكتة الدماغية الحرارة11،12، من بين أمور أخرى.
التعرض على المدى القصير لدرجات حرارة شبه قاتلة منحت المقاومة ضد موت الخلايا النخرية، الناجمة عن الإجهاد الحراري اللاحقة سواء في الديدان الخيطية والخلايا العصبية الثديية11. ومن المثير للاهتمام أن الشرط المسبق اليومي للنيماتودا في درجة حرارة مرتفعة خفيفة يحمي من التنكس العصبي ، والذي تسببه محفزات متنوعة ، مثل عدم التوازن الأيوني (على سبيل المثال ، mec-4 (u231) و / أو deg-3 (u662)) وتجميع البروتين (على سبيل المثال ، α-synuclein و polyQ40)11،13.
هنا، نحن وصف منهجيات متعددة الاستخدامات باستخدام C. elegans لرصد وتقييم التنكس العصبي المعتمد على العمر في النماذج الراسخة من الأمراض البشرية، مثل موت الخلايا الناجمة عن السمية، ومرض باركنسون وهنتنغتون. وعلاوة على ذلك، فإننا نؤكد على الدور العصبي الحماية من الحرارة المسبقة في عدة نماذج من تنكس الأعصاب. وسيؤدي الجمع بين هذه التقنيات والشاشات الوراثية و/أو العقاقيرية إلى تحديد وتوصيف خواص حفّاضات موت الخلايا الجديدة، مع الاهتمام العلاجي المحتمل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. موت الخلايا النخرية الناجم عن القنوات الأيونية المفرطة
ملاحظة: كسب من وظيفة الطفرات في الأسرة الجينية من degenerins، بما في ذلك mec-4 و deg-3 من بين أمور أخرى، والنتائج في توليد القنوات الأيونية مفرطة النشاط مما يؤدي إلى موت الخلايا النخرية من الخلايا العصبية مستقبلات اللمس الستة المطلوبة لchanchanosensation في الديدان3. النخر الناجم عن التحفيز الشاذ للتخلص من الgenerins يعرض العديد من أوجه التشابه الميكانيكية والمورفولوجية للسمية في الثدييات. الحفاظ على استقلاب الطاقة والكالسيوم التوازن له دور حاسم في البقاء على قيد الحياة العصبية خلال نخر11. ويمكن استخدام السلالات التالية لرصد موت الخلايا النخرية الناجمة عن قنوات أيونات مفرطة النشاط، mec-4 (u231) X و deg-3 (u662)V.
- صيانة و تزامن وإعداد الديدان المتحولة لفحص موت الخلايا النخرية
- اليوم 1: اختيار L4 يرقات mec-4 (u231) أو deg-3 (u662) نزوات الخيطيات المتحولة على وسائط نمو النعمة (NGM؛ 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 الجدول 1) لوحات بذر مع Escherichia القولونية (OP50) باستخدام منظار مجسم تشريح.
- ضع 10 يميات 4 لكل لوحة NGM بذر وتنموها عند درجة الحرارة القياسية 20 درجة مئوية.
- اليوم 5: غسل لوحات مع 1 مل من M9 العازلة(الجدول 1)وجمع الحيوانات في أنبوب 1.5 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 30 S وإزالة الفائق.
- إضافة 0.5 مل من حل التبييض (7 مل من H2O، 1 مل من 5 N NAOH و 2 مل من التبييض).
ملاحظة: حل التبييض تفقد تدريجيا كفاءتها; وبالتالي ينبغي إعدادها يوميا. - دوامة ومراقبة دورية حتى الديدان قد حل.
ملاحظة: تجنب التبييض لفترات أطول من 5 دقائق لأن قدرة الأجنة على البقاء ستتأثر. - أجهزة الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 30 S وإزالة الفائق.
- غسل مرتين بيليه (البيض) مع 1 مل من M9 العازلة.
- بعد الغسيل، resuspend البيض في 200 ميكرولتر من M9 العازلة واحتضان لهم لمدة 25 دقيقة في 34 درجة مئوية في حمام مائي.
