Summary
Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias amplamente acessíveis utilizando alguns modelos versáteis de nematoides, incluindo necrose induzida por canal de íon hiperativado e neurotoxicidade induzida por proteínas, para monitorar e dissecar os fundamentos celulares e moleculares de doenças neurodegenerativas associadas à idade.
Abstract
Combater patologias neurodegenerativas humanas e gerenciar seu impacto socioeconômico generalizado está se tornando uma prioridade global. Apesar de seus efeitos prejudiciais sobre a qualidade de vida humana e o sistema de saúde, a maioria dos distúrbios neurodegenerativos humanos ainda permanece incurável e inde prevenivel. Portanto, o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas contra tais males está se tornando uma urgência premente. A deterioração dos circuitos e funções neuronais associadas à idade é evolutivamente conservada em organismos tão diversos quanto o humilde verme Caenorhabditis elegans e humanos, significando semelhanças nos mecanismos celulares e moleculares subjacentes. C. elegans é um modelo genético altamente maleável, que oferece um sistema nervoso bem caracterizado, transparência corporal e um repertório diversificado de técnicas genéticas e de imagem para avaliar a atividade neuronal e o controle de qualidade durante o envelhecimento. Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias utilizando alguns modelos versáteis de nematoides, incluindo necrose induzida por canal de íons hiperativado (por exemplo, deg-3(d) e mec-4(d)) e agregado de proteínas (por exemplo, neurotoxina α-syuncleina e poli-glutamato)-induzidas por neurotoxicidade, para monitorar e dissecar os fundamentos celulares e moleculares de quebra neuronal relacionada à idade. Uma combinação desses modelos de neurodegeneração animal, juntamente com telas genéticas e farmacológicas para moduladores de morte celular, levará a uma compreensão sem precedentes da discriminação relacionada à idade da função neuronal e fornecerá insights críticos com ampla relevância para a saúde humana e qualidade de vida.
Introduction
Nas últimas duas décadas, C. elegans tem sido amplamente utilizado como um organismo modelo para investigar os mecanismos moleculares da morte celular necrótica. C. elegans oferece um sistema nervoso excepcionalmente bem caracterizado e mapeado, estrutura corporal transparente e um repertório diversificado de métodos genéticos e de imagem para monitorar a função celular in vivo e a sobrevivência ao longo do envelhecimento. Assim, vários modelos genéticos C. elegans de neurodegeneração já foram desenvolvidos para avaliar a viabilidade neuronal. Em particular, os modelos de nematoides bem descritos e utilizados incluem a necrose hiperativa induzida pelo canalde íons 1,,2,3 e morte celular desencadeada pelo aumento da agregação proteica4,,5,,6,,7,,8,,9,,10 e insolação11,,12,entre outros.
A exposição a curto prazo a temperaturas sub-letais conferiu resistência à morte celular necrosada, desencadeada por um estresse térmico subsequente tanto em nematoides quanto em neurônios mamíferos11. Curiosamente, o pré-condicionamento diário de nematoides a uma temperatura elevada leve protege contra a neurodegeneração, que é infligida por diversos estímulos, como desequilíbrio iônico (por exemplo, mec-4(u231) e/ou deg-3(u662)) e agregação de proteínas (por exemplo, α-sinucleína e polyQ40)11,13.
Aqui, descrevemos metodologias versáteis usando C. elegans para monitorar e avaliar a neurodegeneração dependente da idade em modelos bem estabelecidos de doenças humanas, como morte celular desencadeada por excitotoxicidade, Parkinson e doença de Huntington. Além disso, sublinhamos o papel neuroprotetor do pré-condicionamento térmico em vários modelos de neurodegeneração. Uma combinação dessas técnicas em conjunto com telas genéticas e/ou farmacológicas resultará na identificação e caracterização de novos moduladores de morte celular, com potencial interesse terapêutico.
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Protocol
1. Célula necrosada induzida por canais de íons hiperativos
NOTA: Mutações de ganho de função na família genética de degenerinas, incluindo mec-4 e deg-3, entre outras, resultam na geração de canais de íons hiperativos desencadeando a morte celular necrosada de seis neurônios receptores de toque necessários para mecanosensação em vermes3. A necrose induzida pela estimulação aberrante das degenerinas apresenta várias semelhanças mecanicistas e morfológicas à excitotoxicidade em mamíferos. A manutenção do metabolismo energético e da homeostase de cálcio tem um papel crucial na sobrevivência neuronal durante a necrose11. As seguintes cepas podem ser usadas para monitorar a morte celular necrótica desencadeada por canais de íons hiperativos, mec-4(u231)X e deg-3(u662)V.
