Summary
Her introducerer og beskriver vi bredt tilgængelige metoder ved hjælp af nogle alsidige nematodemodeller, herunder hyperaktiverede ionkanalinducerede nekrose og proteinaggregat-induceret neurotoksicitet, til at overvåge og dissekere de cellulære og molekylære fundamenter af aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme.
Abstract
Bekæmpelse af menneskelige neurodegenerative patologier og styring af deres gennemgribende socioøkonomiske virkninger er ved at blive en global prioritet. På trods af deres skadelige virkninger på menneskers livskvalitet og sundhedssystemet er størstedelen af de menneskelige neurodegenerative lidelser stadig uhelbredelige og ikke-forebyggelige. Derfor er udviklingen af nye terapeutiske indgreb mod sådanne sygdomme ved at blive en presserende presserende. Aldersrelateret forringelse af neuronal kredsløb og funktion er evolutionært bevaret i organismer så forskellige som den ringe orm Caenorhabditis elegans og mennesker, der betyder ligheder i de underliggende cellulære og molekylære mekanismer. C. elegans er en meget formbar genetisk model, som tilbyder et velcertet nervesystem, kropsgennemsigtighed og et varieret repertoire af genetiske og billeddannelsesteknikker til vurdering af neuronal aktivitet og kvalitetskontrol under aldring. Her introducerer og beskriver vi metoder, der anvender nogle alsidige nematodemodeller, herunder hyperaktiveret ionkanalinduceret nekrose (f.eks. deg-3(d) og mec-4(d)) og proteinaggregat (f.eks. α-syunclein og poly-glutamat)-induceret neurotoksicitet, til at overvåge og dissekere det cellulære og molekylære fundament af aldersrelateret neuronal nedbrydning. En kombination af disse dyreneurodegenerationsmodeller vil sammen med genetiske og farmakologiske skærme for celledødsmodulatorer føre til en hidtil uset forståelse af aldersrelateret nedbrydning af neuronal funktion og vil give kritisk indsigt med bred relevans for menneskers sundhed og livskvalitet.
Introduction
I løbet af de sidste to årtier har C. elegans været meget anvendt som en model organisme til at undersøge de molekylære mekanismer af nekrotisk celledød. C. elegans tilbyder en usædvanlig godt karakteriseret og kortlagt nervesystem, gennemsigtig kropsstruktur og et varieret repertoire af genetiske og billeddannelse metoder til at overvåge in vivo cellulære funktion og overlevelse gennem hele aldring. Således, flere C. elegans genetiske modeller af neurodegeneration er allerede blevet udviklet til at vurdere neuronal levedygtighed. Især godt beskrevet og brugt nematode modeller omfatter hyperaktive ion kanal-induceret nekrose1,,2,3 ogcelledød udløst af øget protein aggregering4,,5,6,7,8,9,10 og hedeslag11,12, blandt andre.8
Kortvarig udsættelse for subfartale temperaturer gav resistens mod nekrotisk celledød, udløst af en efterfølgende varmestress både hos nematoder og pattedyr neuroner11. Interessant nok beskytter daglig forkonditionering af nematoder ved en mild forhøjet temperatur mod neurodegeneration, som er forårsaget af forskellige stimuli, såsom ioniske ubalance (f.eks. mec-4(u231) og/eller deg-3(u662)) og proteinaggregering (f.eks. α-synuclein og polyQ40)11,13.
Her beskriver vi alsidige metoder ved hjælp af C. elegans til at overvåge og evaluere aldersafhængig neurodegeneration i veletablerede modeller af sygdomme hos mennesker, såsom excitotoxicity-udløst celledød, Parkinsons og Huntingtons Sygdom. Desuden understreger vi den neuroprotektive rolle varmeforkonditionering i flere modeller af neurodegeneration. En kombination af disse teknikker sammen med genetiske og/eller farmakologiske skærme vil resultere i identifikation og karakterisering af nye celledødsmodulatorer med potentiel terapeutisk interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nekrotisk celledød-induceret af hyperaktive ion kanaler
BEMÆRK: Gain-of-function mutationer i genfamilien af degeneriner, herunder mec-4 og deg-3 blandt andre, resulterer i generation af hyperaktive ion kanaler udløser nekrotisk celledød af seks touch receptor neuroner kræves for mechanosensation i orme3. Nekrose fremkaldt af afvigende stimulation af degeneriner viser flere mekanistiske og morfologiske ligheder med excitotoxicity hos pattedyr. Vedligeholdelse af energimetabolisme og calciumhomøostase spiller en afgørende rolle for neuronal overlevelse under nekrose11. Følgende stammer kan bruges til at overvåge nekrotisk celledød udløst af hyperaktive ionkanaler, mec-4(u231)X og deg-3(u662)V.