- الحفاظ على مجموعة منفصلة من عينة التحكم (البيض) عند 20 درجة مئوية.
- ماصة 100 μL من السيطرة أو الحرارة صدمة معالجة البيض ووضعها على لوحات NGM غير المصنفة. كل لوحة تحتوي على ما لا يقل عن 100-200 بيضة.
- حضن البيض في 20 درجة مئوية حتى الفقس.
- تركيب يرقات L1 للفحص باستخدام تباين التداخل التفاضلي (DIC; نومارسكي) المجهري
- إعداد 2٪ منصات agarose.
- استخدم 1 مل من M9 العازلة لغسل لوحات وجمع اليرقات اليرقات النيماتودا L1 في أنابيب 1.5 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 10,000 x غم لمدة 30 s.
- إزالة فائقة والحفاظ على بيليه (الديدان الخيطية).
- إضافة 100 μL من 20 mM M9/levamisole العازلة ل التخدير nematodes.
ملاحظة: تجنب أزيد الصوديوم كمخدر. أزايد الصوديوم يؤدي تلف الميتوكوندريا والإجهاد التأديدي مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تحريض موت الخلية - ماشيت 10 ميكرولتر من M9/levamisole العازلة التي تحتوي على الديدان L1 وجبل لهم على منصات agarose 2 ٪(الجدول 1).
- ضع غطاء برفق في الجزء العلوي من العينة.
ملاحظة: ختم الغطاء مع طلاء الأظافر للحفاظ على الرطوبة طوال عملية التصوير. - مراقبة الديدان باستخدام تباين التداخل التفاضلي (DIC; نومارسكي) المجهر.
- درجة تنكس عصبي من الخلايا العصبية مستقبلات اللمس الستة عن طريق عد الخلايا مع مظهر مفتورة مميزة لكل نعمة.
2. البروتين الكلي الناجم عن تنكس الأعصاب
ملاحظة: يمكن استخدام السلالات التالية للتحقيق في مجاميع البروتين الناجمة عن السمية العصبية: (A) فرط التعبير عن الإنسان α-synuclein في الخلايا العصبية الدوبامينية، UA44: هو[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] و (B)فرط التعبير عن بروتين البولي لوتامين البشري (PolyQ) عموم الخلايا العصبية, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,,10.
- صيانة وتزامن وإعداد الديدان الخيطية المحورة وراثياً من أجل فحص التنكس العصبي
- استخدام تشريح stereomicroscope لرصد تطوير C. elegans والنمو.
- اليوم 1: مزامنة سكان الديدان الخيطية المعدلة وراثيا عن طريق قطف ونقل 15-20 يرقات L4 من كل سلالة على لوحات NGM الطازجة التي تم تصنيفها OP50.
ملاحظة: استخدم ثلاث لوحات على الأقل من كل سلالة لكل حالة. - احتضان والسماح للنيماتودا أن تنمو في درجة حرارة قياسية من 20 درجة مئوية.
- اليوم الثاني: قم بأداء الشروط المسبقة اليومية لمدة 30 دقيقة عن طريق نقل اللوحات في حاضنة تقع عند 34 درجة مئوية. ثم، والعودة الديدان الخيطية المسبقة مرة أخرى في درجة الحرارة القياسية من 20 درجة مئوية.
ملاحظة: قد تكون الخلفيات الوراثية المختلفة حساسة لارتفاع درجة الحرارة لفترات طويلة من التعرض. - (A)إذا كان التحقيق overexpression الإنسان α-synuclein في الخلايا العصبية الدوبامينية, UA44: هو[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: في اليوم 9, رصد 7 أيام من العمر النيماتويدات المعدلة وراثيا لوفيات الخلايا العصبية الدوبامين.
- (B) إذا كان التحقيق في فرط التعبير عن بروتين بوليغلوتامين الإنسان (PolyQ) عموم الخلايا العصبية, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: في اليوم 5, قياس مجاميع PolyQ العصبية في منطقة الرأس من الحيوانات المعدلة وراثيا 4 أيام من العمر التعبير عن Q40::YFP.
