Summary
여기에서, 우리는 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환의 세포 및 분자 기초를 모니터링하고 해부하기 위해 과활성화 이온 채널 유도 괴사 및 단백질 골재 유도 신경 독성을 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 널리 접근 할 수있는 방법론을 소개하고 설명합니다.
Abstract
인간의 신경 퇴행성 병리학과 싸우고 그들의 만연한 사회 경제적 영향을 관리하는 것은 글로벌 우선 순위가되고있다. 인간의 삶의 질과 의료 시스템에 대한 해로운 영향에도 불구하고, 인간의 신경 퇴행성 질환의 대부분은 여전히 불치의 예방 할 수없는 남아있다. 따라서 이러한 질병에 대한 새로운 치료 개입의 개발은 시급한 시급성이되고 있습니다. 뉴런 회로와 기능의 노화와 관련된 악화는 낮은 벌레 Caenorhabditis elegans 및 인간과 같은 다양한 유기체에서 진화적으로 보존되어 기본 세포 및 분자 메커니즘의 유사성을 나타냅니다. C. elegans는 노화 중 신경 활동과 품질 관리를 평가하기 위해 잘 특징인 신경계, 신체 투명성 및 유전 및 이미징 기술의 다양한 레퍼토리를 제공하는 고가성 유전 모델입니다. 여기서, 우리는 과활성화 이온 채널 유도 괴사(예를 들어, deg-3(d) 및 mec-4(d)및 단백질 집계(예를 들어, α-syunclein 및 poly-글루타메이트)를 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 세포 및 세포 노화의 세포 분석과 세포 의 세포 적고를 모니터링 및 절제하는 방법을 소개하고 설명합니다. 이러한 동물 신경 변성 모델의 조합, 세포 죽음 변조기에 대 한 유전 및 약리학적 화면과 함께 신경 기능의 나이 관련 고장의 전례 없는 이해로 이어질 것입니다 및 인간의 건강 및 삶의 질에 광범위 한 관련성에 중요 한 통찰력을 제공할 것입니다.
Introduction
지난 2 년 동안, C. elegans 널리 괴사 세포 죽음의 분자 메커니즘을 조사 하는 모델 유기체로 사용 되었습니다. C. elegans는 매우 잘 특성화되고 매핑된 신경계, 투명한 신체 구조 및 노화 전반에 걸쳐 생체 외세포 기능 및 생존을 모니터링하는 유전 및 이미징 방법의 다양한 레퍼토리를 제공합니다. 따라서, 신경 변성의 몇몇 C. elegans 유전 모형은 이미 신경 생존성을 평가하기 위하여 개발되었습니다. 특히, 잘 설명되고 사용되는 선충 모델은 단백질,집계4, 5, 6, 7, 8, 9,10 및 열사병 11, 12, 그 외 에서 단백질,집계1,,4,5,,6,7,78,9,10 및 열사병11, 12,그 외에서 증가된 단백질 집계에 의해 유발되는 활동적인 이온 채널 유도 괴사1,2,3 및세포 사멸을 포함한다.2
사외 치명적인 온도에 단기 노출은 선충과 포유류 뉴런11모두에서 후속 열 스트레스에 의해 트리거 괴사 세포 죽음에 대한 저항을 부여했다. 흥미롭게도, 온화한 고온에서 선충의 매일 전제 조건은 이온 불균형 (예를 들어, mec-4 (u231) 및 /또는 deg-3 (u662)및 단백질 집계 (예를 들어, α-synuclein 및 polyQ41) 및 폴리11Q41등 다양한 자극에 의해 가해지는 신경 변성으로부터보호합니다.13
여기서는 C. elegans를 사용하여 발췌 독성 유발 세포 사망, 파킨슨병 및 헌팅턴 병과 같은 잘 확립 된 인간 질환 모델에서 연령 의존적 신경 변성을 모니터링하고 평가합니다. 또한, 우리는 신경 변성의 여러 모델에서 열 전조의 신경 보호 역할을 강조. 유전 및/또는 약리학적 스크린과 함께 이러한 기술의 조합은 잠재적인 치료 적 관심과 함께 새로운 세포 죽음 변조기의 식별 및 특성화를 초래할 것입니다.
