Summary
Aquí, introducimos y describimos metodologías ampliamente accesibles que utilizan algunos modelos versátiles de nematodos, incluyendo necrosis inducida por canales de iones hiperactivados y neurotoxicidad inducida por agregados de proteínas, para monitorear y diseccionar los fundamentos celulares y moleculares de las enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad.
Abstract
La lucha contra las patologías neurodegenerativas humanas y la gestión de su impacto socioeconómico generalizado se está convirtiendo en una prioridad mundial. A pesar de sus efectos perjudiciales sobre la calidad de vida humana y el sistema sanitario, la mayoría de los trastornos neurodegenerativos humanos siguen siendo incurables y no prevenibles. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas contra tales enfermedades se está convirtiendo en una urgencia apremiante. El deterioro y la función neuronales asociados a la edad se conserva evolutivamente en organismos tan diversos como el humilde gusano Caenorhabditis elegans y los seres humanos, lo que significa similitudes en los mecanismos celulares y moleculares subyacentes. C. elegans es un modelo genético altamente maleable, que ofrece un sistema nervioso bien caracterizado, transparencia corporal y un diverso repertorio de técnicas genéticas y de imagen para evaluar la actividad neuronal y el control de calidad durante el envejecimiento. Aquí, introducimos y describimos metodologías que utilizan algunos modelos versátiles de nematodos, incluyendo necrosis inducida por canal de iones hiperactivado (por ejemplo, deg-3(d) y mec-4(d)) y agregado de proteínas (por ejemplo, neurotoxicidad inducida por é-syunclein y poli-glutamato), para monitorear y diseccionar los elementos celulares moleculares y discretos de la descomposición celular y relacionada con la edad. Una combinación de estos modelos de neurodegeneración animal, junto con las pantallas genéticas y farmacológicas para los moduladores de muerte celular conducirá a una comprensión sin precedentes de la descomposición de la función neuronal relacionada con la edad y proporcionará conocimientos críticos con amplia relevancia para la salud humana y la calidad de vida.
Introduction
Durante las últimas dos décadas, C. elegans ha sido ampliamente utilizado como un organismo modelo para investigar los mecanismos moleculares de la muerte celular necrótica. C. elegans ofrece un sistema nervioso excepcionalmente bien caracterizado y mapeado, una estructura corporal transparente y un diverso repertorio de métodos genéticos y de imagen para monitorear la función celular in vivo y la supervivencia durante todo el envejecimiento. Por lo tanto, varios modelos genéticos de C. elegans de neurodegeneración ya han sido desarrollados para evaluar la viabilidad neuronal. En particular, los modelos de nematodos bien descritos y usados incluyen la necrosis inducida por el canal deioneshiperactivos 1 ,2,3 y la muerte celular desencadenada por el aumento de la agregación de proteínas4,5,6,7,8,9,10 y la carrera de calor11,12, entre otros.,
La exposición a corto plazo a temperaturas sub letales confirió resistencia a la muerte de células necróticas, provocada por una posterior tensión térmica tanto en nematodos como en neuronas de mamíferos11. Curiosamente, el preacondicionamiento diario de nematodos a una temperatura elevada suave protege contra la neurodegeneración, que es infligida por diversos estímulos, tales como desequilibrio iónico (por ejemplo, mec-4(u231) y/o deg-3(u662)) y la agregación de proteínas (por ejemplo, sinucleína y poliQ40)11,13.
Aquí, describimos metodologías versátiles utilizando C. elegans para monitorear y evaluar la neurodegeneración dependiente de la edad en modelos bien establecidos de enfermedades humanas, como la muerte celular desencadenada por excitotoxicidad, el Parkinson y la enfermedad de Huntington. Además, subrayamos el papel neuroprotector del preacondicionamiento térmico en varios modelos de neurodegeneración. Una combinación de estas técnicas junto con pantallas genéticas y/o farmacológicas dará lugar a la identificación y caracterización de nuevos moduladores de muerte celular, con potencial interés terapéutico.