- تركيب العينات للفحص المجهري
- إعداد منصات agarose 2٪(الجدول 1).
- أضف 10 ميكرولتر من 20 mM M9/levamisole العازلة قطرة في وسط لوحة agarose.
- اختيار الديدان الخيطية المعدلة وراثيا كل منها ونقلها في قطرة M9/levamisole.
ملاحظة: ضع 20-30 الديدان الخيطية لكل قطرة. - ضع غطاءً برفق في الجزء العلوي من العينة.
ملاحظة: ختم الغطاء مع طلاء الأظافر للحفاظ على الرطوبة طوال عملية التصوير. - المضي قدما في الفحص المجهري للعينات المعنية.
- عملية الحصول وتحليل البيانات من الديدان الخيطية المعدلة وراثيا المشاركة في التعبير عن α-synuclein وGFP cytosolic في الخلايا العصبية الدوبامين
- استخدام مجهر epifluorescence جنبا إلى جنب مع الكاميرا (على سبيل المثال، EVOS FL السيارات 2).
- اكتشاف والتقاط صور تى - المكدس لمنطقة الرأس عند التكبير 20x.
- حفظ وجمع الصور الإسقاط أقصى كثافة.
- المضي قدما في تحليل الصور المكتسبة.
- فحص الديدان المعدلة وراثياً للانكسار العصبي عن طريق تسجيل الخصائص الخلوية التالية، (ط) فقدان الفلوريسنس من الخلايا العصبية التي تعبر عن GFP تحت المروج لـ dat-1، (ii) الخلايا العصبية التي تظهر سوما و/أو blebbing عصبي، أو نمو أو فقدان التشعب.
- استيراد البيانات وتحليلها باستخدام حزمة برامج (مثل Excel).
3. عملية الاستحواذ وتحليل البيانات من الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التعبير عن عموم الخلايا العصبية PolyQ40 تنصهر مع YFP
- استخدام مجهر epifluorescence جنبا إلى جنب مع الكاميرا (على سبيل المثال، EVOS FL السيارات 2).
- اكتشاف والتقاط صور تى - المكدس لمنطقة الرأس عند التكبير 20x.
- حفظ وجمع الصور الإسقاط أقصى كثافة.
- المضي قدما في تحليل الصور التي تم الحصول عليها باستخدام برامجيات فيجي.
- فتح الصور مع برنامج فيجي14.
- حدد تقسيم القنوات الأمر عبر الصورة والألوان القائمة المنسدلة.
ملاحظة: احتفظ بصورة القناة الخضراء. - استخدم أداة التحديد اليدوي لتعيين منطقة الفلورسنت ذات الأهمية (ROI؛ مثل الرأس).
- أضف عائد الاستثمار الخاص في مدير ROI عبر القائمة المنسدلة Analyze و Tools.
- طرح الخلفية إلى 50% عن طريق تحديد معالجة و طرح الخلفية.
- إعداد وتطبيق قيم العتبة عبر أمر القائمة صورة | ضبط | الحد الأدنى. الاحتفاظ بنفس قيم العتبة وتعيينها خلال تحليل الصور للتجربة بأكملها.
- حدد عائد الاستثمار الخاص من مدير عائد الاستثمار.
- تحليل عدد المجاميع البروتين باستخدام أمر القائمة تحليل وتحليل الجسيمات.
- كرر الخطوات 3.5-3.12 لكل صورة مكتسبة.
- نسخ قيم العرض من إطار نتائج منفصلة.
- لصق/استيراد النتائج وتحليلها باستخدام حزمة برامج.
4 - تقرير التحليل الإحصائي
- استخدام ما لا يقل عن 30 الديدان الخيطية لكل حالة تجريبية. تنفيذ ثلاثة نسخ متماثلة بيولوجية.
