Summary
Hier führen wir weithin zugängliche Methoden mit einigen vielseitigen Nematodenmodellen ein, einschließlich hyperaktivierter Ionenkanal-induzierter Nekrose und Protein-Aggregat-induzierter Neurotoxizität, um die zellulären und molekularen Grundlagen altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen zu überwachen und zu sezieren.
Abstract
Die Bekämpfung menschlicher neurodegenerativer Pathologien und die Bewältigung ihrer allgegenwärtigen sozioökonomischen Auswirkungen werden zu einer globalen Priorität. Ungeachtet ihrer nachteiligen Auswirkungen auf die Lebensqualität des Menschen und das Gesundheitssystem ist die Mehrheit der neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen nach wie vor unheilbar und nicht vermeidbar. Daher wird die Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen gegen solche Krankheiten zu einer dringenden Dringlichkeit. Die altersassoziierte Verschlechterung der neuronalen Schaltkreise und -funktion wird in so unterschiedlichen Organismen wie dem niederschwelligen Wurm Caenorhabditis elegans und dem Menschen evolutionär konserviert, was Ähnlichkeiten in den zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen bedeutet. C. elegans ist ein hochformbares genetisches Modell, das ein gut charakterisiertes Nervensystem, Körpertransparenz und ein vielfältiges Repertoire an genetischen und bildgebenden Verfahren zur Beurteilung der neuronalen Aktivität und Qualitätskontrolle während des Alterns bietet. Hier führen wir Methoden mit einigen vielseitigen Nematodenmodellen ein, einschließlich hyperaktivierter Ionenkanal-induzierter Nekrose (z. B. deg-3(d) und mec-4(d)) und Proteinaggregat (z. B. Syunclein und Polyglutamat)-induzierte Neurotoxizität, um die zelluläre und molekulare Untermauerung altersbedingter Neuronenzugung zu überwachen und zu sezieren. Eine Kombination dieser Tier-Neurodegeneration-Modelle, zusammen mit genetischen und pharmakologischen Screens für Zelltodmodulatoren, wird zu einem beispiellosen Verständnis des altersbedingten Abbaus der neuronalen Funktion führen und kritische Einblicke mit breiter Relevanz für die menschliche Gesundheit und Lebensqualität liefern.
Introduction
In den letzten zwei Jahrzehnten wurde C. elegans weithin als Modellorganismus verwendet, um die molekularen Mechanismen des nekrotischen Zellsterbens zu untersuchen. C. elegans bietet ein außergewöhnlich gut charakterisiertes und kartiertes Nervensystem, eine transparente Körperstruktur und ein vielfältiges Repertoire an genetischen und bildgebenden Methoden zur Überwachung der in vivo zellulären Funktion und des Überlebens während des gesamten Alterns. So wurden bereits mehrere genetische Modelle von C. elegans der Neurodegeneration entwickelt, um die neuronale Lebensfähigkeit zu bewerten. Insbesondere sind gut beschriebene und verwendete Nematodenmodelle die hyperaktive Ionenkanal-induzierte Nekrose1,2,3 und der Zelltod, ausgelöst durch erhöhte Proteinaggregation4,5,6,7,8,9,10 und Hitzehub11,12, unter anderem.
Die kurzfristige Exposition gegenüber subtödlichen Temperaturen führte zu einer Resistenz gegen den nekrotischen Zelltod, ausgelöst durch einen anschließenden Hitzestress sowohl bei Nematoden als auch bei Säugetierneuronen11. Interessanterweise schützt die tägliche Vorkonditionierung von Nematoden bei einer milden erhöhten Temperatur vor Neurodegeneration, die durch verschiedene Reize wie ionisches Ungleichgewicht (z.B. mec-4(u231) und/oder deg-3(u662)) und Proteinaggregation (z.B. Synuclein und PolyQ40)11,13verursacht wird.
Hier beschreiben wir vielseitige Methoden, mit denen C. elegans verwendet wird, um die altersabhängige Neurodegeneration in etablierten Modellen menschlicher Krankheiten zu überwachen und zu bewerten, wie z. B. exzitotoxizitätsgesteuerter Zelltod, Parkinson und Huntington. Darüber hinaus unterstreichen wir die neuroprotektive Rolle der Wärmevorkonditionierung in mehreren Modellen der Neurodegeneration. Eine Kombination dieser Techniken zusammen mit genetischen und/oder pharmakologischen Screens wird zur Identifizierung und Charakterisierung neuartiger Zelltodmodulatoren mit potenziellem therapeutischem Interesse führen.
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Protocol
1. Nekrotische Zelltod-induziert durch hyperaktive Ionenkanäle
HINWEIS: Gain-of-Funktionsmutationen in der Genfamilie von Degenerinen, einschließlich mec-4 und deg-3 unter anderem, führt zur Erzeugung von hyperaktiven Ionenkanälen, die den nekrotischen Zelltod von sechs Für die Mechanosensation bei Würmern erforderlichen Mürrezeptorneuronen auslösen3. Nekrose, die durch die aberrante Stimulation von Degenerinen induziert wird, weist mehrere mechanistische und morphologische Ähnlichkeiten mit der Exzitotoxizität bei Säugetieren auf. Die Aufrechterhaltung des Energiestoffwechsels und der Kalziumhomöostase spielt eine entscheidende Rolle für das neuronale Überleben während der Nekrose11. Die folgenden Stämme können verwendet werden, um den nekrotischen Zelltod zu überwachen, der durch hyperaktive Ionenkanäle, mec-4(u231)X und deg-3(u662)Vausgelöst wird.