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Protocol
1. Células necróticas inducidas por canales iónicos hiperactivos
NOTA: Las mutaciones de ganancia de función en la familia genética de degenerinas, incluyendo mec-4 y deg-3 entre otros, dan como resultado la generación de canales de iones hiperactivos que desencadenan la muerte de células necróticas de seis neuronas receptoras táctiles necesarias para la mecanosensación en gusanos3. La necrosis inducida por la estimulación aberrante de degenerinas muestra varias similitudes mecanicistas y morfológicas con la excitotoxicidad en mamíferos. El mantenimiento del metabolismo energético y la homeostasis de calcio tiene un papel crucial en la supervivencia neuronal durante la necrosis11. Las siguientes cepas se pueden utilizar para monitorear la muerte de células necróticas desencadenadas por canales de iones hiperactivos, mec-4(u231)X y deg-3(u662)V.
- Mantenimiento, sincronización y preparación de gusanos mutantes para el examen de la muerte de células necróticas
- Día 1: Escoja larvas L4 de nematodos mutantes mec-4(u231) o deg-3(u662) en los medios de crecimiento de nematodos (NGM; Tabla 1) placas sembradas con Escherichia coli (OP50) usando un estereomicroscopio diseccionador.
- Colocar 10 nematodos L4 por placa NGM sembrada y cultivarlos a la temperatura estándar de 20 oC.
- Día 5: Lavar las placas con 1 ml de tampón M9(Tabla 1) y recoger los animales en un tubo de 1,5 ml.
- Centrifugar a 10.000 g durante 30 s y retire el sobrenadante.
- Añadir 0,5 ml de solución de blanqueo (7 ml de H2O, 1 ml de 5 N NaOH y 2 ml de lejía).
NOTA: La solución de blanqueo pierde gradualmente su eficiencia; por lo tanto, debe prepararse diariamente. - Vórtice y monitoree periódicamente hasta que los gusanos se hayan disuelto.
NOTA: Evite el blanqueo durante períodos superiores a 5 minutos porque la viabilidad de los embriones se verá afectada. - Centrifugar a 10.000 g durante 30 s y retire el sobrenadante.
- Lavar dos veces el pellet (huevos) con 1 ml de tampón M9.
- Después de lavar, resuspender los huevos en 200 l de tampón M9 e incubarlos durante 25 minutos a 34 oC en un baño de agua.
- Mantener un grupo separado de muestra de control (huevos) a 20 oC.
- Pipetear 100 l de huevos de control o de calor tratados con choque y colocarlos en placas NGM no sesgados. Cada plato contiene al menos 100-200 huevos.
- Incubar los huevos a 20oC hasta la eclosión.
- Montaje de larvas L1 para el examen utilizando contraste de interferencia diferencial (DIC; Nomarsky) microscopía
- Prepare almohadillas de agarosa del 2%.
- Utilice 1 ml de tampón M9 para lavar las placas y recoger nematodos larvanos L1 en tubos de 1,5 ml.
- Centrífuga a 10.000 g para 30 s.
- Retire el sobrenadante y conserve el pellet (nematodos).
- Añadir 100 l de 20 mM de tampón M9/levamisole para anestesiar los nematodos.
NOTA: Evite el azida sódica como anestésico. El azida sódica desencadena daño mitocondrial y estrés oxidativo que conduce eventualmente a la inducción de la muerte celular - Pipetear 10 l de tampón M9/levamisole que contenga gusanos L1 y montarlos en almohadillas de agarosa del 2% (Tabla 1).
- Coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior de la muestra.
NOTA: Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas para preservar la humedad durante todo el proceso de toma de imágenes. - Observe los gusanos utilizando contraste de interferencia diferencial (DIC; Nomarsky).
- Puntuar la neurodegeneración de las seis neuronas receptoras táctiles mediante el recuento de las células con la apariencia vacuolada característica por nematodo.