- استخدام برنامج التحليل الإحصائي إما لإجراء الطالب t-اختبار (مقارنة بين مجموعتين) أو ANOVA (مقارنة بين مجموعات متعددة) للتحليل الإحصائي مع p < 0.05 كما كبيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
موت الخلايا النخرية الناجمة عن القنوات الأيونية شديدة النشاط
باستخدام الإجراءات المعروضة هنا، تم احتضان الأجنة المتحولة mec-4 (u231) و deg-3u662) لمدة 25 دقيقة عند 34 درجة مئوية أو الاحتفاظ بها عند درجة الحرارة القياسية البالغة 20 درجة مئوية. عند الفقس ، تم تحديد عدد جثث الخلايا العصبية في مرحلة اليرقات L1 لكلا المجموعتين. ويقل موت الخلايا النيخرية في الديدان الخيطية التي فقست من الحرارة صدمة البيض المسبق(الشكل 1A-1B).
التنكس العصبي الناتج عن البروتين
الديدان الخيطية عبر جينيجيني overexpressing (أ) الإنسان α-synuclein و cytoplasmic GFP في الخلايا العصبية الدوبامينية و (ب) بروتين بوليغلوتامين الإنسان (PolyQ) تنصهر مع YFP عموم العصبية, تعرضت يوميا لمدة 30 دقيقة في 34 °C. الصدمة الحرارية المسبقة يعزز العلاج العصبي ضد موت الخلايا الناجم عن α-synuclein في 7 أيام البالغين hermaphrodites(الشكل 2A)ويخفض Q40::YFP مجاميع البروتين في المنطقة الرئيسية للبالغين 4 أيام من العمر(الشكل 2B والشكل 3).
الشكل 1: فرط نشاط النخر الناجم عن القناة الأيونية. (أ)ممثل DIC صورة المجهر من mec-4 (u231) L1 اليرقة، مع رؤوس الأسهم تشير إلى الفاكوليس النيكروليكية المميزة. في مرحلة مبكرة من تنكس النوى العصبية يتم عرضها داخل الخلايا. تم الحصول على الصورة باستخدام عدسة الاعتراض 40x. شريط مقياس، 20 ميكرومتر. (ب) عدد الجثث الخلايا العصبية في مرحلة اليرقات L1 من التنمية، لكل 100 الحيوانات التي تحمل مسيك-4 (u231) أو 3 (u662) اليلة. يتم قمع موت الخلايا النخرية في يرقات L1 التي تحاك من البيض المسبق مقارنة مع نظيراتها غير المعالجة (n= 100 لكل نمط جيني ومقايسة؛ تمثل البيانات متوسط ±S.E.M., ***P< 0.001 لـ غير المعالجة مقابل الشروط المسبقة؛ t-test) الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الشرط المسبق اليومي عند 34 درجة مئوية يمنح الحماية العصبية ضد α-synuclein ويخفض مجاميع البولي كيو في C. elegans. (α) بقاء الخلايا العصبية الدوبامينية الأمامية (CEPs و ADEs) في الديدان الخيطية غير المعالجة والشروط المسبقة المشاركة في التعبير عن cytoplasmic GFP مع الإنسان α-synuclein. تعرض الديدان الخيطية المسبقة المعالجة العصبية المعززة مقارنةً بغير معالجة. بقايا أجسام الخلايا العصبية (العلامات النجمية) والخرز المحوري (رؤوس الأسهم) وينظر في الديدان الخيطية غير المعالجة (لوحة العلوي). يتم الحفاظ على كل من سوما (العلامات النجمية) والعمليات العصبية (رؤوس الأسهم) عند الشروط المسبقة. الصور التي تم الحصول عليها باستخدام عدسة الاعتراض 20x وتصور أقصى كثافة z الإسقاط. تفاصيل الاستحواذ: برايت، 0.15. شريط مقياس، 20 ميكرومتر. وسجلت الديدان لبقاء الخلايا العصبية من الخلايا العصبية الدوبامين الأمامية في اليوم السابع من مرحلة البلوغ. (ب) مجاميع polyQ العصبية التي تم الكشف عنها في اليوم الرابع من مرحلة البلوغ في منطقة الرأس من الديدان الخيطية المعدلة وراثيا غير المعالجة والشروط المسبقة. الديدان المعدلة وراثيا شرط تقديم أقل الخلايا العصبية Q40::YFP المجاميع مقارنة مع غير المعالجة. وتظهر صور تمثيلية لمنطقة الرأس مع رؤوس الأسهم تشير إلى مجاميع بروتين polyQ في الخلايا العصبية. الصور التي تم الحصول عليها باستخدام عدسة الاعتراض 20x وتصور أقصى كثافة z الإسقاط. تفاصيل الاستحواذ: برايت، 0.0175. شريط مقياس، 20 ميكرومتر. تم قياس كمية 30-35 حيوانًا لكل حالة في كل تجربة من ثلاث تجارب مستقلة. تمثل البيانات متوسط ± S.E.M. ، *** P < 0.05 ، اختبار tغير مُزدّد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل الصور باستخدام برامجيات فيجي. 1. فتح صورة المكتسبة مع برنامج فيجي؛ 2. حدد "قناة سبليت" الأمر عبر "صورة" و "اللون" القائمة المنسدلة لتحويل الصورة؛ 3، 4. الحفاظ على صورة "القناة الخضراء" وباستخدام أداة "اختيار حر" ، enwrap المنطقة الفلورسنت من الفائدة (العائد على الاستثمار ؛ على سبيل المثال ، الرأس). إضافة عائد الاستثمار الخاص في "ROI Manager" عبر "تحليل" والقائمة المنسدلة "أدوات"؛ 5، 6. طرح الخلفية إلى 50٪ عن طريق تحديد "عملية" و "طرح الخلفية"؛ 7، 8. إعداد وتطبيق قيم العتبة عبر أمر القائمة "صورة" و "ضبط" و "عتبة"؛ 9. حدد عائد الاستثمار المعني من "مدير ROI"؛ 10-12. تحليل عدد من المجاميع البروتين باستخدام القائمة الأمر "تحليل" و "تحليل الجسيمات". الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الكاشف | وصفه | |
| 2٪ منصات agarose | 1. تزن 0.5 غرام من agarose في كوب الزجاج أسطواني. | |
| 2. إضافة 25 مل من M9 العازلة. | ||
| 3. سخني في ميكروويف حتى قريب من الغليان. أخرج، يُحرّك مع طرف ماصة ويغلي مرة أخرى. كرر حتى يتم حل agarose. | ||
| 4. ضع شريحة المجهر فارغة على مقاعد البدلاء. | ||
| 5. ضع قطرة (~ 50 ميكرولتر) من محلول agarose الطازج 2٪ في منتصف الشريحة. | ||
| 6. اتخاذ شريحة المجهر الثاني ووضعها على رأس قطرة agarose. اضغط بلطف لأسفل لتسطيح قطرة. | ||
| 7. اسمحوا agarose تصلب لمدة 30 ثانية وإزالة بلطف الشريحة المجهر الأعلى. | ||
| 8. المضي قدما على الفور مع إعداد العينة، منذ منصات agarose ستبدأ التجفيف في غضون 5 دقائق تقريبا. | ||
| نصيحة: اترك الشريحة العليا المجهر كغطاء للحفاظ على الرطوبة لفترة أطول (~ 1 ساعة). وهكذا، يمكن إعداد عدة منصات agarose واستخدامها بسرعة خلال التجارب. | ||
| M9 المخزن المؤقت | 1. اذاب 3 غرام من KH2PO4،6 غرام مننا 2HPO4،5 غرام من NaCl في 1 لتر من الماء المقطر والأوتوكلاف. | |
| 2. تُترك باردة وأضيف 1 مل من 1 م مغسو4 (معقمة). | ||
| 3. مخزن M9 العازلة في 4 درجة مئوية. | ||
| نمو النيماتودا متوسطة (NGM) لوحات أجار | 1. مزيج 3 غرام من NaCl، 2.5 غرام من bactopeptone، 0.2 غرام من ستريبتوميسين، 17 غرام من أجار وإضافة 900 مل من الماء المقطر. أوتوكلاف. | |
| 2. السماح بارد إلى 55-60 درجة مئوية. | ||
| 3. إضافة 1 مل من محلول مخزون الكوليسترول، 1 مل من 1 م CaCl2،1 مل من 1 M MgSO4،1 مل من محلول الأسهم النيستاتين، 25 مل من معقمة 1 م عازلة الفوسفات، pH 6.0، والمياه المقطرة المعقمة تصل إلى 1 لتر. | ||
| 4. Pipette 10 مل من المتوسط في طبق بيتري ويترك لترسيخ. | ||
| 5. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية حتى استخدامها. | ||
الجدول 1: الوصفات الموصى بها للكاشف المستخدم. جميع وصفات الكواشف المستخدمة في البروتوكول المقدمة هي مبينة هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، نقدم ونصف منهجيات يمكن الوصول إليها على نطاق واسع للنمو ، والتزامن والفحص المجهري لبعض نماذج C. elegans متعددة الاستخدامات التي تحقق في التنكس العصبي المعتمد على العمر. على وجه الخصوص، نحن تقييم وتشريح الأسس الخلوية والجزيئية من العمر المرتبطة انهيار الخلايا العصبية باستخدام فرط تنشيط قناة الناجمة عن نخر والبروتين الناتجة عن اخصائيات عصبيةالناتجة عن 1،2،33،4،5،77،9،10،11.