- Vedligeholdelse, synkronisering og forberedelse af mutantorme til undersøgelse af nekrotisk celledød
- Dag 1: Pluk L4-larver af mec-4(u231) eller deg-3(u662) mutante nematoder på Nematode Growth Media (NGM; Tabel 1) plader, der er seedet med Escherichia coli (OP50) ved hjælp af et dissekerende stereomikroskop.
- 10 L4 nematoder pr. NGM-plade på plads og dyrkning af dem ved standardtemperaturen på 20 °C.
- Dag 5: Pladerne vaskes med 1 ml M9-buffer (tabel 1) og opsaml dyrene i et 1,5 ml rør.
- Centrifuge ved 10.000 x g i 30 s og fjern supernatanten.
- Der tilsættes 0,5 ml blegeopløsning (7 ml H2O, 1 ml 5 N NaOH og 2 ml blegemiddel).
BEMÆRK: Blegning løsning gradvist mister sin effektivitet; derfor bør det være forberedt dagligt. - Vortex og overvåge med jævne mellemrum, indtil ormene er opløst.
BEMÆRK: Undgå blegning i længere tid end 5 min, da embryonernes levedygtighed vil blive påvirket. - Centrifuge ved 10.000 x g i 30 s og fjern supernatanten.
- Pellet (æg) vaskes to gange med 1 ml M9-buffer.
- Efter vask opslævning af æggene i 200 μL M9 buffer og inkubere dem i 25 min ved 34 °C i et vandbad.
- Der opretholdes en særskilt gruppe af kontrolprøve (æg) ved 20 °C.
- Pipette 100 μL kontrol eller varmechok-behandlede æg og læg dem på unseeded NGM plader. Hver plade indeholder mindst 100-200 æg.
- Rugeægt æggene ved 20 °C indtil klækning.
- Montering af L1-larver til undersøgelse ved hjælp af differentialinterferenskontrast (DIC; Nomarsky) mikroskopi
- Forbered 2% agarose puder.
- Brug 1 ml M9 buffer til at vaske pladerne og opsamle L1 larver nematoder i 1,5 ml rør.
- Centrifuge ved 10.000 x g i 30 s.
- Fjern supernatant og holde pellet (nematoder).
- Der tilsættes 100 μL 20 mM M9/levamisole buffer til at forsegle nematoderne.
BEMÆRK: Undgå natriumazid som bedøvelsesmiddel. Natriumazid udløser mitokondriel skade og oxidativ stress, der i sidste ende fører til induktion af celledød - Pipette 10 μL M9/levamisole buffer indeholdende L1 orme og montere dem på 2% agarose puder (Tabel 1).
- Anse forsigtigt en dækslip på toppen af prøven.
BEMÆRK: Seal coversl med neglelak for at bevare luftfugtigheden under hele processen med billeddannelse. - Overhold orme ved hjælp af differentialinterferenskontrast (DIC; Nomarsky) mikroskopi.
- Score neurodegeneration af de seks touch receptor neuroner ved at tælle celler med den karakteristiske vakuoleret udseende pr nematode.
2. Protein aggregat-induceret neurodegeneration
BEMÆRK: Følgende stammer kan anvendes til at undersøge proteinaggregater-induceret neurotoksicitet: (A) overekspression af human α-synuclein i dopaminerge neuroner, UA44: Er[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] og (B) overekspression af humant polyglutaminprotein (PolyQ) pan-neuronally, AM101: rmsIs110[pgef-1Q40::YFP]6,10.
- Vedligeholdelse, synkronisering og klargøring af transgene nematoder til neurodegenerationsanalyse
- Brug et dissekeret stereomikroskop til at overvåge C. elegans udvikling og vækst.
- Dag 1: Synkroniser populationen af transgene nematoder ved at plukke og overføre 15-20 L4 larver af hver belastning på frisk OP50-seedede NGM plader.
BEMÆRK: Brug mindst tre plader af hver stamme pr. betingelse. - Inkuberes og nematoderne skal vokse ved standardtemperaturen på 20 °C.
- Dag 2: Udfør daglig forkonditionering i 30 minutter ved at overføre pladerne i en inkubator indstillet til 34 °C. Derefter returneres de forkonditionerede nematoder tilbage ved standardtemperaturen på 20 °C.
BEMÆRK: Forskellige genetiske baggrunde kan være følsomme over for høj temperatur i lange perioder eksponering. - (A)Hvis undersøge overekspression af human α-synuclein i dopaminerge neuroner, UA44: Er[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: på dag 9, overvåge 7-dage gamle transgene nematoder for dopaminerge neuronal celledød.