2. Neurodegeneración inducida por agregados de proteínas
NOTA: Las siguientes cepas se pueden utilizar para investigar la neurotoxicidad inducida por agregados proteicos investigados: (A) sobreexpresión de la sinucleína humana en neuronas dopaminérgicas, UA44: Es[baIn1; pdat-1á-syn, pdat-1GFP] y (B) sobreexpresión de proteína de poliglutamina humana (PolyQ) pan-neuronalmente, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
- Mantenimiento, sincronización y preparación de nematodos transgénicos para ensayo de neurodegeneración
- Utilice un estereomicroscopio diseccionado para monitorear el desarrollo y crecimiento de C. elegans.
- Día 1: Sincronice la población de nematodos transgénicos recogiendo y transfiriendo 15-20 larvas L4 de cada cepa en placas NGM recién sembradas de OP50.
NOTA: Utilice al menos tres placas de cada cepa por condición. - Incubar y dejar que los nematodos crezcan a una temperatura estándar de 20oC.
- Día 2: Realizar el preacondicionamiento diario durante 30 minutos transfiriendo las placas en una incubadora establecida a 34oC. A continuación, devuelva los nematodos preacoso a la temperatura estándar de 20 oC.
NOTA: Diferentes antecedentes genéticos pueden ser sensibles a las altas temperaturas durante largos períodos de exposición. - (A) Si se investiga la sobreexpresión de la sínucleina humana en las neuronas dopaminérgicas, UA44: Es[baIn1; pdat-1-syn,pdat-1GFP]: el día 9, controlar los nematodos transgénicos de 7 días de edad para la muerte celular neuronal dopaminérgica.
- (B) Si investiga la sobreexpresión de la proteína de poliglutamina humana (PolyQ) pan neuronalmente, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: el día 5, mida los agregados de PoliQ neuronales en la región principal de animales transgénicos de 4 días de edad que expresen Q40::YFP.
- Montaje de las muestras para el examen microscópico
- Preparar almohadillas de agarosa del 2% (Tabla 1).
- Añadir 10 l de 20 mM M9/levamisole buffer drop en el centro de la almohadilla de agarosa.
- Escoja los respectivos nematodos transgénicos y transeúncialos en una gota M9/levamisole.
NOTA: Coloque 20-30 nematodos por gota. - Coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior de la muestra.
NOTA: Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas para preservar la humedad durante todo el proceso de toma de imágenes. - Proceda al examen microscópico de las muestras respectivas.
- Proceso de adquisición y análisis de datos de nematodos transgénicos que co-expresan la sinucleína y la GFP citosólica en las neuronas dopaminérgicas
- Utilice un microscopio de epifluorescencia combinado con una cámara (por ejemplo, EVOS FL Auto 2).
- Detecte y capture imágenes de la pila z de la región principal con un aumento de 20 veces.
- Guarde y recopile las imágenes de proyección de intensidad máxima.
- Proceder al análisis de las imágenes adquiridas.
- Examine los gusanos transgénicos en busca de neurodegeneración puntuando las siguientes características celulares, (i) pérdida de fluorescencia por parte de las neuronas que expresan GFP bajo el promotor de las neuronas dat-1,ii) que muestran soma y/o blebbing axonal, crecimientos o pérdida dendrítica.
- Importe y analice los datos mediante un paquete de software (por ejemplo, Excel).
3. Proceso de adquisición y análisis de datos de nematodos transgénicos que expresan pan-neuronalmente PolyQ40 fusionado con YFP
- Utilice un microscopio de epifluorescencia combinado con una cámara (por ejemplo, EVOS FL Auto 2).
- Detecte y capture imágenes de la pila z de la región principal con un aumento de 20 veces.
- Guarde y recopile las imágenes de proyección de intensidad máxima.
- Proceder al análisis de las imágenes adquiridas mediante el uso de software de Fiji.