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Protocol
1. 음과 이온 채널에 의해 유도 된 괴사 세포 죽음
참고: 메크-4 및 deg-3을 포함한 degenerins유전자 패밀리의 기능성 돌연변이는 웜3에서메카노센션에 필요한 6개의 터치 수용체 뉴런의 괴사 세포 사멸을 유발하는 활동적인 이온 채널의 생성을 초래한다. 괴사는 degenerins의 비정상적인 자극에 의해 유도된 포유류에 있는 흥분 독성에 몇몇 기계론및 형태학적 유사성을 표시합니다. 에너지 대사와 칼슘 항상성의 유지는 괴사11동안 신경 생존에 중요한 역할을한다. 다음 균주는 활동적인 이온 채널, mec-4 (u231)X 및 deg-3 (u662)V에의해 유발되는 괴사 세포 죽음을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
- 괴사 세포 죽음의 검사를 위한 돌연변이 벌레의 유지, 동기화 및 준비
- 1일차: 메크-4(u231) 또는 deg-3(u662) 돌연변이 선충을 선충선에 선택(NGM; 표 1) 해부 스테레오현미경을 사용하여 에체리치아 대장균(OP50)으로 시드된 플레이트.
- 시드 NGM 플레이트 당 10 L4 선충을 놓고 20 °C의 표준 온도에서 성장하십시오.
- 5일차: M9 완충(표1)의1mL로 판을 씻고 1.5mL 튜브로 동물을 채운다.
- 30s용 10,000 x g의 원심분리기와 상부체제거.
- 표백 용액 0.5mL(H2O7mL, 5N NaOH 1mL, 표백제 2mL)를 추가합니다.
참고: 표백 용액은 점차 효율성을 잃게 됩니다. 따라서 매일 준비해야합니다. - 소용돌이와 벌레가 용해 될 때까지 주기적으로 모니터링합니다.
참고: 배아의 생존능력이 영향을 받을 수 있기 때문에 5분 이상 표백을 피하십시오. - 30s용 10,000 x g의 원심분리기와 상부체제거.
- M9 버퍼 1mL로 펠릿(계란)을 두 번 씻으십시오.
- 세척 후, M9 버퍼의 200 μL에서 계란을 다시 중단하고 수조에서 34 °C에서 25 분 동안 배양하십시오.
- 20°C에서 별도의 대조군 시료(eggs)를 유지한다.
- 파이펫 100 μL의 제어 또는 열 충격 처리 계란을 시드 NGM 플레이트에 놓습니다. 각 접시에는 적어도 100-200 개의 계란이 포함되어 있습니다.
- 부화 때까지 20°C에서 계란을 배양했습니다.
- 차동 간섭 대비를 이용한 검사를 위한 L1 애벌레 장착(DIC; 노마르스키) 현미경 검사법
- 아가로즈 패드 2%를 준비합니다.
- M9 버퍼 1mL을 사용하여 판을 세척하고 1.5mL 튜브에서 L1 유충 선충을 수집합니다.
- 30 s용 10,000 x g의 원심분리기.
- 상체를 제거하고 펠릿 (선충)을 유지합니다.
- 선충을 마취하기 위해 20mM M9/레바미솔 버퍼의 100 μL을 추가합니다.
참고: 마취제로서 아지드 나트륨을 피하십시오. 나트륨 아지드는 미토콘드리아 손상과 산화 스트레스를 유발하여 결국 세포 사망 유도로 이어진다. - 파이펫 10 μL M9/레바미솔 버퍼는 L1 웜을 함유하고 2% 아가로즈패드(표 1)에장착한다.
- 샘플 상단에 커버슬립을 부드럽게 놓습니다.
참고: 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 습도를 유지하기 위해 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다. - 차동 간섭 대비(DIC; 노마르스키) 현미경 검사.
- 선충당 특유의 진공 처리된 외관을 가진 세포를 계산하여 6개의 터치 수용체 뉴런의 신경변성을 채점한다.