- (B)Hvis der undersøges overekspression af humant polyglutaminprotein (PolyQ) pan-neuronalt, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: på dag 5 måles neuronale PolyQ-aggregater i hovedregionen på 4 dage gamle transgene dyr, der udtrykker Q40::YFP.
- Montering af prøverne til mikroskopisk undersøgelse
- Forbered 2% agarose puder (Tabel 1).
- Der tilsættes 10 μL 20 mM M9/levamisole bufferdråb i midten af agarosepuden.
- De respektive transgene nematoder plukkes, og overfør dem i et M9/levamisoledrop.
BEMÆRK: Placer 20-30 nematoder pr. dråbe. - Der anbringes forsigtigt en dækslip på toppen af prøven.
BEMÆRK: Seal coversl med neglelak for at bevare luftfugtigheden under hele processen med billeddannelse. - Fortsætte med mikroskopisk undersøgelse af de respektive prøver.
- Anskaffelsesproces og dataanalyse af transgene nematoder, der co-udtrykker α-synuclein og cytosolic GFP i dopaminerge neuroner
- Brug et epifluorescensmikroskop kombineret med et kamera (f.eks.
- Registrer og tag z-stack billeder af hovedregionen ved 20x forstørrelse.
- Gem og saml billederne med maksimal intensitetsprojektion.
- Fortsæt til analysen af de erhvervede billeder.
- De transgene orme til neurodegeneration undersøges ved at score følgende cellulære egenskaber, (i) tab af fluorescens fra neuroner, der udtrykker gfp under initiativ af dat-1,(ii) neuroner, der viser soma og/eller axonal blebbing, udvækst eller dendritisk tab.
- Importér og analyser data ved hjælp af en softwarepakke (f.eks.
3. Anskaffelsesproces og dataanalyse af transgene nematoder, der udtrykker pan-neuronally PolyQ40 fusioneret med YFP
- Brug et epifluorescensmikroskop kombineret med et kamera (f.eks.
- Registrer og tag z-stack billeder af hovedregionen ved 20x forstørrelse.
- Gem og saml billederne med maksimal intensitetsprojektion.
- Fortsæt til analysen af de erhvervede billeder ved hjælp af Fiji-software.
- Åbn billeder med Fiji program14.
- Vælg Kommandoen Opdel kanaler via rullemenuen Billede og farve. Image
BEMÆRK: Behold billedet af den grønne kanal. - Brug frihåndsvalgværktøjet til manuelt at indstille det fluorescerende område af interesse (ROI, f.eks. hoved).
- Tilføj det respektive investeringsafkast i ROI Manager via rullemenuen Analysér og værktøjer. Analyze
- Træk baggrunden fra 50 % ved at vælge Proces og Subtraher baggrund.
- Konfigurer og anvend tærskelværdier via menukommandoen Billede | Juster | Tærskel. Bevar og angiv de samme tærskelværdier i hele billedanalysen af hele eksperimentet.
- Vælg det respektive investeringsafkast fra ROI Manager.
- Analysér antallet af proteinaggregater ved hjælp af menukommandoen Analysér og analysér partikler.
- Gentag trin 3.5-3.12 for hvert erhvervet billede.
- Kopiér visningsværdierne fra det separate resultatvindue.
- Indsæt/importér og analyser resultaterne ved hjælp af en softwarepakke.
4. Rapportér statistisk analyse
- Der anvendes mindst 30 nematoder til hver forsøgstilstand. Udfør tre biologiske replikater.
- Brug statistisk analysesoftware til enten at udføre studentert-test(sammenligning mellem to grupper) eller ANOVA (sammenligning mellem flere grupper) til statistisk analyse med p < 0,05 som signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nekrotisk celledød-induceret af hyperaktive ion kanaler
Ved hjælp af de procedurer, der præsenteres her, blev mec-4(u231) og deg-3u662) mutantembryoner enten inkuberet i 25 min ved 34 °C eller opbevaret ved standardtemperaturen på 20 °C. Ved udklækning blev antallet af neuronale cellelige lig bestemt i L1 larve fase af begge grupper. Nekrotisk celledød formindskes i nematoder, der udklækkes af varmechokkonditionerede æg (Figur 1A-1B).