- Manutenção, sincronização e preparação de vermes mutantes para exame da morte celular necrosada
- Dia 1: Escolha larvas L4 de nematoides mutantes do MEC-4(u231) ou deg-3(u662) em Nematode Growth Media (NGM; Tabela 1) placas semeadas com Escherichia coli (OP50) usando um estereótipo dissecando.
- Coloque 10 nematoides L4 por placa NGM semeada e cresça-os na temperatura padrão de 20 °C.
- Dia 5: Lave as placas com 1 mL de tampão M9(Tabela 1) e colete os animais em um tubo de 1,5 mL.
- Centrifugar a 10.000 x g por 30 s e remover o supernaspeso.
- Adicione 0,5 mL de solução de branqueamento (7 mL de H2O, 1 mL de 5 N NaOH e 2 mL de alvejante).
NOTA: A solução de branqueamento gradualmente perde sua eficiência; portanto, deve ser preparado diariamente. - Vórtice e monitore periodicamente até que os vermes se dissolvam.
NOTA: Evite branqueamento por períodos superiores a 5 minutos porque a viabilidade dos embriões será afetada. - Centrifugar a 10.000 x g por 30 s e remover o supernaspeso.
- Lave duas vezes a pelota (ovos) com 1 mL de tampão M9.
- Após a lavagem, resuspenha os ovos em 200 μL de tampão M9 e incuba-os por 25 min a 34 °C em um banho de água.
- Mantenha um grupo separado de amostra de controle (ovos) a 20 °C.
- Pipeta 100 μL de controle ou calor de ovos tratados com choque e colocá-los em placas de NGM não semeadas. Cada prato contém pelo menos 100-200 ovos.
- Incubado os ovos a 20 °C até chocar.
- Montagem de larvas L1 para exame utilizando contraste de interferência diferencial (DIC; Microscopia nomarsky
- Prepare 2% de almofadas de agarose.
- Use 1 mL de tampão M9 para lavar as placas e coletar nematoides de larvas L1 em tubos de 1,5 mL.
- Centrifugar a 10.000 x g por 30 s.
- Remova o supernatante e mantenha a pelota (nematoides).
- Adicione 100 μL de 20 mM M9/tampão de levamisole para anestesiar os nematoides.
NOTA: Evite o azida de sódio como anestésico. Azida de sódio desencadeia danos mitocondriais e estresse oxidativo levando eventualmente à indução de morte celular - Pipeta 10 μL de tampão M9/levamisole contendo vermes L1 e montá-los em almofadas de 2% de agarose(Tabela 1).
- Coloque suavemente uma mancha de cobertura na parte superior da amostra.
NOTA: Sele a mancha com esmalte para preservar a umidade durante todo o processo de imagem. - Observe worms usando contraste de interferência diferencial (DIC; Microscopia nomarsky.
- Escore a neurodegeneração dos seis neurônios receptores de toque contando células com a aparência vacuolada característica por nematoide.
2. Neurodegeneração induzida por proteínas
NOTA: As seguintes cepas podem ser usadas para investigar neurotoxicidade induzida por agregados proteicos: (A) superexpressão da α-sinucleína humana em neurônios dopaminérgicos, UA44: É[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] e (B) superexpressão da proteína de poliglutamina humana (PolyQ) pan-neuronalmente, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40:::YFP]6,10.
- Manutenção, sincronização e preparação de nematoides transgênicos para ensaio de neurodegeneração
- Use um estereómico dissecando para monitorar o desenvolvimento e o crescimento de C. elegans.
- Dia 1: Sincronizar a população de nematoides transgênicos colhendo e transferindo 15-20 larvas L4 de cada cepa em placas de GNM recém-criadas OP50.
NOTA: Utilize pelo menos três placas de cada cepa por condição. - Incubar e deixar os nematoides crescerem à temperatura padrão de 20 °C.
- Dia 2: Realize o pré-condicionamento diário por 30 minutos transferindo as placas em uma incubadora fixada a 34 °C. Em seguida, retorne os nematoides pré-condicionados de volta à temperatura padrão de 20 °C.
NOTA: Diferentes origens genéticas podem ser sensíveis à alta temperatura por longos períodos de exposição. - (A) Se investigar a superexpressão da α-sinucleína humana em neurônios dopaminérgicos, UA44: É[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: no dia 9, monitore nematoides transgênicos de 7 dias de idade para morte celular neuronal dopaminérgica.
