Summary
यहां, हम उम्र से जुड़े न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के सेलुलर और आणविक आधार की निगरानी और विच्छेदन करने के लिए, अति सक्रिय आयन चैनल-प्रेरित नेक्रोसिस और प्रोटीन कुल प्रेरित न्यूरोटॉक्सिसिटी सहित कुछ बहुमुखी सूत्रकृमि मॉडलों का उपयोग करने के व्यापक रूप से सुलभ तरीकों का परिचय और वर्णन करते हैं।
Abstract
मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव विकृतियों से जूझ रहे हैं और उनके व्यापक सामाजिक आर्थिक प्रभाव का प्रबंधन एक वैश्विक प्राथमिकता बनता जा रहा है। मानव जीवन की गुणवत्ता और स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली पर उनके हानिकारक प्रभावों के बावजूद, अधिकांश मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार अभी भी लाइलाज और गैर-रोके रहते हैं। इसलिए, ऐसी विकृतियों के खिलाफ उपन्यास चिकित्सीय हस्तक्षेपों का विकास एक दबाव की तात्कालिकता बनता जा रहा है। न्यूरोनल सर्किट और कार्य की उम्र से जुड़ी गिरावट जीवों में जीवंत रूप से संरक्षित है, जो नीच कीड़ा कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस और मनुष्यों के रूप में विविध है, जो अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र में समानताओं को दर्शाता है। सी एलिगेंस एक अत्यधिक निंदनीय आनुवंशिक मॉडल है, जो बुढ़ापे के दौरान न्यूरोनल गतिविधि और गुणवत्ता नियंत्रण का आकलन करने के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता तंत्रिका तंत्र, शरीर की पारदर्शिता और आनुवंशिक और इमेजिंग तकनीकों की एक विविध प्रदर्शनों की सूची प्रदान करता है । यहां, हम कुछ बहुमुखी नेमाटोड मॉडल का उपयोग करने के तरीकों का परिचय और वर्णन करते हैं, जिनमें अतिसक्रिय आयन चैनल-प्रेरित नेक्रोसिस (उदाहरण के लिए, देंग-3 (डी) और एमईसी-4 (डी)और प्रोटीन एग्रीगेट (जैसे, α-syunclein और पॉली-ग्लूटामेट)-प्रेरित न्यूरोटॉक्सिटी, आयु से संबंधित न्यूरॉन के सेलुलर और आणविक अंडरिंग की निगरानी और विच्छेदन करना शामिल है। इन पशु न्यूरोडिजेनरेशन मॉडल का एक संयोजन, सेल डेथ मोडुलेटर्स के लिए आनुवंशिक और औषधीय स्क्रीन के साथ न्यूरोनल फ़ंक्शन के उम्र से संबंधित टूटने की अभूतपूर्व समझ पैदा करेगा और मानव स्वास्थ्य और जीवन की गुणवत्ता के लिए व्यापक प्रासंगिकता के साथ महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा।
Introduction
पिछले दो दशकों में, सी एलिगेंस को परिगलित कोशिका मृत्यु के आणविक तंत्र की जांच करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। सी एलिगेंस एक असाधारण रूप से अच्छी तरह से विशेषता और मैप किए गए तंत्रिका तंत्र, पारदर्शी शरीर संरचना और उम्र भर वीवो सेलुलर फ़ंक्शन और अस्तित्व में निगरानी करने के लिए आनुवंशिक और इमेजिंग विधियों की एक विविध प्रदर्शनों की सूची प्रदान करता है। इस प्रकार, न्यूरोडिजेनरेशन के कई सी एलिगेंस जेनेटिक मॉडल पहले से ही न्यूरोनल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए विकसित किए गए हैं। विशेष रूप से, अच्छी तरह से वर्णित और उपयोग किए गए सूत्रकृमि मॉडल में अतिसक्रिय आयन चैनल-प्रेरित नेक्रोसिस1,,2,,3 और सेल डेथ शामिल हैं जो प्रोटीन एकत्रीकरण,4,5,,6,7,,,8,9,10,और हीट स्ट्रोक11,,10 12,अन्य लोगों के बीच में वृद्धि हुई है।,