- Abrir imágenes con el programa Fiji14.
- Seleccione el comando Dividir canales a través del menú desplegable Imagen y color.
NOTA: Mantenga la imagen del canal verde. - Utilice la herramienta de selección a mano alzada para establecer manualmente la región fluorescente de interés (ROI; por ejemplo, cabeza).
- Agregue el ROI respectivo en ROI Manager a través del menú desplegable Analizar y herramientas.
- Restar el fondo al 50% seleccionando Procesar y Restar fondo.
- Configurar y aplicar valores de umbral a través del comando de menú Imagen ? Ajustar ? Umbral. Mantenga y establezca los mismos valores de umbral a lo largo del análisis de imágenes de todo el experimento.
- Seleccione el ROI respectivo en ROI Manager.
- Analice el número de agregados de proteínas mediante el comando de menú Analizar y analizar partículas.
- Repita los pasos 3.5-3.12 para cada imagen adquirida.
- Copie los valores de visualización de la ventana Resultados independiente.
- Pegue/Importe y analice los resultados utilizando un paquete de software.
4. Informe de análisis estadístico
- Utilice al menos 30 nematodos para cada condición experimental. Realice tres réplicas biológicas.
- Utilice software de análisis estadístico para realizar la prueba t-de los estudiantes (comparación entre dos grupos) o ANOVA (comparación entre varios grupos) para el análisis estadístico con p < 0.05 como significativo.
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Representative Results
Muerte celular necrótica inducida por canales iónicos hiperactivos
Utilizando los procedimientos presentados aquí, los embriones mutantes mec-4(u231) y deg-3u662) fueron incubados durante 25 min a 34 oC o mantenidos a una temperatura estándar de 20 oC. Tras la eclosión, el número de cadáveres celulares neuronales se determinó en la etapa larval L1 de ambos grupos. La muerte celular necrótica disminuye en los nematodos que eclosionaron a causa de los huevos preacobidos por choque de calor (Figura 1A-1B).
Neurodegeneración inducida por agregados de proteínas
Los nematodos transgénicos que sobreexpresan (A) la sinucleína humana y la SURGEN citoplasmático en las neuronas dopaminérgicas y (B) la proteína de poliglutamina humana (PolyQ) fusionada con YFP pan-neuronalmente, se expusieron diariamente durante 30 minutos a 34 oC. El preacondicionamiento del choque térmico promueve la neuroprotección contra la muerte celular inducida por sinucleína en hermafroditas adultas adultas de 7 días de edad (Figura 2A) y disminuye los agregados de proteína Q40::YFP en la región principal de adultos de 4 días de edad (Figura 2B y Figura 3).
Figura 1: Necrosis inducida por canal de iones hiperactivos. (A) Imagen representativa de la microscopía DIC de la larva mec-4(u231) L1, con puntas de flecha que indican vacuolas necróticas características. En la etapa temprana de la neurodegeneración se muestran núcleos hinchados dentro de las células. La imagen fue adquirida mediante el uso de una lente de objeción 40x. Barra de escala, 20 m. (B) Número de cadáveres celulares neuronales en la etapa larval L1 de desarrollo, por cada 100 animales que llevan los alelos neurotóxicos mec-4(u231) o deg-3(u662). La muerte celular necrótica se suprime en larvas L1 que eclosionan a partir de huevos precondicionados en comparación con sus homólogos no tratados (n.o 100 animales por genotipo y ensayo; Los datos representan la media de S.E.M., ***P< 0.001 para no tratados frente a precondicionado; t-test) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El preacondicionamiento diario a 34 oC confiere neuroprotección contra la sinucleína y disminuye los agregados de poliQ en C. elegans. ()Supervivencia de las neuronas dopaminérgicas anteriores (CEPs y ADEs) en nematodos no tratados y precondicionados co-expresando GFP citoplasmático junto con la sinucleína humana. Los nematodos precondicionados muestran una neuroprotección mejorada en comparación con los no tratados. Los restos de cuerpos celulares neuronales (asteriscos) y cuentas axonales (puntas de flecha) se observan en nematodos no tratados (panel superior). Tanto el soma (asteriscos) como los procesos neuronales (puntas de flecha) se conservan al preacondicionamiento. Las