على الرغم من أن الإجراءات الموصوفة لتقييم موت الخلايا الحية واضحة ويمكن إجراؤها بسهولة في أي مختبر، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. ومن المعروف أن تقييد السعرات الحرارية والتجويع للحث على مسارات الإجهاد متعددة، مثل autophagy، التي قد تتداخل مع تنكس الأعصاب أو تراكم البروتين13،15،16. وهكذا، ينبغي استخدام الديدان الخيطية التي تتغذى بشكل جيد وغير جائعة. الصدمة الحرارية المسبقة يمنح neuroprotection ضد العديد من المحفزات العصبية ويستخدم باعتبارها الخلية المنشأة موت المغير11,13. ومع ذلك، بعض المسوخ عرضة لارتفاع درجة الحرارة التعرض لفترات طويلة. وهكذا، ينبغي أن يتم تحديد مرحلة النمو المناسبة، والعمر ومدة الشرط المسبق للصدمات الحرارية على سبيل التجربة في كل مرة، عندما تستخدم الحيوانات ذات الخلفيات الجينية المختلفة، التي قد تكون حساسة لدرجات الحرارة العالية. لوحظ زيادة تدريجية في النيماتودي الأمعاء autofluorescence أثناء الشيخوخة. وهكذا، ينبغي تجنب أجسام الخلايا العصبية والعمليات القريبة من منطقة الأمعاء أثناء عملية التصوير من سلالة AM101. التركيز على الخلايا العصبية, التي تقع في منطقة الرأس و / أو الذيل لتجاوز الأمعاء المشتقة من الأمعاء autofluorescence. استخدام M9 العازلة بدلا من الماء لتوليد M9 / levamisome العازلة و 2 ٪ منصات agarose. M9 العازلة ضمان بيئة تناضحة مواتية حماية الديدان الخيطية من الجفاف في جميع أنحاء التصور المجهري والتحليل.
وتؤكد المنهجيات الموصوفة أن الجمع بين نماذج الديدان الخيطية للانحلال العصبي، إلى جانب الشاشات الوراثية والدوائية لمُنَحَّات موت الخلايا يمكن أن يؤدي إلى فهم غير مسبوق لضعف الدوائر العصبية المرتبطة بالعمر، وتعزيز تطوير تدخلات علاجية جديدة ضد الاضطرابات العصبية التي تعزز صحة الإنسان ونوعية الحياة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن أي مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نشكر تشانيوتاكيس م. وكوناكيس ك. لتسجيل الفيديو وتحريره. يتم تمويل شركة K.P. من منحة من المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار والأمانة العامة للبحوث والتكنولوجيا (GSRT). يتم تمويل N.T. من خلال منح من مجلس البحوث الأوروبي (ERC - GA695190 - MANNA) ، وبرامج إطار عمل المفوضية الأوروبية ، ووزارة التعليم اليونانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