उप-घातक तापमान के अल्पकालिक जोखिम ने गल-नाड़क कोशिका मृत्यु के खिलाफ प्रतिरोध प्रदान किया, जो नेमाटोड और स्तनधारी न्यूरॉन्स11दोनों में बाद में गर्मी के तनाव से शुरू हुआ। दिलचस्प बात यह है कि हल्के-ऊंचे तापमान पर निमाटोड की दैनिक पूर्वसंक्षण न्यूरोडिजेनरेशन से रक्षा करती है, जो विविध उत्तेजनाओं द्वारा दिए जाते हैं, जैसे आयनिक असंतुलन (उदाहरण के लिए, मेक-4 (u231) और/या डिग्री-3 (u662)और प्रोटीन एकत्रीकरण (जैसे, α-सिन्यूक्लिन और पॉलीक्यू40)11,,13।
यहां, हम मानव रोगों के अच्छी तरह से स्थापित मॉडलों में आयु-निर्भर न्यूरोडिजेनरेशन की निगरानी और मूल्यांकन करने के लिए सी एलिगेंस का उपयोग करने के बहुमुखी तरीकों का वर्णन करते हैं, जैसे कि एक्सटोटॉक्सीसिटी-ट्रिगर सेल डेथ, पार्किंसंस और हंटिंगटन रोग। इसके अलावा, हम न्यूरोडिजेनरेशन के कई मॉडलों में गर्मी पूर्व शर्त की न्यूरोप्रोटेक्टिव भूमिका को रेखांकित करते हैं। आनुवंशिक और/या औषधीय स्क्रीन के साथ इन तकनीकों का एक संयोजन संभावित चिकित्सीय रुचि के साथ उपन्यास सेल डेथ मॉड्यूलर्स की पहचान और लक्षण वर्णन में परिणाम देगा ।
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Protocol
1. परिगलित कोशिका मृत्यु-अतिसक्रिय आयन चैनलों द्वारा प्रेरित
नोट: अन्य लोगों के बीच मेक-4 और डेप-3 सहित डिजेनेरिन्स के जीन परिवार में लाभ-समारोह म्यूटेशन, अतिसक्रिय आयन चैनलों की पीढ़ी में परिणाम है जो कीड़े3में मशीनोसेंसेशन के लिए आवश्यक छह टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स की परिगलित कोशिका मृत्यु को ट्रिगर करते हैं। पतिजीरिन के गुमराह उत्तेजना से प्रेरित परिगलन स्तनधारियों में एक्सटॉक्सिकिटी के लिए कई मशीनी और रूपात्मक समानताएं प्रदर्शित करता है। परिगलन के दौरान न्यूरॉनल अस्तित्व पर ऊर्जा मेटाबोलिज्म और कैल्शियम होगोस्टेसिस के रखरखावकीमहत्वपूर्ण भूमिका होती है । अतिसक्रिय आयन चैनलों, एमईसी-4 (u231) एक्स और डेप-3 (u662) Vद्वारा ट्रिगर की गई परिग्टिक सेल मौत की निगरानी के लिए निम्नलिखित उपभेदों का उपयोग किया जा सकता है।
- परिगलित कोशिका मृत्यु की जांच के लिए उत्परिवर्ती कीड़े का रखरखाव, समकालिकता और तैयारी
- पहला दिन: नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) पर एमईसी-4 (u231) या डेप-3 (u662) उत्परिवर्ती सूत्रकृमि के एल4 लार्वा चुनें; तालिका 1) एक विच्छेदन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके एस्चेरिचिया कोलाई (OP50) के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटें।
- 10 एल4 नेमाटोड प्रति वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेट रखें और उन्हें 20 डिग्री सेल्सियस के मानक तापमान पर उगाएं।
- दिन 5: M9 बफर(टेबल1) के 1 एमएल के साथ प्लेटों को धोएं और जानवरों को 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें।
- 30 एस के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें।
- ब्लीचिंग समाधान के 0.5 एमएल (एच2ओ के 7 एमएल, 5 एन नाओएच के 1 एमएल और ब्लीच के 2 एमएल) जोड़ें।
नोट: ब्लीचिंग समाधान धीरे-धीरे अपनी दक्षता खो देता है; इसलिए इसे रोजाना तैयार किया जाना चाहिए। - भंवर और समय-समय पर निगरानी तब तक कीड़े भंग हो जाते हैं।
