Summary
Qui, introduciamo e descriviamo metodologie ampiamente accessibili utilizzando alcuni modelli di nematodi versatili, tra cui la necrosi ionica indotta dal canale ionico e la neurotossicità indotta da aggregazioni proteiche, per monitorare e sezionare le basi cellulari e molecolari delle malattie neurodegenerative associate all'età.
Abstract
Combattere le patologie neurodegenerative umane e gestire il loro impatto socioeconomico pervasivo sta diventando una priorità globale. Nonostante i loro effetti nocivi sulla qualità della vita umana e sul sistema sanitario, la maggior parte dei disturbi neurodegenerativi umani rimangono ancora incurabili e non prevenibili. Pertanto, lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici contro tali malattie sta diventando un'urgenza urgente. Il deterioramento associato all'età dei circuiti neuronali e della funzione è evolutivamente conservato in organismi diversi come il verme umile Caenorhabditis elegans e gli esseri umani, che significa somiglianze nei meccanismi cellulari e molecolari sottostanti. C. elegans è un modello genetico altamente malleabile, che offre un sistema nervoso ben caratterizzato, trasparenza del corpo e un repertorio diversificato di tecniche genetiche e di imaging per valutare l'attività neuronale e il controllo della qualità durante l'invecchiamento. Qui, introduciamo e descriviamo metodologie che utilizzano alcuni modelli di nematodi versatili, tra cui la necrosi ioonizzata indotta dal canale ionico (ad esempio, deg-3(d) e mec-4(d)) e l'aggregazione proteica (ad esempio, la siccoliera e la neurotossicisia indotta dalla poli-glutamata) per sezionare e sezionare le basi cellulari e molecolari. Una combinazione di questi modelli di neurodegenerazione animale, insieme a schermi genetici e farmacologici per modulatori di morte cellulare porterà a una comprensione senza precedenti della ripartizione della funzione neuronale legata all'età e fornirà informazioni critiche con ampia rilevanza per la salute umana e la qualità della vita.
Introduction
Negli ultimi due decenni, C. elegans è stato ampiamente utilizzato come organismo modello per studiare i meccanismi molecolari della morte cellulare necrotica. C. elegans offre un sistema nervoso eccezionalmente ben caratterizzato e mappato, una struttura del corpo trasparente e un repertorio diversificato di metodi genetici e di imaging per monitorare la funzione cellulare in vivo e la sopravvivenza durante l'invecchiamento. Così, diversi modelli genetici C. elegans di neurodegenerazione sono già stati sviluppati per valutare la vitalità neuronale. In particolare, i modelli di nematode ben descritti e utilizzati includono la necrosi ioattiva indotta dal canale ionico1,2,3 e la morte cellulare innescata da una maggiore aggregazione proteica4,5,6,7,8,9,10 e colpo di calore11,12, tra gli altri.
L'esposizione a breve termine a temperature subletali ha conferito resistenza contro la morte delle cellule necrotiche, innescata da un successivo stress termico sia nei nematodi che nei neuroni mammiferi11. È interessante notare che il precondizionamento giornaliero dei nematodi a una temperatura elevata lieve protegge dalla neurodegenerazione, che viene inflitta da diversi stimoli, come lo squilibrio ionico (ad esempio, il mec-4(u231) e/o il deg-3 (u662)) e l'aggregazione delle proteine (ad esempio, zo-sinucleina e poliQ40)11,13.
Qui, descriviamo metodologie versatili usando C. elegans per monitorare e valutare la neurodegenerazione dipendente dall'età in modelli consolidati di malattie umane, come la morte cellulare innescata da eccitotossicità, il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington. Inoltre, sottolineiamo il ruolo neuroprotettivo del precondizionamento del calore in diversi modelli di neurodegenerazione. Una combinazione di queste tecniche con schermi genetici e/o farmacologici comporterà l'identificazione e la caratterizzazione di nuovi modulatori di morte cellulare, con potenziale interesse terapeutico.