imágenes adquiridas mediante el uso de una lente de objeción 20x y representan la máxima intensidad de proyección z. Detalles de la adquisición: Bright, 0.15. Barra de escala, 20 m. Los gusanos fueron puntuados para la supervivencia neuronal de las neuronas dopaminérgicas anteriores en el séptimo día de la edad adulta. (B) áridos neuronales poliQ detectados en el cuarto día de la edad adulta en la región principal de nematodos transgénicos no tratados y precondicionados. Los gusanos transgénicos precondicionados presentan agregados Q40::YFP menos neuronales en comparación con los no tratados. Las imágenes representativas de la región de la cabeza se muestran con puntas de flecha que indican agregados de proteína poliQ en las células neuronales. Las imágenes adquiridas mediante el uso de una lente de objeción 20x y representan la máxima intensidad de proyección z. Detalles de la adquisición: Bright, 0.0175. Barra de escala, 20 m. 30-35 animales fueron cuantificados por condición en cada uno de los tres experimentos independientes. Los datos representan la media de la prueba tsin pares de S.E.M., ***P < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de imágenes mediante el uso de software Fiji. 1. Abra una imagen adquirida con el software Fiji; 2. Seleccione el comando "Dividir canal" a través del menú desplegable "Imagen" y "Color" para convertir la imagen; 3, 4. Mantenga la imagen de "canal verde" y utilizando la herramienta de "selección a mano alzada", envuelva la región fluorescente de interés (ROI; por ejemplo, cabeza). Agregue el ROI respectivo en "ROI Manager" a través del menú desplegable "Analizar" y "Herramientas"; 5, 6. Restar el fondo al 50% seleccionando "Proceso" y "Restar fondo"; 7, 8. Configurar y aplicar valores de umbral a través del comando de menú "Imagen", "Ajustar" y "Umbral"; 9. Seleccione el ROI respectivo en el "Administrador de ROI"; 10-12. Analizar el número de agregados de proteínas utilizando el comando de menú "Analizar" y "Analizar partículas". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | Receta | |
| 2% almohadillas de agarosa | 1. Pesar 0,5 g de agarosa en un vaso de precipitados de vidrio cilíndrico. | |
| 2. Agregue 25 mL de buffer M9. | ||
| 3. Caliente en un microondas hasta que esté cerca de hervir. Sacar, remover con una punta de pipeta y hervir de nuevo. Repita hasta que la agarosa se disuelva. | ||
| 4. Coloque una corredera de microscopio vacía en el banco. | ||
| 5. Coloque una gota (50 l) de solución fresca de agarosa al 2% en el centro de la diapositiva. | ||
| 6. Tome una segunda diapositiva del microscopio y colóquela encima de la gota de agarosa. Presione suavemente hacia abajo para aplanar la gota. | ||
| 7. Deje que la agarosa se endurezca durante 30 segundos y retire suavemente la corredera del microscopio superior. | ||
| 8. Proceder inmediatamente con la preparación de la muestra, ya que las almohadillas de agarosa comenzarán a secarse en aproximadamente 5 minutos. | ||
| Consejo: Deje el portaobjetos superior como una cubierta para preservar la humedad durante más tiempo (1 hora). Por lo tanto, varias almohadillas de agarosa se pueden preparar y utilizar rápidamente durante los experimentos. | ||
| Búfer M9 | 1. Disolver 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl en 1 L de agua destilada y autoclave. | |
| 2. Deje enfriar y agregue 1 mL de 1 M MgSO4 (estéril). | ||
| 3. Almacene el tampón M9 a 4 oC. | ||
| Placas de agar de medio de crecimiento de nematodos (NGM) | 1. Mezclar 3 g de NaCl, 2,5 g de bactopeptona, 0,2 g de estreptomicina, 17 g de agar y añadir 900 ml de agua destilada. Autoclave. | |
| 2. Deje enfriar a 55-60 oC. | ||
| 3. Añadir 1 ml de solución de caldo de colesterol, 1 ml de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 ml de solución en stock de nistatina, 25 ml de tampón estéril de 1 M de fosfato, pH 6.0 y agua estéril destilada de hasta 1 L. | ||
| 4. Pipetear 10 mL de medio por plato de Petri y dejar solidificar. | ||
| 5. Almacene las placas a 4 oC hasta que se utilicen. | ||
Tabla 1: Recetas recomendadas para reactivos utilizados. Aquí se describen todas las recetas de reactivos utilizadas en el protocolo presentado.