नोट: 5 मिनट से अधिक अवधि के लिए ब्लीचिंग से बचें क्योंकि भ्रूण की व्यवहार्यता प्रभावित होगी । - 30 एस के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें।
- M9 बफर के 1 एमएल के साथ गोली (अंडे) दो बार धोएं।
- धोने के बाद, M9 बफर के 200 माइक्रोन में अंडे को फिर से खर्च करें और उन्हें पानी के स्नान में 34 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए उगाएं।
- 20 डिग्री सेल्सियस पर नियंत्रण नमूना (अंडे) का एक अलग समूह बनाए रखें।
- पिपेट 100 माइक्रोन नियंत्रण या गर्मी के झटके से इलाज अंडे और उन्हें गैर वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेटों पर रखें। हर प्लेट में कम से कम 100-200 अंडे होते हैं।
- अंडे को 20 डिग्री सेल्सियस पर हैचिंग तक इनक्यूबेटेड करें।
- अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी; का उपयोग कर परीक्षा के लिए बढ़ते L1 लार्वा; नोमारस्की) माइक्रोस्कोपी
- 2% एगरेग्याड पैड तैयार करें।
- प्लेटों को धोने और 1.5 एमएल ट्यूबों में L1 लार्वा नेमाटोड एकत्र करने के लिए एम 9 बफर के 1 एमएल का उपयोग करें।
- 30 एस के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- सुपरनेट निकालें और गोली (सूत्रकृमि) रखें।
- नेमाटोड को एनेस्थेटाइज करने के लिए 20 एमएम एम9/लेविमिसोल बफर के 100 माइक्रोल जोड़ें।
नोट: एक संवेदनाहारी के रूप में सोडियम azide से बचें। सोडियम अज़ाइड माइटोकॉन्ड्रियल क्षति और ऑक्सीडेटिव तनाव को ट्रिगर करता है जो अंततः सेल डेथ इंडक्शन के लिए अग्रणी होता है - M9/levamisole बफर के पिपेट 10 माइक्रोन एल1 कीड़े युक्त और उन्हें 2% agarose पैड(तालिका 1)पर माउंट ।
- धीरे-धीरे नमूने के शीर्ष पर एक कवरलिप रखें।
नोट: इमेजिंग की प्रक्रिया के दौरान आर्द्रता को संरक्षित करने के लिए नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करें। - अंतर हस्तक्षेप के विपरीत (डीआईसी; का उपयोग कर कीड़े का निरीक्षण करें; नोमारस्की) माइक्रोस्कोपी।
- नेमाटोड प्रति विशेषता वैक्यूलेटेड उपस्थिति के साथ कोशिकाओं की गिनती करके छह स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स का स्कोर न्यूरोडिजेनरेशन।
2. प्रोटीन कुल प्रेरित न्यूरोडिजेनरेशन
नोट: निम्नलिखित उपभेदों का उपयोग प्रोटीन समुच्चय-प्रेरित न्यूरोटॉक्सीसिटी की जांच करने के लिए किया जा सकता है:(क)डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स में मानव α-सिन्यूक्लिन की अतिव्यक्तता, UA44: है[baIn1; पीdat-1α-syn, pdat-1GFP] और(B)मानव पॉलीग्लूटामाइन प्रोटीन (PolyQ) पैन-न्यूरोनली, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40:YFP]6,,10।
- न्यूरोडिजेरेशन परख के लिए ट्रांसजेनिक नेमाटोड का रखरखाव, सिंक्रोनाइजेशन और तैयारी
- सी एलिगेंस विकास और विकास की निगरानी के लिए एक विच्छेदन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
- दिन 1: हौसले से OP50-वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेटों पर प्रत्येक तनाव के 15-20 एल4 लार्वा को उठाकर और स्थानांतरित करके ट्रांसजेनिक नेमाटोड की आबादी को सिंक्रोनाइज़ करें।
नोट: प्रति स्थिति प्रत्येक तनाव की कम से कम तीन प्लेटों का उपयोग करें। - इनक्यूबेट और नेमाटोड को 20 डिग्री सेल्सियस के मानक तापमान पर बढ़ने दें।