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Protocol
1. Morte delle cellule necrotiche indotta da canali ionici iperattivi
NOTA: Mutazioni di guadagno di funzione nella famiglia genica dei degenerins, tra cui mec-4 e deg-3 tra gli altri, provoca la generazione di canali iperattivi che innescano la morte necrotica cellulare di sei neuroni recettori tattili necessari per la meccanoscima nei vermi3. La necrosi indotta dalla stimolazione aberrante dei degenerini mostra diverse somiglianze meccanicistiche e morfologiche con l'eccitotossicità nei mammiferi. Il mantenimento del metabolismo energetico e dell'omeostasi del calcio ha un ruolo cruciale sulla sopravvivenza neuronale durante la necrosi11. I seguenti ceppi possono essere utilizzati per monitorare la morte delle cellule necrotiche innescata da canali ionici iperattivi, mec-4(u231)X e deg-3(u662)V.
- Manutenzione, sincronizzazione e preparazione di worm mutanti per l'esame della morte delle cellule necrotiche
- Giorno 1: Raccogliere larve L4 di mec-4(u231) o deg-3(u662) nematodi mutanti su Nematode Growth Media (NGM; Tabella 1) piastre seminate con Escherichia coli (OP50) utilizzando uno stereomicroscopio dissettivo.
- Mettere 10 l4 nematodi per piastra NGM di semi e coltivarli alla temperatura standard di 20 gradi centigradi.
- Giorno 5: Lavare le piastre con 1 mL di tampone M9 (Tabella 1) e raccogliere gli animali in un tubo da 1,5 mL.
- Centrifuga a 10.000 x g per 30 s e rimuovere il supernatante.
- Aggiungere 0,5 mL di soluzione di sbiancamento (7 mL di H2O, 1 mL di 5 N NaOH e 2 mL di candeggina).
NOTA: la soluzione di sbiancamento perde gradualmente la sua efficienza; quindi dovrebbe essere preparato ogni giorno. - Vortice e monitorare periodicamente fino a quando i vermi si sono sciolti.
NOTA: Evitare lo sbiancamento per periodi più lunghi di 5 min perché la vitalità degli embrioni ne risentirà. - Centrifuga a 10.000 x g per 30 s e rimuovere il supernatante.
- Lavare due volte il pellet (uova) con 1 mL di tampone M9.
- Dopo il lavaggio, risospendere le uova in un tampone da 200 gradi e incubarle per 25 min a 34 gradi in un bagno d'acqua.
- Mantenere un gruppo separato di campioni di controllo (uova) a 20 gradi centigradi.
- Pipetta 100 - L di controllo o calore uova urto-trattamento e metterli su piastre NGM non seminata. Ogni piatto contiene almeno 100-200 uova.
- Le uova hanno incubato a 20 gradi centigradi fino alla schiusa.
- Montaggio larve L1 per l'esame utilizzando il contrasto di interferenza differenziale (DIC; Nomarsky) microscopia
- Preparare 2% pastiglie di agarose.
- Utilizzare 1 mL di m9 tampone per lavare le piastre e raccogliere nematodi larve L1 in tubi da 1,5 mL.
- Centrifuga a 10.000 x g per 30 s.
- Rimuovere il supernatante e tenere il pellet (nematodi).
- Aggiungere 100 l di 20 mM M9/levamisole tampone per anetizzare i nematodi.
NOTA: Evitare l'azide di sodio come anestetico. L'anice di sodio innesca danni mitocondriali e stress ossidativo che porta alla fine all'induzione della morte cellulare - Pipetta 10 -L di buffer M9/levamisole contenente vermi L1 e montarli su pastiglie di agarose del 2%(tabella 1).
- Posizionare delicatamente un coperchio sulla parte superiore del campione.
NOTA: Sigillare la coverslip con smalto per preservare l'umidità durante tutto il processo di imaging. - Osservare i vermi usando il contrasto di interferenza differenziale (DIC; Nomarsky) microscopia.
- Punteggio neurodegenerazione dei sei neuroni recettori touch contando le cellule con il caratteristico aspetto vacolato per nematode.