2. 단백질 골재 유도 신경 변성
참고: 다음 균주는 단백질 골재 유도 신경 독성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다:(A)도파민성 뉴런에서 인간의 α-synuclein의 과발현, UA44: [baIn1; p Isdat-1α-syn, pdat-1GFP] 및(B)인간 폴리글루타민 단백질(PolyQ) 범뉴알, AM101: rmsIs10[prgef-1Q40:YFP]6,,10.
- 신경 변성 분석기의 유지 보수, 동기화 및 형질 전환 선충제의 준비
- 해부 스테레오현미경을 사용하여 C. elegans 개발 및 성장을 모니터링합니다.
- 1일차: 새로 OP50 시드 NGM 플레이트에 각 변형의 15-20 L4 애벌레를 선택하고 이송하여 형질 전환선충의 인구를 동기화합니다.
참고: 조건당 각 변형의 플레이트를 3플레이트 이상 사용하십시오. - 선충이 20°C의 표준 온도에서 자라도록 한다.
- 2일차: 34°C로 설정된 인큐베이터에서 플레이트를 전송하여 30분 동안 매일 사전 컨디셔닝을 수행합니다. 그런 다음, 20°C의 표준 온도에서 미리 조건된 선충을 되돌려 보라고 한다.
참고: 다른 유전 적 배경은 장시간 노출을 위해 고온에 민감할 수 있습니다. - (A)도파민성 뉴런에서 인간의 α-synuclein의 과발현을 조사하는 경우, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: 9일째에 도파민세포 세포 사멸을 위한 7일 된 형질성 선충을 모니터링한다.
- (B)인간 폴리글루타민 단백질(PolyQ) 팬뉴런, AM101: rmsIs10[prgef-1Q40:YFP]: 5일째에 Q40:YFP를 표현하는 4일간의 형질전환 동물의 머리 부위에 있는 뉴런 폴리Q 골재를 측정한다.
- 현미경 검사를 위한 견본 설치
- 2% 아가로즈패드(표 1)를준비합니다.
- 아가로즈 패드의 중앙에 20mM M9/레바미솔 버퍼 드롭의 10 μL을 추가합니다.
- 각각의 형질 전환선충을 선택하고 M9/레바미솔 드롭으로 옮기.
참고: 드롭당 20-30선충을 놓습니다. - 샘플 상단에 커버슬립을 부드럽게 놓습니다.
참고: 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 습도를 유지하기 위해 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다. - 각각의 샘플의 현미경 검사를 진행합니다.
- 도파민성 뉴런에서 α-synuclein 및 세포경 GFP를 공동 발현하는 트랜스제닉 선충제의 획득 과정 및 데이터 분석
- 카메라와 결합된 피형성 현미경을 사용하십시오(예: EVOS FL 자동 2).
- 20배 배율로 헤드 영역의 z 스택 이미지를 감지하고 캡처합니다.
- 최대 강도 투영 이미지를 저장하고 수집합니다.
- 획득한 이미지의 분석을 진행합니다.
- 다음과 같은 세포 특성을 득점하여 신경 변성에 대한 형질 전환 웜을 검사, (i) dat-1의발기인하에서 GFP를 표현하는 뉴런에서 형광의 손실, (ii) 소마 및 /또는 축축출혈, 아웃스승 또는 수지상 손실을 보여주는 뉴런.
- 소프트웨어 패키지(예: Excel)를 사용하여 데이터를 가져오고 분석합니다.
3. YFP와 융합된 팬뉴런 폴리Q40을 발현하는 형질전환 선충의 수집 과정 및 데이터 분석
- 카메라와 결합된 피형성 현미경을 사용하십시오(예: EVOS FL 자동 2).
- 20배 배율로 헤드 영역의 z 스택 이미지를 감지하고 캡처합니다.
- 최대 강도 투영 이미지를 저장하고 수집합니다.
- 피지 소프트웨어를 사용하여 획득 된 이미지의 분석을 진행합니다.
- 피지 프로그램14와이미지를 엽니 다.
- 이미지 및 색상 드롭다운 메뉴를 통해 분할 채널 명령을 선택합니다.