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Discussion
Aquí, introducimos y describimos metodologías ampliamente accesibles para el crecimiento, sincronización y examen microscópico de algunos modelos versátiles de C. elegans que investigan la neurodegeneración dependiente de la edad. En particular, evaluamos y diseccionamos los fundamentos celulares y moleculares de la descomposición neuronal relacionada con la edad mediante el uso de necrosis inducida por canales iónicos hiperactivados y neurotoxicidad inducida por agregados deproteínas 1,2,3,4,5,7,9,10,11.
Aunque los procedimientos descritos para la evaluación de la muerte celular in vivo son sencillos y se pueden realizar fácilmente en cualquier laboratorio, hay algunas medidas críticas que deben tenerse en cuenta. Se sabe que la restricción calórica y el hambre inducen múltiples vías de estrés, como la autofagia, que podrían interferir con la neurodegeneración o la acumulación de agregados proteicos13,,15,,16. Por lo tanto, se deben utilizar nematodos bien alimentados y no hambrientos. El preacondicionamiento del choque térmico confiere neuroprotección contra varios estímulos neurodegenerativos y se utiliza como un modulador de muerte celular establecido11,13. Sin embargo, algunos mutantes son susceptibles a la exposición a altas temperaturas durante largos períodos. Por lo tanto, la etapa de desarrollo adecuada, la edad y la duración del preacondicionamiento de los golpes térmicos deben determinarse experimentalmente cada vez, cuando se utilicen animales de diferentes orígenes genéticos, que puedan ser sensibles a las altas temperaturas. Durante el envejecimiento se observa un aumento gradual de la autofluorescencia intestinal de nematodos. Por lo tanto, los cuerpos celulares neuronales y los procesos cercanos a la zona intestinal deben evitarse durante el proceso de diagnóstico por imágenes de la cepa AM101. Concéntrese en las células neuronales, que se encuentran en la región de la cabeza y/o la cola para evitar la autofluorescencia derivada del intestino. Utilice Tampón M9 en lugar de agua para generar tampón M9/levamisoma y almohadillas de agarosa del 2%. El tampón M9 garantiza un entorno osmótico favorable que protege los nematodos de secarse a lo largo de la visualización y el análisis microscópicos.
Las metodologías descritas subrayan que la combinación de modelos de nematodos de neurodegeneración, junto con las pantallas genéticas y farmacológicas para los moduladores de muerte celular podrían conducir a una comprensión sin precedentes del deterioro de los circuitos neuronales asociados a la edad e impulsar el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas contra trastornos neurodegenerativos que promueven la salud humana y la calidad de vida.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a Chaniotakis M. y Kounakis K. por la grabación y edición de vídeo. K.P. está financiado por una subvención de la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (HFRI) y la Secretaría General de Investigación y Tecnología (GSRT). N.T. está financiado por subvenciones del Consejo Europeo de Investigación (ERC – GA695190 – MANNA), los Programas Marco de la Comisión Europea y el Ministerio de Educación de Grecia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
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