2. Neurodegenerazione indotta da aggregati proteici
NOTA: I seguenti ceppi possono essere utilizzati per studiare la neurotossicità indotta dagli aggregati proteici: (A) sovraespressione della sostanza umana nei neuroni dopaminergici, UA44: È[baIn1; pdat-1s-syn, pdat-1GFP] e (B) sovraespressione della proteina poliglutamina umana (PolyQ) panneuronalmente, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
- Manutenzione, sincronizzazione e preparazione di nematodi transgenici per il saggio di neurodegenerazione
- Utilizzare uno stereoscopio dissegente per monitorare lo sviluppo e la crescita di C. elegans.
- Giorno 1: Sincronizzare la popolazione di nematodi transgenici raccogliendo e trasferendo 15-20 larve L4 di ogni ceppo su piastre NGM appena OP50.
NOTA: Utilizzare almeno tre piastre di ciascuna deformazione per condizione. - Incubare e lasciare che i nematodi crescano alla temperatura standard di 20 gradi centigradi.
- Giorno 2: Eseguire il precondizionamento giornaliero per 30 minuti trasferendo le piastre in un'incubatrice impostata a 34 gradi centigradi. Quindi, restituire i nematodi precondizionati alla temperatura standard di 20 gradi centigradi.
NOTA: diversi background genetici potrebbero essere sensibili all'alta temperatura per lunghi periodi di esposizione. - (A) Se si studia la sovraespressione dell'uomo di sivinucleina nei neuroni dopaminergici, UA44: È[baIn1; pdat-1- syn, pdat-1GFP]: il giorno 9, monitorare i nematodi transgenici di 7 giorni per la morte delle cellule neuronali dopaminergiche.
- (B) Se si studia la sovraespressione della proteina poliglutamina umana (PolyQ) panneuronalmente, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: il giorno 5 misura gli aggregati neuronali in poliq nella regione di testa di animali transgenici di 4 giorni che esprimono Q40::YFP.
- Montaggio dei campioni per l'esame microscopico
- Preparare il 2% delle pastiglie di agarose (Tabella 1).
- Aggiungere 10 L di 20 mM M9/levamisole tampone cadere al centro del pad agarose.
- Scegli i rispettivi nematodi transgenici e trasferiscili in una goccia M9/levamisole.
NOTA: Posizionare 20-30 nematodi per goccia. - Posizionare delicatamente un coperchio sulla parte superiore del campione.
NOTA: Sigillare la coverslip con smalto per preservare l'umidità durante tutto il processo di imaging. - Procedere all'esame microscopico dei rispettivi campioni.
- Processo di acquisizione e analisi dei dati dei nematodi transgenici che coesprimono la gFP di z-sinucleina e citosolica nei neuroni dopaminergici
- Utilizzare un microscopio a epifluorescenza combinato con una telecamera (ad esempio, EVOS FL Auto 2).
- Rileva e acquisisci immagini z-stack della regione della testa con un ingrandimento di 20 x.
- Salvare e raccogliere le immagini di proiezione di intensità massima.
- Procedere all'analisi delle immagini acquisite.
- Esaminare i vermi transgenici per la neurodegenerazione segnando le seguenti caratteristiche cellulari, (i) perdita di fluorescenza da neuroni che esprimono GFP sotto il promotore di dat-1, (ii) neuroni che mostrano soma e/o blebbing assonale, escresce o perdita dendritica.
- Importare e analizzare i dati utilizzando un pacchetto software (ad esempio Excel).
3. Processo di acquisizione e analisi dei dati di nematodi transgenici che esprimono pan-neuronalmente PolyQ40 fusa con YFP
- Utilizzare un microscopio a epifluorescenza combinato con una telecamera (ad esempio, EVOS FL Auto 2).
- Rileva e acquisisci immagini z-stack della regione della testa con un ingrandimento di 20 x.
- Salvare e raccogliere le immagini di proiezione di intensità massima.
- Procedere all'analisi delle immagini acquisite utilizzando il software Fiji.
- Aprire le immagini con il programma Fiji14.
- Selezionare il comando Dividi canali tramite il menu a discesa Immagine e colore.