참고: 녹색 채널 이미지를 유지합니다. - 프리핸드 선택 도구를 사용하여 형광 영역(ROI; 예: 헤드)을 수동으로 설정합니다.
- 분석 및 도구 드롭다운 메뉴를 통해 ROI 관리자에 각각의 ROI를 추가합니다.
- 프로세스를 선택하고 배경을 빼서 배경을 50%로 뺍니다.
- 메뉴 명령 이미지를 통해 임계값 을 설정하고 적용 | 조정 | 임계값. 전체 실험의 이미지 분석을 통해 동일한 임계값을 유지하고 설정합니다.
- ROI 관리자에서 각 ROI를선택합니다.
- 메뉴 명령을 사용하여 입자를 분석하고 분석하여단백질 골재 수를 분석합니다.
- 획득한 각 이미지에 대해 3.5-3.12단계를 반복합니다.
- 별도의 결과 창에서 표시 값을 복사합니다.
- 소프트웨어 패키지를 사용하여 결과를 붙여넣기/가져오기/가져오기합니다.
4. 통계 분석 보고서
- 각 실험 조건에 대해 적어도 30개의 선충을 사용하십시오. 세 가지 생물학적 복제를 수행합니다.
- 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 학생 t-test(두그룹 간의 비교) 또는 ANOVA(여러 그룹 간의 비교)를 수행하여 p< 0.05를 가진 통계 분석을 유의하게 수행합니다.
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Representative Results
음과 이온 채널에 의해 유도 된 괴사 세포 죽음
여기에 제시된 절차를 이용하여, mec-4(u231) 및 deg-3u662) 돌연변이 배아는 34°C에서 25분 동안 배양되거나 20°C의 표준 온도에서 보관하였다. 부화 시, 신경 세포 시체의 수는 두 그룹의 L1 애벌레 단계에서 결정되었다. 괴사 세포 죽음은 열 충격 전제 조건 계란(그림 1A-1B)에서부화 선충에서 감소된다.
단백질 골재 유도 신경 변성
트랜스제닉 선충과 발현(A) 인간 α-시뉴클레인 및 세포질 GFP는 도파민성 뉴런과 (B) 인간 폴리글루타민 단백질(PolyQ)이 YFP 팬뉴런과 융합되어, 34°C에서 30분 동안 매일 노출되었다. 열충격 전재는 7일 성인 헤르마프로디테(그림2A)에서α-synuclein 유도 세포 사멸에 대한 신경보호를 촉진하고 4일 성인의 머리 부위에서 Q40:YFP 단백질 골재를 감소시다(도2B 및 도 3).
그림 1: 활동적인 이온 채널 유도 괴사. (A) 메크-4(u231) L1 애벌레의 대표적인 DIC 현미경 이미지, 화살촉이 특징적인 괴사 비쿨올을 나타낸다. 신경 변성 부은 핵의 초기 단계에서 세포 내에서 표시됩니다. 이미지는 40배 이의 렌즈를 사용하여 획득했습니다. 스케일 바, 20 μm. (b)L1 애벌레 단계에서 신경 세포 시체의 수, 신경 독성 mec-4 (u231) 또는 deg-3 (u662) 대립을 운반하는 100 마리의 동물 당. 괴사 세포 죽음은 치료되지 않은 대조물 (n = 100 동물 제형 및 분석당 동물)에 비해 사전 조건화 된 계란에서 부화 된 L1 애벌레에서 억제됩니다. 데이터는 ±S.E.M., ***PP&Lt, 0.001을 나타내며, 처리되지 않은 대 조건; t-test) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 34°C에서 매일 사전 조절은 α-synuclein에 대하여 신경 보호를 부여하고 C. elegans에있는 polyQ 골재를 감소시. (Α)전방 도파민성 뉴런(CEP 및 ADEs)의 생존은 인간 α-synuclein과 함께 세포질 GFP를 공동 발현하는 처리되지 않고 조건이 있는 선충제에서 의생존한다. 사전 조절된 선충은 치료되지 않은 것과 비교하여 향상된 신경 보호를 표시합니다. 신경 세포 체의 잔재 (별표) 및 축 하 구슬 (화살표 머리) 치료 되지 않는 선충에서 볼 수 있습니다 (상단 패널). 소마 (별표) 및 신경 과정 (화살촉) 모두 사전 컨디셔닝시 보존됩니다. 20배 이의 렌즈를 사용하여 획득한 이미지는 최대 강도 z 프로젝션을 묘사합니다. 취득 세부 정보: 밝은, 0.15. 스케일 바, 20 μm. 