- (B) Se investigar a superexpressão da proteína de poliglutamina humana (PolyQ) pan-neuronalmente, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: no dia 5, meça agregados neuronais de PolyQ na região da cabeça de animais transgênicos de 4 dias de idade expressando Q40::YFP.
- Montagem das amostras para exame microscópico
- Prepare 2% de almofadas de agarose(Tabela 1).
- Adicione 10 μL de 20 mM M9/leveisole buffer drop no centro da almofada agarose.
- Escolha os respectivos nematoides transgênicos e transfira-os em uma gota M9/levamisole.
NOTA: Coloque 20-30 nematoides por gota. - Coloque suavemente uma mancha de cobertura na parte superior da amostra.
NOTA: Sele a mancha com esmalte para preservar a umidade durante todo o processo de imagem. - Proceder ao exame microscópico das respectivas amostras.
- Processo de aquisição e análise de dados de nematoides transgênicos co-expressando α-sinucleína e GFP citosósica em neurônios dopaminérgicos
- Use um microscópio de epifluorescência combinado com uma câmera (por exemplo, EVOS FL Auto 2).
- Detecte e capture imagens de pilha de z da região da cabeça a 20x de ampliação.
- Salve e colete as imagens de projeção de intensidade máxima.
- Prossiga para a análise das imagens adquiridas.
- Examine os vermes transgênicos para neurodegeneração, pontuando as seguintes características celulares, (i) perda de fluorescência de neurônios expressando GFP sob o promotor de dat-1, (ii) neurônios mostrando soma e/ou blebbing axonal, outgrowths ou perda dendrítica.
- Importe e analise os dados usando um pacote de software (por exemplo, Excel).
3. Processo de aquisição e análise de dados de nematoides transgênicos expressando politagem pan-neuronalmente 40 fundido com YFP
- Use um microscópio de epifluorescência combinado com uma câmera (por exemplo, EVOS FL Auto 2).
- Detecte e capture imagens de pilha de z da região da cabeça a 20x de ampliação.
- Salve e colete as imagens de projeção de intensidade máxima.
- Prossiga para a análise das imagens adquiridas usando o software Fiji.
- Abra imagens com o programa Fiji14.
- Selecione o comando Canais divididos através do menu suspenso imagem e cor.
NOTA: Mantenha a imagem do canal verde. - Use a ferramenta de seleção à mão livre para definir manualmente a região fluorescente de interesse (ROI; por exemplo, cabeça).
- Adicione o respectivo ROI no ROI Manager via Menu suspenso Analyze and Tools.
- Subtraia o plano de fundo para 50% selecionando o plano de fundo do processo e subtraído.
- Configurar e aplicar valores de limiar através do comando do menu Imagem | Ajuste | Limiar. Mantenha e defina os mesmos valores de limiar durante toda a análise de imagem de todo o experimento.
- Selecione o respectivo ROI do ROI Manager.
- Analise o número de agregados proteicos usando o comando do menu Analisar e Analisar partículas.
- Repita as etapas 3.5-3.12 para cada imagem adquirida.
- Copie os valores do display da janela Resultados separados.
- Cole/Importe e analise os resultados usando um pacote de software.
4. Relatório de análise estatística
- Use pelo menos 30 nematoides para cada condição experimental. Realize três réplicas biológicas.
- Utilize software de análise estatística para realizar teste t-estudante(comparação entre dois grupos) ou ANOVA (comparação entre vários grupos) para análise estatística com p < 0,05 como significativo.
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Representative Results
Célula necrosada induzida por canais de íons hiperativos
Utilizando os procedimentos aqui apresentados, os embriões mutantes mec-4(u231) e deg-3u662 foram incubados por 25 min a 34 °C ou mantidos na temperatura padrão de 20 °C. Ao eclodir, o número de corpos de células neuronais foi determinado no estágio larval L1 de ambos os grupos. A morte celular necrótica é diminuída em nematoides que eclodiram de ovos pré-condicionados de choque térmico(Figura 1A-1B).
Neurodegeneração induzida por proteínas
Nematoides transgênicos superexpressando (A) α-sinucleína humana e GFP citoplasmica em neurônios dopaminérgicos e (B) proteína de poliglutamina humana (PolyQ) fundida com YFP pan-neuronalmente, foram expostos diariamente por 30 min a 34 °C. O pré-condicionamento do choque térmico promove a neuroproteção contra a morte celular induzida pela α-sinucleína em hermafroditas adultas de 7 dias de idade(Figura 2A) e diminui os agregados de proteína q40::YFP na região da cabeça de adultos de 4 dias de idade(Figura 2B e Figura 3).