- दूसरा दिन: 34 डिग्री सेल्सियस पर सेट इनक्यूबेटर सेट में प्लेटों को स्थानांतरित करके 30 मिनट के लिए दैनिक पूर्व शर्त का प्रदर्शन करें। फिर, पूर्व शर्त पर दिए गए सूत्रकृमि को 20 डिग्री सेल्सियस के मानक तापमान पर वापस लौटें।
नोट: विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि लंबी अवधि के जोखिम के लिए उच्च तापमान के प्रति संवेदनशील हो सकता है । - (क)यदि डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स, UA44 में मानव α-ynuclein के अतिउपृष्ण की जांच कर रहा है: है[baIn1; पीdat-1α-syn, pdat-1GFP]: 9 दिन पर, डोपेमिनेर्गिक न्यूरोनल सेल मौत के लिए 7 दिन पुराने ट्रांसजेनिक सूत्रो की निगरानी करें ।
- (ख)यदि मानव पॉलीग्लोटामाइन प्रोटीन (पॉलीक्यू) पैन-न्यूरोनली, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] के अतिव्यक्तता की जांच कर रहे हैं: 5 दिन पर, 4 दिन पुराने ट्रांसजेनिक जानवरों के सिर क्षेत्र में न्यूरोनल पॉलीक्यू समुच्चय को मापते हैं जो Q40::YFP व्यक्त करते हैं ।
- सूक्ष्म जांच के लिए नमूने बढ़ते
- 2% एगरेग्डेड पैड(टेबल 1)तैयार करें।
- एग्राजर्ड पैड के केंद्र में 20 m M9/levamisole बफर ड्रॉप के 10 μL जोड़ें ।
- संबंधित ट्रांसजेनिक नेमाटोड चुनें और उन्हें M9/levamisole ड्रॉप में स्थानांतरित करें।
नोट: प्रति बूंद 20-30 सूत्रकृमि रखें। - धीरे-धीरे नमूने के शीर्ष पर एक कवरलिप रखें।
नोट: इमेजिंग की प्रक्रिया के दौरान आर्द्रता को संरक्षित करने के लिए नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करें। - संबंधित नमूनों की सूक्ष्म जांच के लिए आगे बढ़ें।
- अधिग्रहण प्रक्रिया और ट्रांसजेनिक नेमाटोड के डेटा विश्लेषण ने डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स में α-सिन्यूक्लिन और साइटोसोलिक जीएफपी को सह-व्यक्त किया
- एक कैमरे के साथ संयुक्त एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, EVOS FL ऑटो 2) ।
- 20x आवर्धन पर सिर क्षेत्र के जेड-स्टैक छवियों का पता लगाएं और कैप्चर करें।
- अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियों को सहेजें और एकत्र करें।
- अधिग्रहीत छवियों के विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें।
- निम्नलिखित सेलुलर विशेषताओं को स्कोर करके न्यूरोडिजेनरेशन के लिए ट्रांसजेनिक कीड़े की जांच करें, (i) डैट-1के प्रमोटर के तहत जीएफपी व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स से फ्लोरेसेंस की हानि, (ii) न्यूरॉन्स सोमा और/या अक्षीय ब्लबिंग, आउटग्रोथ या डेंड्रिटिक हानि दिखाते हैं ।
- एक सॉफ्टवेयर पैकेज (जैसे, एक्सेल) का उपयोग करके डेटा का आयात और विश्लेषण करें।
3. अधिग्रहण प्रक्रिया और ट्रांसजेनिक सूत्रकृमि के डेटा विश्लेषण पैन-न्यूरोनैल पॉलीक्यू 40 को व्यक्त करते हुए वाईएफपी के साथ जुड़े हुए हैं
- एक कैमरे के साथ संयुक्त एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, EVOS FL ऑटो 2) ।
- 20x आवर्धन पर सिर क्षेत्र के जेड-स्टैक छवियों का पता लगाएं और कैप्चर करें।
- अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियों को सहेजें और एकत्र करें।
- फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अधिग्रहीत छवियों के विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें।
- फिजी कार्यक्रम14के साथ खुली छवियां ।
- छवि और रंग ड्रॉप-डाउन मेनू के माध्यम से स्प्लिट चैनल कमांड का चयन करें।
नोट: ग्रीन चैनल छवि रखें। - मैन्युअल रूप से ब्याज के फ्लोरोसेंट क्षेत्र (आरओआई; जैसे, सिर) को सेट करने के लिए फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करें।
- विश्लेषण और उपकरण ड्रॉप-डाउन मेनू के माध्यम से आरओआई प्रबंधक में संबंधित आरओआई जोड़ें।
- प्रक्रिया और घटाना पृष्ठभूमि का चयन करके पृष्ठभूमि को 50% तक घटाएं।
- मेनू कमांड इमेज के माध्यम से दहलीज मानों को सेट करें और लागू करें । समायोजित करें । दहलीज। पूरे प्रयोग के छवि विश्लेषण के दौरान एक ही सीमा मान रखें और सेट करें।
- आरओआई मैनेजरसे संबंधित आरओआई का चयन करें ।
- मेनू कमांड का विश्लेषण और कणोंका विश्लेषण और विश्लेषण करके प्रोटीन की संख्या का विश्लेषण करें ।
- प्रत्येक अधिग्रहीत छवि के लिए 3.5-3.12 चरणों को दोहराएं।
- अलग परिणाम विंडो से प्रदर्शन मानों की प्रतिलिपि।
- एक सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके परिणामों का पेस्ट/आयात और विश्लेषण करें।
4. सांख्यिकीय विश्लेषण की रिपोर्ट करें
- प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए कम से कम 30 सूत्रकृमि का उपयोग करें। तीन जैविक प्रतिकृति प्रदर्शन करते हैं।
- सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें या तो छात्र टीपरीक्षण (दो समूहों के बीच तुलना) या ANOVA (कई समूहों के बीच तुलना) पी & 0.05 के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है ।
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Representative Results
परिगलित कोशिका मृत्यु-अतिसक्रिय आयन चैनलों द्वारा प्रेरित
यहां प्रस्तुत प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए, mec-4 (u231) और deg-3u662) उत्परिवर्ती भ्रूण या तो 34 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए इनक्यूबेटेड या 20 डिग्री सेल्सियस के मानक तापमान पर रखा गया । हैचिंग पर, दोनों समूहों के एल1 लार्वा चरण में न्यूरोनल सेल लाशों की संख्या निर्धारित की गई थी। नेक्रोटिक सेल डेथ को नेमाटोड में कम किया जाता है जो हीट शॉक प्रीकंडीशनल अंडे(चित्रा 1ए-1बी)से रचा जाता है।
प्रोटीन कुल प्रेरित न्यूरोडिजेनरेशन
ट्रांसजेनिक नेमाटोड ओवरएक्सप्रेसिंग (ए) मानव α-सिन्यूक्लिन और साइटोप्लाज्मिक जीएफपी में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स और (बी) मानव पॉलीग्लूटामाइन प्रोटीन (पॉलीक्यू) YFP पैन-न्यूरोनally के साथ जुड़े, 34 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए दैनिक उजागर किया गया । हीट शॉक प्रीकंडीशनिंग 7-दिन पुराने वयस्क हर्मेफ्रोडाइट्स(चित्रा 2A)में α-सिन्यूक्लिन-प्रेरित सेल मौत के खिलाफ न्यूरोप्रोटेक्शन को बढ़ावा देता है और Q40:: YFP प्रोटीन 4-दिवसीय वयस्कों(चित्रा 2B और चित्रा 3)के सिर क्षेत्र में समुच्चय कम हो जाता है।