벌레는 성인의 일곱 번째 날에 전방 도파민 성 뉴런의 신경 생존을 위해 득점되었다. (B)치료되지 않고 조건전형 선충의 머리 부위에서 성인기의 4일째에 검출된 뉴런 폴리Q 골재. 조건전 형질 전환 벌레는 치료되지 않은 에 비해 덜 신경 Q40 : : YFP 집계를 제시한다. 헤드 영역의 대표적인 이미지는 신경 세포에서 폴리Q 단백질 응집체를 나타내는 화살촉으로 표시됩니다. 20배 이의 렌즈를 사용하여 획득한 이미지는 최대 강도 z 프로젝션을 묘사합니다. 취득 세부 정보: 밝은, 0.0175. 스케일 바, 20 μm. 30-35마리의 동물은 각각 3개의 독립적인 실험에서 조건당 정량화되었다. 데이터는 ±S.E.M., ***P&05, 페어링되지 t않은 t-test를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 피지 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석. 1. 피지 소프트웨어로 획득 된 이미지를 엽니 다; 2. 이미지를 변환하는 "이미지"와 "색상"드롭 다운 메뉴를 통해 "분할 채널"명령을 선택합니다. 3, 4. "녹색 채널" 이미지를 유지하고 "프리핸드 선택" 도구를 사용하여 형광 영역(ROI; 예: 헤드)을 둘러싸십시오. "분석" 및 "도구" 드롭다운 메뉴를 통해 "ROI 관리자"에 각 ROI를 추가합니다. 5, 6. "프로세스"와 "배경 빼기"를 선택하여 배경을 50%로 뺍니다. 7, 8. 메뉴 명령 "이미지", "조정" 및 "임계값"을 통해 임계값값을 설정하고 적용합니다. 9. "ROI 관리자"에서 각 ROI를 선택합니다. 10-12. 메뉴 명령 "분석" 및 "입자 분석"을 사용하여 단백질 골재 수를 분석합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 제조 법 | |
| 아가로즈 패드 2% | 1. 원통형 유리 비커에 아가로즈 0.5 g의 무게. | |
| 2. M9 버퍼 25mL를 추가합니다. | ||
| 3. 끓는 때까지 전자 레인지에 가열합니다. 꺼내서 파이펫 끝으로 저어서 다시 끓입니다. 아가로즈가 용해될 때까지 반복합니다. | ||
| 4. 벤치에 빈 현미경 슬라이드를 놓습니다. | ||
| 5. 슬라이드 중간에 신선한 2 % 아가로즈 용액의 드롭 (~ 50 μL)을 넣습니다. | ||
| 6. 두 번째 현미경 슬라이드를 타고 아가로즈 드롭 위에 놓습니다. 부드럽게 아래로 눌러 방울을 평평하게합니다. | ||
| 7. 아가로즈가 30초 동안 굳어지고 상단 현미경 슬라이드를 부드럽게 제거하십시오. | ||
| 8. 아가로즈 패드가 약 5 분 이내에 건조하기 시작하기 때문에 즉시 샘플 준비를 진행합니다. | ||
| 팁: 습도를 더 오래 보존하기 위해 상단 현미경 슬라이드를 덮개로 둡니다(~ 1시간). 따라서, 몇몇 아가로즈 패드는 실험 중에 신속하게 제조및 사용될 수 있다. | ||
| M9 버퍼 | 1. KH2PO4의3 g, Na2HPO46 g, 증류수 및 오토 클레이브 1 L에 NaCl 5 g을 녹입니다. | |
| 2. 식히고 1 M MgSO4 (멸균)의 1 mL을 추가하십시오. | ||
| 3. 4 °C에서 M9 버퍼를 저장합니다. | ||
| 선충 성장 매체(NGM) 천판 | 1. NaCl 3 g, bactopeptone 2.5 g, 연쇄상 구균 0.2 g, 17 g의 천을 넣고 증류수 900mL를 추가합니다. 오토 클레이 브. | |
| 2. 55-60 °C로 식히십시오. | ||
| 3. 콜레스테롤 스톡 용액 1mL, M CaCl2mL1mL, 1m MgSO4,니스타틴 재고 용액 1mL, 멸균 1M 인산염 완충제, pH 6.0 및 증류멸수 최대 1L을 추가합니다. | ||
| 4. 페트리 접시 당 중간 크기의 파이펫 10 mL을 고화로 둡니다. | ||
| 5. 사용 될 때까지 4 °C에서 접시를 저장합니다. | ||
표 1: 사용 시약에 권장하는 레시피입니다. 제시된 프로토콜에 사용되는 모든 시약 레시피는 여기에 설명되어 있습니다.