NOTA: mantenere l'immagine del canale verde. - Usate lo strumento di selezione a mano libera per impostare manualmente l'area di interesse fluorescente (ROI; ad esempio, testa).
- Aggiungere il ROI in Gestione ROI tramite il menu a discesa Analizza e strumenti.
- Sottrarre lo sfondo al 50% selezionando Elabora e Sottrai sfondo.
- Impostare e applicare i valori di soglia tramite il comando di menu Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Soglia. Mantenere e impostare gli stessi valori di soglia durante l'analisi dell'immagine dell'intero esperimento.
- Selezionare il roI rispettivo da Gestione ROI.
- Analizzare il numero di aggregati di proteine utilizzando il comando di menu Analizza e analizza particelle.
- Ripetere i passaggi da 3,5 a 3,12 per ogni immagine acquisita.
- Copiare i valori di visualizzazione dalla finestra Risultati separata.
- Incollare/importare e analizzare i risultati utilizzando un pacchetto software.
4. Segnalare l'analisi statistica
- Utilizzare almeno 30 nematodi per ogni condizione sperimentale. Eseguire tre repliche biologiche.
- Utilizzare un software di analisi statistica per eseguire il test t-studentesco (confronto tra due gruppi) o ANOVA (confronto tra più gruppi) per l'analisi statistica con p < 0,05 come significativo.
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Representative Results
Indotta dalla morte delle cellule necrotiche dai canali ionici iperattivi
Utilizzando le procedure qui presentate, gli embrioni mutanti mec-4(u231) e deg-3u662) sono stati incubati per 25 min a 34 gradi centigradi o mantenuti alla temperatura standard di 20 gradi centigradi. Alla schiusa, il numero di cadaveri di cellule neuronali è stato determinato nella fase larvale L1 di entrambi i gruppi. La morte delle cellule necrotiche è diminuita nei nematodi che si schiudono dalle uova precondizionate dallo shock termico (Figura 1A-1B).
Neurodegenerazione indotta dall'aggregazione proteica
Nematodi transgenici che sovraesprimono (A) gFP di zinucleina e citoplasmico umano nei neuroni dopaminergici e (B) la proteina poliglutamina umana (PolyQ) fusa con YFP pan-neuronalmente, sono stati esposti ogni giorno per 30 min a 34 gradi centigradi. Il precondizionamento degli urti di calore favorisce la neuroprotezione contro la morte cellulare indotta da synucleina negli ermafroditi adulti di 7 giorni (Figura 2A) e diminuisce gli aggregati di proteine Q40::YFP nella regione di testa degli adulti di 4 giorni(Figura 2B e Figura 3).
Figura 1: Necrosi ioattiva indotta dal canale ionico. (A) Immagine di microscopia DIC rappresentativa della larva mec-4(u231) L1, con punte di freccia che indicano vacuoli necrotici caratteristici. Nella fase iniziale della neurodegenerazione i nuclei gonfi vengono visualizzati all'interno delle cellule. L'immagine è stata acquisita utilizzando un obiettivo di obiezione 40x. Barra della scala, 20 m. (B) Numero di cadaveri di cellule neuronali nella fase larvale L1 dello sviluppo, per 100 animali che trasportano gli alleli neurotossici mec-4(u231) o deg-3(u662). La morte necrotica delle cellule è soppressa nelle larve L1 covate da uova precondizionate rispetto alle controparti non trattate (n. 100 animali per genotipo e saggio; I dati rappresentano la media "S.E.M.","P<0.001" per non trattata rispetto a precondizionata; t-test) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: il precondizionamento giornaliero a 34 gradi centigradi conferisce neuroprotezione contro la siccianona e diminuisce gli aggregati di poliQ in C. elegans. (- Sopravvivenzadei neuroni dopaminergici anteriori (CEP e ADE) in nematodi non trattati e precondizionati che co-esprimono gFP citoplasmico insieme alla gFP umana. I nematodi precondizionati mostrano una maggiore neuroprotezione rispetto a quelli non trattati. I resti di corpi cellulari neuronali (asterischi) e perline assonali (punte di freccia) sono visti in nematodi non trattati (pannello superiore). Sia il soma (asterischi) che i processi neuronali (punte di freccia) sono conservati durante il precondizionamento. Immagini acquisite utilizzando un obiettivo di obiezione 20x e