चित्रा 1: अतिसक्रिय आयन चैनल-प्रेरित नेक्रोसिस। (A) एमईसी-4 (u231) L1 लार्वा की प्रतिनिधि डीआईसी माइक्रोस्कोपी छवि, जिसमें एरोहेड विशेषता परिगलित वैक्यूल्स का संकेत देते हैं। न्यूरोडिजेनरेशन सूजन नाभिक के प्रारंभिक चरण में कोशिकाओं के भीतर प्रदर्शित कर रहे हैं। छवि एक 40x आपत्ति लेंस का उपयोग करके अधिग्रहीत किया गया था । स्केल बार, 20 माइक्रोन। (ख)विकास के एल1 लार्वा चरण में न्यूरोनल सेल लाशों की संख्या, प्रति 100 जानवरों को न्यूरोटॉक्सिक एमईसी-4 (u231) या डेगा-3 (u662) एलील्स ले जाते हैं। अनुपचारित समकक्षों (एन = 100 जानवरों प्रति जीनोटाइप और परख) की तुलना में पूर्व शर्त वाले अंडों से रची गई L1 लार्वा में नेक्रोटिक सेल डेथ को दबा दिया जाता है; डेटा का प्रतिनिधित्व करता है ± S.E.M., ***पीऔर लेफ्टिनेंट; 0.001 अनुपचारित बनाम पूर्व शर्त के लिए; टी-टेस्ट) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: 34 डिग्री सेल्सियस पर दैनिक पूर्वसंक्षन α-सिन्यूक्लिन के खिलाफ न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदान करता है और सी एलिगेंसमें पॉलीक्यू समुच्चय को कम करता है। (Α)पूर्वकाल डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स (सीईपी और एडीईएस) का अस्तित्व अनुपचारित और पूर्वनिरीक्षित सूत्रकृमि में मानव α-सिन्यूक्लिन के साथ एक साथ साइटोप्लाज्मिक जीएफपी को सह-व्यक्त करता है। पूर्वशंडित सूत्रकृमि अनुपचारित की तुलना में बढ़ी हुई न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदर्शित करते हैं। न्यूरोनल सेल निकायों (तारक) और एक्सोनल बीडिंग (एरोहेड) के अवशेष अनुपचारित सूत्रकृमि (शीर्ष पैनल) में देखे जाते हैं। सोमा (तारक) और न्यूरोनल प्रक्रियाओं (एरोहेड) दोनों को प्रीकंडीशनिंग पर संरक्षित किया जाता है। 20x आपत्ति लेंस का उपयोग करके प्राप्त छवियां और अधिकतम तीव्रता जेड-प्रक्षेपण को चित्रित करें। अधिग्रहण विवरण: उज्ज्वल, 0.15. स्केल बार, 20 माइक्रोन। वयस्कता के सातवें दिन पूर्वकाल डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स के न्यूरोनल अस्तित्व के लिए कीड़े बनाए गए थे। (ख)न्यूरोनल पॉलीक्यू अनुपचारित और पूर्वशंडित ट्रांसजेनिक नेमाटोड के सिर क्षेत्र में वयस्कता के चौथे दिन पता चला । पूर्वशंडित ट्रांसजेनिक कीड़े अनुपचारित की तुलना में कम न्यूरोनल Q40:: वाईएफपी समुच्चय मौजूद हैं। सिर क्षेत्र की प्रतिनिधि छवियों को न्यूरोनल कोशिकाओं में पॉलीक्यू प्रोटीन समुच्चय का संकेत देने वाले एरोहेड के साथ दिखाया गया है। 20x आपत्ति लेंस का उपयोग करके प्राप्त छवियां और अधिकतम तीव्रता जेड-प्रक्षेपण को चित्रित करें। अधिग्रहण विवरण: उज्ज्वल, 0.0175। स्केल बार, 20 माइक्रोन। तीन स्वतंत्र प्रयोगों में से प्रत्येक में प्रति शर्त 30-35 जानवरों की मात्रा निर्धारित की गई थी । डेटा का प्रतिनिधित्व करता है ± S.E.M., ***P< 0.05, अकर्चुए टी-टेस्ट। t कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि विश्लेषण। 1. फिजी सॉफ्टवेयर के साथ एक अधिग्रहीत छवि खोलें; 2. छवि को बदलने के लिए "छवि" और "रंग" ड्रॉप डाउन मेनू के माध्यम से "स्प्लिट चैनल" कमांड का चयन करें; 3, 4। "ग्रीन चैनल" छवि रखें और "फ्रीहैंड चयन" उपकरण का उपयोग करके, ब्याज के फ्लोरोसेंट क्षेत्र (आरओआई; उदाहरण के लिए, सिर) को एनरैप करें। "विश्लेषण" और "उपकरण" ड्रॉप-डाउन मेनू के माध्यम से "आरओआई प्रबंधक" में संबंधित आरओआई जोड़ें; 5, 6. "प्रक्रिया" और "घटाना पृष्ठभूमि" का चयन करके पृष्ठभूमि को 50% तक घटाएं; 7, 8. मेनू कमांड "इमेज", "एडजस्ट" और "थ्रेसहोल्ड" के माध्यम से सीमा मानों को सेट अप करें और लागू करें; 9. "आरओआई प्रबंधक" से संबंधित आरओआई का चयन करें; 10-12. मेनू कमांड "विश्लेषण" और "कणों का विश्लेषण" का उपयोग करके प्रोटीन समुच्चय की संख्या का विश्लेषण करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | नुस्खा | |