Protein aggregat-induceret neurodegeneration
Transgene nematoder, der overekspresser (A) humant α-synuclein og cytoplasmatisk gfp i dopaminerge neuroner og (B) humant polyglutaminprotein (PolyQ) fusioneret med YFP pan-neuronal, blev dagligt eksponeret i 30 min. ved 34 °C. Varmechok forkonditionering fremmer neuroprotection mod α-synuclein-induceret celledød hos 7-dagesgamle voksne hermafroditter (Figur 2A) og nedsætter Q40::YFP proteinaggregater i hovedregionen for 4-dagesgamle voksne (Figur 2B og Figur 3).
Figur 1: Hyperaktiv ionkanalinduceret nekrose. (A)Repræsentativt DIC-mikroskopibillede af mec-4(u231) L1 larver med pilespidser, der angiver karakteristiske nekrotiske vakuoler. På et tidligt stadium af neurodegeneration hævede kerner vises i cellerne. Billedet blev erhvervet ved hjælp af en 40x indsigelse linse. Skalabar, 20 μm. B) Antal neuronalcellekroppe i L1-larvestadiet pr. 100 dyr, der bærer de neurotoksiske mec-4(u231) eller deg-3(u662) alleler. Nekrotisk celledød undertrykkes i L1-larver udklækket af forkonditionerede æg sammenlignet med ubehandlede modstykker (n= 100 dyr pr. genotype og analyse; Data repræsenterer middelværdi ±S.E.M., ***P< 0,001 for ubehandlet versus forkonditioneret; t-test) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Daglig forkonditionering ved 34 °C giver neuroprotection mod α-synuclein og nedsætter polyQ-aggregater i C. elegans. (Α) Overlevelse af forreste dopaminerge neuroner (CEPs og AKE) i ubehandlede og forkonditionerede nematoder, der samtidig udtrykker cytoplasmatisk GFP sammen med det humane α-synuclein. Forkonditioneret nematoder viser forbedret neuroprotection sammenlignet med ubehandlet. Rester af neuronalcellekroppe (stjerner) og axonal beading (pilespidser) ses i ubehandlede nematoder (øverste panel). Både soma (stjerner) og neuronale processer (pilespidser) bevares ved forkonditionering. Billeder erhvervet ved hjælp af en 20x indsigelse linse og skildre maksimal intensitet z-projektion. Erhvervelse detaljer: Bright, 0,15. Skalabar, 20 μm. Orme blev scoret for neuronal overlevelse af den forreste dopaminerge neuroner på den syvende dag i voksenalderen. (B) Neuronal polyQ aggregater opdaget på den fjerde dag i voksenalderen i hovedet region af ubehandlede og forkonditionerede transgene nematoder. Forhåndsbetingelser transgene orme giver mindre neuronal Q40::YFP aggregater sammenlignet med ubehandlet. Repræsentative billeder af hovedregionen vises med pilespidser, der angiver polyQ-proteinaggregater i neuronale celler. Billeder erhvervet ved hjælp af en 20x indsigelse linse og skildre maksimal intensitet z-projektion. Erhvervelse detaljer: Bright, 0,0175. Skalabar, 20 μm. 30-35 dyr blev kvantificeret pr. betingelse i hvert af tre uafhængige forsøg. Data repræsenterer middel ±S.E.M., ***P < 0,05, ikke-pararrett-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Billedanalyse ved hjælp af Fiji-software. 1. Åbn et erhvervet billede med Fiji-software; 2. Vælg kommandoen "Split channel" via rullemenuen "Billede" og "Farve" for at konvertere billedet. 3, 4. Hold "grøn kanal" billede og ved hjælp af "frihåndsvalg" værktøj, indpakke fluorescerende region af interesse (ROI, f.eks hoved). Tilføj det respektive investeringsafkast i rullemenuen "ROI Manager" via rullemenuen "Analysér" og "Værktøjer". 5, 6. Træk baggrunden fra 50 % ved at vælge "Proces" og "Subtraher baggrund". 7, 8. Konfigurer og anvend tærskelværdier via menukommandoen "Billede", "Juster" og "Tærskel". 9. Vælg det respektive investeringsafkast fra "ROI Manager"; 10-12. Analysér antallet af proteinaggregater ved hjælp af menukommandoen "Analysér" og "Analysér partikler". Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Opskrift | |
| 2% agarose puder | 1. Afveje 0,5 g agarose i et cylindrisk glasbæger. | |
| 2. Tilsæt 25 ml M9-buffer. | ||
| 3. Varm i en mikrobølgeovn, indtil tæt på kogning. Tag ud, rør med en pipette spids og kog igen. Gentag indtil agarose er opløst. | ||
| 4. Placer et tomt mikroskop på bænken. | ||
| 5. Læg en dråbe (~ 50 μL) af frisk 2% agaroseopløsning i midten af diaset. | ||
| 6. Tag en anden mikroskop dias og placere den på toppen af agarose drop. Tryk forsigtigt ned for at flade ned. | ||