raffigurano la massima intensità z-proiezione. Dettagli di acquisizione: Luminoso, 0.15. Barra della scala, 20 m. I vermi sono stati segnati per la sopravvivenza neuronale dei neuroni dopaminergici anteriori il settimo giorno di età adulta. (B) Aggregati in poliQ neuronali rilevati il quarto giorno di età adulta nella regione tesa di nematodi transgenici non trattati e precondizionati. I vermi transgenici precondizionati presentano aggregati Q40::YFP meno neuronali rispetto a quelli non trattati. Le immagini rappresentative della regione della testa sono mostrate con punte di freccia che indicano aggregati di proteine poliQ nelle cellule neuronali. Immagini acquisite utilizzando un obiettivo di obiezione 20x e raffigurano la massima intensità z-proiezione. Dettagli di acquisizione: Luminoso, 0.0175. Barra della scala, 20 m. 30-35 animali sono stati quantificati per condizione in ciascuno dei tre esperimenti indipendenti. I dati rappresentano il valore di "S.E.M.", "P < 0.05" e "non accoppiato". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi delle immagini tramite il software Fiji. 1. Aprire un'immagine acquisita con il software Fiji; 2. Seleziona il comando "Dividi canale" tramite il menu a discesa "Immagine" e "Colore" per convertire l'immagine; 3, 4. Mantenere l'immagine "canale verde" e utilizzando lo strumento "selezione a mano libera", avvolgere la regione fluorescente di interesse (ROI; ad esempio, testa). Aggiungere il ROI in "ROI Manager" tramite il menu a discesa "Analizza" e "Strumenti"; 5, 6. Sottrarre lo sfondo al 50% selezionando "Elabora" e "Sottrai sfondo"; 7, 8. Impostare e applicare i valori di soglia tramite il comando di menu "Immagine", "Regola" e "Soglia"; 9. Selezionare il ROI dal "ROI Manager"; 10-12. Analizzare il numero di aggregati proteici utilizzando il comando di menu "Analizza" e "Analizza particelle". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | Ricetta | |
| 2% pastiglie di agarose | 1. Pesare 0,5 g di agarose in un bicchiere di vetro cilindrico. | |
| 2. Aggiungere 25 mL di buffer M9. | ||
| 3. Riscaldare in un forno a microonde fino a quando non si avvicina all'ebollizione. Togliere, mescolare con una punta di pipetta e far bollire di nuovo. Ripetere fino a quando l'agarose non viene sciolta. | ||
| 4. Posizionare un vetrino vuoto al microscopio sul banco. | ||
| 5. Mettere una goccia (50 l) di soluzione fresca 2% agarose al centro della diapositiva. | ||
| 6. Prendere un secondo vetrino del microscopio e posizionarlo sopra la goccia di agarose. Premere delicatamente verso il basso per appiattire la goccia. | ||
| 7. Lasciare indurire l'agarose per 30 secondi e rimuovere delicatamente il vetrino superiore del microscopio. | ||
| 8. Procedere immediatamente con la preparazione del campione, poiché le pastiglie di agarose inizieranno ad asciugarsi entro circa 5 minuti. | ||
| Suggerimento: Lasciare il vetrino superiore del microscopio come copertura per preservare l'umidità più a lungo (1 ora). Così, diversi cuscinetti di agarose possono essere preparati e utilizzati rapidamente durante gli esperimenti. | ||
| Buffer M9 | 1. Sciogliere 3 g di KH2PO4, 6 g di Na2HPO4, 5 g di NaCl in 1 L di acqua distillata e autoclave. | |
| 2. Lasciar raffreddare e aggiungere 1 mL di 1 M MgSO4 (sterile). | ||
| 3. Memorizzare il buffer M9 a 4 gradi centigradi. | ||
| Piastre di agar di Nematode | 1. Mescolare 3 g di NaCl, 2,5 g di bactopeptone, 0,2 g di streptomicina, 17 g di agar e aggiungere 900 mL di acqua distillata. Autoclave. | |
| 2. Lasciar raffreddare a 55-60 gradi centigradi. | ||
| 3. Aggiungere 1 mL di soluzione stock di colesterolo, 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di soluzione di stock di nystatin, 25 mL di sterile 1 M fosfato tampone, pH 6.0, e distillata acqua sterile fino a 1 L. | ||
| 4. Pipette 10 mL di media per piatto Petri e lasciare solidificarsi. | ||
| 5. Conservare le piastre a 4 gradi centigradi fino a quando non vengono utilizzati. | ||
Tabella 1: Ricette consigliate per i reagenti utilizzati. Tutte le ricette reagenti utilizzate nel protocollo presentato sono descritte qui.