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Discussion
여기에서, 우리는 노화에 의존하는 신경 변성을 조사하는 몇몇 다재다능한 C. elegans 모형의 성장, 동기화 및 현미경 검사를 위한 넓게 접근하는 방법론을 소개하고 기술합니다. 특히, 하이퍼활성화이온 채널 유도 괴사,및 단백질 골재 유발 신경독성1,2,23,3,4,,5,,7,9,,10,11을이용하여 연령관련 뉴런 고장의 세포 및 분자 기초를 평가하고 해부한다.,
생체 내 세포 사멸 평가를 위한 기술된 절차가 간단하고 어떤 실험실든지에서 쉽게 수행될 수 있더라도, 고려해야 할 몇몇 중요한 단계가 있습니다. 칼로리 제한 및 기아는 신경 변성 또는 단백질 골재 축적을 방해할 수 있는 자가식과 같은 다중 스트레스 경로를 유도하는 것으로 알려져 있다13,,15,,16. 따라서, 잘 먹이고 굶주린 선충을 사용해야합니다. 열 충격 사전 컨디셔닝은 여러 신경 퇴행성 자극에 대한 신경 보호를 부여하고 확립 된 세포 죽음 변조기(11,,13)로사용된다. 그러나, 몇몇 돌연변이는 장시간 고온 노출에 영향을 받기 쉽습니다. 따라서, 적절한 발달 단계, 나이 및 열 충격 전전 조절의 기간은 고온에 민감할 수 있는 다른 유전 적 배경의 동물이 사용될 때마다 실험적으로 결정되어야 한다. 노화 중에 선충장 발광의 점진적인 증가가 관찰됩니다. 따라서, 장 부위에 가까운 신경 세포 체 및 과정은 AM101 균주의 이미징 과정에서 피해야 한다. 머리 및/또는 꼬리 부위에 위치한 신경 세포에 초점을 맞추어 장 유래 자가 형광을 우회하십시오. 물 대신 M9 버퍼를 사용하여 M9/레파솜 버퍼와 2% 아가로즈 패드를 생성합니다. M9 버퍼는 미세한 시각화 및 분석 전반에 걸쳐 선충이 건조되지 않도록 하는 유리한 삼투질 환경을 보장합니다.
설명된 방법론은 신경 퇴행성 선충제 모형의 조합이 세포 죽음 변조기를 위한 유전 및 약리학적 스크린과 더불어 신경 회로의 나이 관련한 손상의 전례없는 이해로 이끌어 내고 인간의 건강과 삶의 질을 승진시키는 신경 퇴행성 무질서에 대하여 새로운 치료 내정간섭의 발달을 강화할 수 있었다는 것을 강조합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
비디오 녹화 및 편집에 대한 차니오타키스 M. 및 쿠나키스 K. 감사드립니다. K.P.는 그리스 연구 혁신 재단(HFRI)과 연구 기술 총무사(GSRT)의 보조금으로 지원받고 있습니다. N.T.는 유럽 연구 위원회 (ERC – GA695190 – MANNA), 유럽 위원회 프레임 워크 프로그램 및 그리스 교육부의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
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