| 2% एगरेड पैड | 1. एक बेलनाकार ग्लास बीकर में 0.5 ग्राम एगर उठी वजन। | |
| 2. M9 बफर के 25 एमएल जोड़ें। | ||
| 3. उबलते के करीब तक माइक्रोवेव में गर्म करें। बाहर निकालें, एक पिपेट टिप के साथ हलचल करें और फिर से उबालें। जब तक एगर उठे भंग न हो जाए तब तक दोहराएं। | ||
| 4. बेंच पर एक खाली माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें। | ||
| 5. स्लाइड के बीच में ताजा 2% agarose समाधान की एक बूंद (~ 50 μL) रखो। | ||
| 6. एक दूसरा माइक्रोस्कोप स्लाइड लें और इसे एगरेग्यार ड्रॉप के शीर्ष पर रखें। बूंद को समतल करने के लिए धीरे-धीरे दबाएं। | ||
| 7. एगर उठे को 30 सेकंड के लिए कठोर होने दें और धीरे-धीरे शीर्ष माइक्रोस्कोप स्लाइड को हटा दें। | ||
| 8. तुरंत नमूना तैयार करने के साथ आगे बढ़ें, क्योंकि एग्राजिंग पैड लगभग 5 मिनट के भीतर सूखना शुरू कर देंगे। | ||
| टिप: आर्द्रता को लंबे समय तक संरक्षित करने के लिए एक कवर के रूप में शीर्ष माइक्रोस्कोप स्लाइड छोड़ दें (~ 1 घंटे)। इस प्रकार, प्रयोगों के दौरान कई एगरेग्मेंट पैड तैयार किए जा सकते हैं और तेजी से उपयोग किए जा सकते हैं। | ||
| M9 बफर | 1. 1 एल डिस्टिल्ड वाटर और ऑटोक्लेव में केएच2पीओ4,6 ग्राम एनए2एचपीओ4,5 ग्राम एनएसीएल में घोलें। | |
| 2. ठंडा होने दें और 1 एम एमजीएसओ 4 (बाँझ) का1 एमएल जोड़ें। | ||
| 3. 4 डिग्री सेल्सियस पर M9 बफर स्टोर करें। | ||
| नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (एनजीएम) आगर प्लेट्स | 1. एनएसीएल के 3 ग्राम, बैक्टोपटोन के 2.5 ग्राम, स्ट्रेप्टोमाइसिन के 0.2 ग्राम, आगर के 17 ग्राम और आसुत पानी के 900 मिलीलीटर जोड़ें। ऑटोक्लेव। | |
| 2. 55-60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें। | ||
| 3. कोलेस्ट्रॉल स्टॉक समाधान का 1 एमएल, 1 एम सीएएल2का 1 एमएल, 1 एम एमजीएसओ 4 का1एमएल, नास्टेटिन स्टॉक सॉल्यूशन का 1 एमएल, बाँझ 1 एम फॉस्फेट बफर का 25 एमएल, पीएच 6.0 और 1 एल तक आसुत बाँझ पानी जोड़ें। | ||
| 4. पिपेट 10 एमएल मीडियम प्रति पेट्री डिश और जमना छोड़ दें। | ||
| 5. इस्तेमाल होने तक प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। | ||
तालिका 1: उपयोग किए जाने वाले अभिकर् ती के लिए अनुशंसित व्यंजनों का उपयोग किया जाता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्षक व्यंजनों को यहां रेखांकित किया गया है।
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Discussion
यहां, हम उम्र पर निर्भर न्यूरोडिजेनरेशन की जांच करने वाले कुछ बहुमुखी सी एलिगेंस मॉडल के विकास, समकालिकीकरण और सूक्ष्म परीक्षा के लिए व्यापक रूप से सुलभ पद्धतियों का परिचय और वर्णन करते हैं। विशेष रूप से, हम अति सक्रिय आयन चैनल-प्रेरित नेक्रोसिस और प्रोटीन कुल प्रेरित न्यूरोटॉक्सिसिटी 1,2,3,,4,,5,,7,,9,,10, 11,का उपयोग करके उम्र से संबंधित न्यूरोनल टूटने के सेलुलर और आणविक आधार का आकलन और विच्छेदन करते10,हैं।,