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Discussion
Qui, introduciamo e descriviamo metodologie ampiamente accessibili per la crescita, la sincronizzazione e l'esame microscopico di alcuni modelli versatili di C. elegans che studiano la neurodegenerazione dipendente dall'età. In particolare, valutiamo e seleviamo le basi cellulari e molecolari della ripartizione neuronale legata all'età utilizzando necrosi ionica indotta dal canale iperattivato e neurotossicità indotta da proteine1,2,3,4,5,7,9,10,11.
Anche se le procedure descritte per la valutazione della morte delle cellule in vivo sono semplici e possono essere facilmente eseguite in qualsiasi laboratorio, ci sono alcuni passaggi critici che dovrebbero essere presi in considerazione. Restrizione calorica e fame sono noti per indurre più vie di stress, come l'autofagia, che potrebbero interferire con la neurodegenerazione o l'accumulo di proteine aggregati13,15,16. Pertanto, dovrebbero essere utilizzati nematodi ben nutriti e non affamati. Il precondizionamento dell'ammortizzatore di calore conferisce neuroprotezione contro diversi stimoli neurodegenerativi e viene utilizzato come modulatore di morte cellulare stabilito11,13. Tuttavia, alcuni mutanti sono sensibili all'esposizione ad alte temperature per lunghi periodi. Pertanto, la fase di sviluppo appropriata, l'età e la durata del precondizionamento dell'ammortizzatore termico dovrebbero essere determinate sperimentalmente ogni volta, quando vengono utilizzati animali di diversa estrazione genetica, che potrebbero essere sensibili alle alte temperature. Un aumento graduale dell'autofluorescenza intestinale nematode si osserva durante l'invecchiamento. Pertanto, i corpi e i processi delle cellule neuronali vicine all'area intestinale dovrebbero essere evitati durante il processo di imaging del ceppo AM101. Concentrarsi sulle cellule neuronali, che si trovano nella regione della testa e/o della coda per bypassare l'autofluorescenza derivata dall'intestino. Utilizzare il buffer M9 invece dell'acqua per generare tamponi M9/levamisome e 2% cuscinetti agarose. M9 buffer garantire un ambiente osmotico favorevole proteggendo i nematodi da essiccazione in tutta la visualizzazione microscopica e l'analisi.
Le metodologie descritte sottolineano che la combinazione di modelli di neurodegenerazione dei nematodi, insieme a schermi genetici e farmacologici per modulatori di morte cellulare, potrebbe portare a una comprensione senza precedenti del compromissione associata all'età dei circuiti neuronali e stimolare lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici contro i disturbi neurodegenerativi che promuovono la salute umana e la qualità della vita.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Chaniotakis M. e Kounakis K. per la registrazione video e l'editing. K.P. è finanziato da una sovvenzione della Fondazione ellenica per la ricerca e l'innovazione (HFRI) e del Segretariato generale per la ricerca e la tecnologia (GSRT). N.T. è finanziata da sovvenzioni del Consiglio europeo della ricerca (CER – GA695190 – MANNA), dei programmi quadro della Commissione europea e del Ministero greco dell'istruzione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
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