Figura 1: Necrose induzida pelo canal de íon hiperativo. (A) Imagem representativa da microscopia DIC representativa da larva L1 mec-4(u231), com pontas de flecha indicando vacuoles necroses característicos. No estágio inicial da neurodegeneração núcleos inchados são exibidos dentro das células. A imagem foi adquirida usando uma lente de objeção de 40x. Barra de escala, 20 μm. (B) Número de cadáveres de células neuronais no estágio larval L1 de desenvolvimento, por 100 animais portadores de alelos neurotóxicos mec-4(u231) ou deg-3(u662). A morte celular necrótica é suprimida em larvas L1 eclodidas de ovos pré-condicionados em comparação com contrapartes não tratadas (n= 100 animais por genótipo e ensaio; Os dados representam médias ±S.E.M., ***P< 0,001 para não tratado versus pré-condicionado; t-teste) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O pré-condicionamento diário a 34 °C confere neuroproteção contra α-sinucleína e diminui os agregados de polq em C. elegans. (Α) Sobrevivência de neurônios dopaminérgicos anteriores (CEPs e ADEs) em nematoides não tratados e pré-condicionados co-expressando GFP citoplasmica juntamente com a α-sinucleína humana. Os nematoides pré-condicionados apresentam uma neuroproteção aprimorada em comparação com os não tratados. Remanescentes de corpos de células neuronais (asteriscos) e contas axonais (pontas de flecha) são vistos em nematoides não tratados (painel superior). Ambos os processos soma (asteriscos) e neuronais (pontas de flecha) são preservados após o pré-condicionamento. Imagens adquiridas usando uma lente de objeção de 20x e retratam a intensidade máxima z-projeção. Detalhes da aquisição: Bright, 0.15. Barra de escala, 20 μm. Os vermes foram pontuados para a sobrevivência neuronal dos neurônios dopaminérgicos anteriores no sétimo dia da vida adulta. (B) Agregados de polq neuronal detectados no quarto dia da idade adulta na região principal de nematoides transgênicos não tratados e pré-condicionados. Vermes transgênicos pré-condicionados apresentam agregados de Q40::YFP menos neuronais em comparação com os não tratados. Imagens representativas da região da cabeça são mostradas com pontas de flecha indicando agregados de proteínas de polq em células neuronais. Imagens adquiridas usando uma lente de objeção de 20x e retratam a intensidade máxima z-projeção. Detalhes da aquisição: Bright, 0.0175. Barra de escala, 20 μm. 30-35 animais foram quantificados por condição em cada um dos três experimentos independentes. Os dados representam médias ±S.E.M., ***P < 0,05, teste tnão pago. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de imagem usando o software Fiji. 1. Abra uma imagem adquirida com o software Fiji; 2. Selecione o comando "Canal dividido" através do menu "Imagem" e "Color" para converter a imagem; 3, 4. Mantenha a imagem de "canal verde" e usando a ferramenta "seleção à mão livre", enwrap a região fluorescente de interesse (ROI; por exemplo, cabeça). Adicione o respectivo ROI em "Gerenciador de ROI" via menu suspenso "Analisar" e "Ferramentas"; 5, 6. Subtrair o fundo para 50% selecionando "Processo" e "Subtrair fundo"; 7, 8. Configurar e aplicar valores de limiar através do comando do menu "Imagem", "Ajustar" e "Limiar"; 9. Selecione o respectivo ROI do "ROI Manager"; 10-12. Analise o número de agregados proteicos usando o comando do menu "Analisar" e "Analisar partículas". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Receita | |
| 2% das almofadas de agarose | 1. Pesar 0,5 g de agarose em um copo cilíndrico de vidro. | |
| 2. Adicione 25 mL de tampão M9. | ||
| 3. Aqueça em um micro-ondas até perto de ferver. Tire, mexa com uma ponta de pipeta e ferva novamente. Repita até que a ágarose seja dissolvida. | ||
| 4. Coloque um deslizamento de microscópio vazio no banco. | ||
| 5. Coloque uma gota (~ 50 μL) de solução fresca de 2% de agarose no meio do slide. | ||
| 6. Pegue um segundo slide de microscópio e coloque-o em cima da gota de agarose. Pressione suavemente para baixo para achatar a gota. | ||
| 7. Deixe a agarose endurecer por 30 segundos e remova suavemente o slide do microscópio superior. | ||
| 8. Proceda imediatamente com a preparação da amostra, uma vez que as almofadas de agarose começarão a secar em aproximadamente 5 minutos. | ||