यद्यपि वीवो सेल डेथ असेसमेंट में वर्णित प्रक्रियाएं सीधी हैं और किसी भी प्रयोगशाला में आसानी से की जा सकती हैं, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए। गरमी प्रतिबंध और भुखमरी को ऑटोफैगी जैसे कई तनाव मार्गों को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, जो न्यूरोडिजेनरेशन या प्रोटीन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है संचय13,15,,16।, इस प्रकार, अच्छी तरह से खिलाया और गैर भूखे सूत्रकृमि का उपयोग किया जाना चाहिए। हीट शॉक प्रीकंडीशनिंग कई न्यूरोडीजेनेरेटिव उत्तेजनाओं के खिलाफ न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदान करता है और इसका उपयोग एक स्थापित सेल डेथ मॉड्यूलर11,,13के रूप में किया जाता है। हालांकि, कुछ म्यूटेंट लंबी अवधि के लिए उच्च तापमान जोखिम के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इस प्रकार, उचित विकासात्मक चरण, आयु और गर्मी सदमे पूर्व की अवधि प्रयोगात्मक रूप से हर बार निर्धारित किया जाना चाहिए, जब विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के जानवरों, जो उच्च तापमान के प्रति संवेदनशील हो सकते हैं, का उपयोग किया जाता है। उम्र बढ़ने के दौरान नेमाटोड आंतों के ऑटोफ्लोरेसेंस की क्रमिक वृद्धि देखी जाती है। इस प्रकार, न्यूरोनल सेल निकायों और आंतों के क्षेत्र के करीब प्रक्रियाओं AM101 तनाव की इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान बचा जाना चाहिए। न्यूरोनल कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें, जो आंत-व्युत्पन्न ऑटोफ्लोरेसेंस को बाईपास करने के लिए सिर और/या पूंछ क्षेत्र में स्थित हैं । M9/levamisome बफर और 2% agarose पैड उत्पन्न करने के लिए पानी के बजाय M9 बफर का उपयोग करें। M9 बफर एक अनुकूल ऑस्मोटिक वातावरण सुनिश्चित करता है जो सूक्ष्म दृश्य और विश्लेषण के दौरान निमाटोड को सूखने से बचाता है।
वर्णित पद्धतियां रेखांकित करती हैं कि न्यूरोडिजेरेशन के सूत्रकृमि मॉडलों का संयोजन, सेल डेथ मोडुलेटर्स के लिए आनुवंशिक और औषधीय स्क्रीन के साथ न्यूरोनल सर्किट की उम्र से जुड़ी हानि की अभूतपूर्व समझ पैदा कर सकता है और मानव स्वास्थ्य और जीवन की गुणवत्ता को बढ़ावा देने वाले न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के खिलाफ उपन्यास चिकित्सीय हस्तक्षेपों के विकास को बढ़ावा दे सकता है।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।
Acknowledgments
हम वीडियो रिकॉर्डिंग और संपादन के लिए Chaniotakis एम और Kounakis कश्मीर का शुक्रिया अदा करते हैं । केपी को हेलेनिक फाउंडेशन फॉर रिसर्च एंड इनोवेशन (एचएफआरआई) और जनरल सेक्रेटेरिएट फॉर रिसर्च एंड टेक्नोलॉजी (जीएसआरटी) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया जाता है । एनटी को यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी - GA695190 - मन्ना), यूरोपीय आयोग फ्रेमवर्क कार्यक्रम और यूनानी शिक्षा मंत्रालय से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
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