| 7. Lad agarose hærde i 30 sekunder og fjern forsigtigt det øverste mikroskopdias. | ||
| 8. Fortsæt straks med prøveforberedelsen, da agarosepuderne begynder at tørre inden for ca. 5 minutter. | ||
| Tip: Lad det øverste mikroskop glide som et dække for at bevare luftfugtigheden længere (~ 1 time). Således kan flere agarose puder forberedes og bruges hurtigt under forsøgene. | ||
| M9-buffer | 1. 3 g KH2PO4 opløses,6 g Na2HPO4, 5 g NaCl i 1 L destilleret vand og autoklave. | |
| 2. Lad afkøle og tilsæt 1 ml 1 M MgSO4 (steril). | ||
| 3. Opbevar M9-bufferen ved 4 °C. | ||
| Nematode vækst medium (NGM) agar plader | 1. Bland 3 g NaCl, 2,5 g bactopeptone, 0,2 g streptomycin, 17 g agar og tilsæt 900 ml destilleret vand. Autoklave. | |
| 2. Lad afkøle til 55-60 °C. | ||
| 3. Tilsæt 1 ml kolesterolbestandopløsning, 1 ml 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4,1 ml nystatinlageropløsning, 25 ml steril 1 M fosfatbuffer, pH 6,0 og destilleret sterilt vand op til 1 L. | ||
| 4. Pipette 10 ml medium pr petriskål og lad det størkne. | ||
| 5. Opbevar pladerne ved 4 °C, indtil de anvendes. | ||
Tabel 1: Anbefalede opskrifter på anvendte reagenser. Alle de reagenser opskrifter, der anvendes i den præsenterede protokol er skitseret her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her introducerer og beskriver vi bredt tilgængelige metoder til vækst, synkronisering og mikroskopisk undersøgelse af nogle alsidige C. elegans modeller, der undersøger aldersafhængig neurodegeneration. Vi vurderer og dissekerer især det cellulære og molekylære fundament af aldersrelateret neuronal nedbrydning ved hjælp af hyperaktiveret ionkanalinduceret nekrose og proteinaggregatinduceret neurotoksicitet1,,2,3,4,55,7,9,10,11.
Selv om de beskrevne procedurer for in vivo-celledødsvurdering er ligetil og let kan udføres i ethvert laboratorium, er der nogle kritiske skridt, der bør tages i betragtning. Kaloriefattige restriktioner og sult er kendt for at fremkalde flere stressveje, såsom autofagi, der kan forstyrre neurodegeneration eller proteinaggregater akkumulering13,,15,16. Således bør velnærede og ikke-udsultede nematoder anvendes. Varmechokforkonditionering giver neuroprotektion mod flere neurodegenerative stimuli og anvendes som en etableret celledødsmodulator11,13. Nogle mutanter er dog modtagelige for høj temperatur eksponering i lange perioder. Det bør derfor eksperimentelt bestemmes, hvordan varmechokforkonditioneringsgraden skal være passende, når der anvendes dyr med forskellig genetisk baggrund, som kan være følsomme over for høje temperaturer, hvis der anvendes dyr med forskellig genetisk baggrund, som kan være følsomme over for høje temperaturer. En gradvis stigning i nematode intestinal autofluorescens er observeret under aldring. Således, neuronal celle organer og processer tæt på tarmområdet bør undgås under billeddannelse proces af AM101 stamme. Fokus på neuronale celler, som er placeret i hovedet og / eller hale regionen for at omgå tarm-afledt autofluorescens. Brug M9 buffer i stedet for vand til at generere M9/levamisome buffer og 2% agarose puder. M9 buffer sikrer et gunstigt osmotisk miljø, der beskytter nematoderne mod at tørre ud i hele den mikroskopiske visualisering og analyse.
De beskrevne metoder understreger, at kombinationen af nematoder modeller af neurodegeneration, sammen med genetiske og farmakologiske skærme for celledød modulatorer kunne føre til en hidtil uset forståelse af alder-associeret svækkelse af neuronal kredsløb og øge udviklingen af nye terapeutiske indgreb mod neurodegenerative lidelser fremme menneskers sundhed og livskvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Chaniotakis M. og Kounakis K. for videooptagelse og redigering. K.P. finansieres af et tilskud fra Den Hellenske Fond for Forskning og Innovation (HFRI) og Generalsekretariatet for Forskning og Teknologi (GSRT). N.T. finansieres af tilskud fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC – GA695190 – MANNA), Europa-Kommissionens rammeprogrammer og det græske undervisningsministerium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