| Dica: Deixe o slide do microscópio superior como uma tampa para preservar a umidade por mais tempo (~ 1 hora). Assim, várias almofadas de agarose podem ser preparadas e usadas rapidamente durante os experimentos. | ||
| Tampão M9 | 1. Dissolva 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl em 1 L de água destilada e autoclave. | |
| 2. Deixe esfriar e adicione 1 mL de 1 M MgSO4 (estéril). | ||
| 3. Armazene o buffer M9 a 4 °C. | ||
| Placas de ágar de médio crescimento de nematoides (GNM) | 1. Misture 3 g de NaCl, 2,5 g de bactopepton, 0,2 g de estreptomicina, 17 g de ágar e adicione 900 mL de água destilada. Autoclave. | |
| 2. Deixe esfriar a 55-60 °C. | ||
| 3. Adicione 1 mL de solução de estoque de colesterol, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de solução de estoque de ninstatina, 25 mL de tampão fosfato estéril de 1 M, pH 6.0, e água estéril destilada até 1 L. | ||
| 4. Pipeta 10 mL de média por placa de Petri e deixe solidificar. | ||
| 5. Armazene as placas a 4 °C até que usem. | ||
Tabela 1: Receitas recomendadas para reagentes utilizados. Todas as receitas de reagentes utilizadas no protocolo apresentado estão aqui descritas.
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Discussion
Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias amplamente acessíveis para crescimento, sincronização e exame microscópico de alguns modelos versáteis de C. elegans que investigam a neurodegeneração dependente da idade. Particularmente, avaliamos e dissecamos os fundamentos celulares e moleculares da quebra neuronal relacionada à idade, utilizando necrose hiperativada induzida pelo canal de íons e neurotoxicidade induzida porproteínas 1,,2,3,,4,,5,,7,,9,,10,,11.
Embora os procedimentos descritos para a avaliação da morte celular in vivo sejam simples e possam ser facilmente realizados em qualquer laboratório, existem algumas etapas críticas que devem ser levadas em consideração. A restrição calórica e a fome são conhecidas por induzir múltiplas vias de estresse, como a autofagia, que podem interferir no acúmulo de neurodegeneração ou agregados proteicos13,,15,16. Assim, nematoides bem alimentados e não famintos devem ser usados. O pré-condicionamento do choque térmico confere neuroproteção contra vários estímulos neurodegenerative e é usado como modulador de morte celular estabelecido11,13. No entanto, alguns mutantes são suscetíveis à exposição à alta temperatura por longos períodos. Assim, o estágio de desenvolvimento adequado, a idade e a duração do pré-condicionamento do choque térmico devem ser experimentalmente determinados cada vez, quando animais de diferentes origens genéticas, que podem ser sensíveis a altas temperaturas, são usados. Observa-se um aumento gradual da autofluorescência intestinal de nematoides durante o envelhecimento. Assim, corpos e processos de células neuronais próximos à área intestinal devem ser evitados durante o processo de imagem da cepa AM101. Concentre-se nas células neuronais, que estão localizadas na região da cabeça e/ou da cauda para contornar a autofluorescência derivada do intestino. Use tampão M9 em vez de água para gerar tampão M9/levamisome e 2% de almofadas agarose. O tampão M9 garante um ambiente osmótico favorável protegendo os nematoides de secar durante toda a visualização e análise microscópica.
As metodologias descritas ressaltam que a combinação de modelos de nematoides de neurodegeneração, juntamente com telas genéticas e farmacológicas para moduladores de morte celular poderia levar a uma compreensão sem precedentes do comprometimento associado à idade dos circuitos neuronais e impulsionar o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas contra distúrbios neurodegenerativos que promovem a saúde humana e a qualidade de vida.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Chaniotakis M. e Kounakis K. pela gravação e edição de vídeo. K.P. é financiado por uma bolsa da Fundação Helênica de Pesquisa e Inovação (HFRI) e da Secretaria Geral de Pesquisa e Tecnologia (GSRT). A N.T. é financiada por subvenções do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC – GA695190 – MANNA), dos Programas-Quadro da Comissão Europeia e do Ministério da Educação grego.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
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