- Wartung, Synchronisation und Vorbereitung mutierter Würmer zur Untersuchung des nekrotischen Zelltodes
- Tag 1: L4-Larven von mec-4(u231) oder deg-3(u662) mutierten Nematoden auf Nematode Growth Media (NGM; Tabelle 1) Platten, die mit Escherichia coli (OP50) mit einem sezierenden Stereomikroskop gesät wurden.
- 10 L4 Nematoden pro gesäter NGM-Platte platzieren und bei der Standardtemperatur von 20 °C anbauen.
- Tag 5: Waschen Sie die Platten mit 1 ml M9 Puffer (Tabelle 1) und sammeln Sie die Tiere in einem 1,5 ml Rohr.
- Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 s und entfernen Sie den Überstand.
- Fügen Sie 0,5 ml Bleichlösung (7 mlH2O, 1 ml 5 N NaOH und 2 ml Bleichmittel) hinzu.
ANMERKUNG: Bleichlösung verliert allmählich ihre Effizienz; daher sollte es täglich vorbereitet werden. - Wirbel und überwachen regelmäßig, bis sich die Würmer aufgelöst haben.
HINWEIS: Vermeiden Sie Bleichen für Zeiträume von mehr als 5 min, da die Lebensfähigkeit der Embryonen beeinträchtigt wird. - Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 s und entfernen Sie den Überstand.
- Zweimal das Pellet (Eier) mit 1 ml M9-Puffer waschen.
- Nach dem Waschen die Eier in 200 l M9-Puffer wieder aufhängen und 25 min bei 34 °C in einem Wasserbad bebrüten.
- Bewahren Sie eine separate Gruppe von Kontrollproben (Eier) bei 20 °C auf.
- Pipette 100 l Kontroll- oder Hitzeschock-behandelte Eier und legen Sie sie auf nicht gesäte NGM-Platten. Jeder Teller enthält mindestens 100-200 Eier.
- Die Eier bei 20 °C bis zum Schlüpfen inkubiert.
- Montage von L1-Larven zur Untersuchung mit Differentialinterferenzkontrast (DIC; Nomarsky) Mikroskopie
- Bereiten Sie 2% Agarose-Pads vor.
- Verwenden Sie 1 ml M9-Puffer, um die Platten zu waschen und L1-Larvennematoden in 1,5 ml Rohren zu sammeln.
- Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 s.
- Entfernen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet (Nematoden).
- Fügen Sie 100 l von 20 mM M9/Levamisol-Puffer hinzu, um die Nematoden zu anästhesieren.
HINWEIS: Vermeiden Sie Natriumazid als Anästhetikum. Natriumazid löst mitochondriale Schäden und oxidativen Stress aus, was schließlich zur Zelltodinduktion führt - Pipette 10 l M9/Levamisol-Puffer mit L1-Würmern und montieren sie auf 2% Agarose-Pads (Tabelle 1).
- Legen Sie vorsichtig einen Coverslip auf die Oberseite der Probe.
HINWEIS: Versiegeln Sie den Deckelschlupf mit Nagellack, um die Feuchtigkeit während des gesamten Bildgebungsprozesses zu erhalten. - Beobachten Sie Würmer mit differenziellem Interferenzkontrast (DIC; Nomarsky) Mikroskopie.
- Score Neurodegeneration der sechs Touch-Rezeptor-Neuronen durch Zählen von Zellen mit dem charakteristischen vakuolierten Aussehen pro Nematode.
2. Protein-Aggregat-induzierte Neurodegeneration
ANMERKUNG: Die folgenden Stämme können verwendet werden, um Proteinaggregate-induzierte Neurotoxizität zu untersuchen: (A) Überexpression von humanem UA44: Ist[baIn1; pdat-1-syn, pdat-1GFP] und (B) Überexpression des menschlichen Polyglutaminproteins (PolyQ) pan-neuronal, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
- Wartung, Synchronisation und Vorbereitung transgener Nematoden für Neurodegeneration assay
- Verwenden Sie ein sezierendes Stereomikroskop, um die Entwicklung und das Wachstum von C. elegans zu überwachen.
- Tag 1: Synchronisieren Sie die Population transgener Nematoden, indem Sie 15-20 L4-Larven jeder Sorte auf frisch OP50-saatierte NGM-Platten pflücken und übertragen.
HINWEIS: Verwenden Sie mindestens drei Platten pro Sorte pro Bedingung. - Inkubieren und lassen Sie die Nematoden bei der Standardtemperatur von 20 °C wachsen.
- Tag 2: Führen Sie die tägliche Vorkonditionierung für 30 Minuten durch Übertragung der Platten in einem Inkubator auf 34 °C. Dann kehren Sie die vorbedingungenmäßigen Nematoden bei der Standardtemperatur von 20 °C zurück.
HINWEIS: Verschiedene genetische Hintergründe können empfindlich auf hohe Temperaturen für längere Zeit Exposition. - (A) Bei der Untersuchung der Überexpression von humanem Synuclein in dopaminergen Neuronen, UA44: Ist[baIn1; pdat-1-syn, pdat-1GFP]: am Tag 9 7 Tage alte transgene Nematoden für den dopaminergen neuronalen Zelltod überwachen.
- (B) Bei der Untersuchung der Überexpression von humanem Polyglutaminprotein (PolyQ) panneuronal, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: messen Sie an Tag 5 neuronale PolyQ-Aggregate im Kopfbereich von 4 Tage alten transgenen Tieren, die Q40::YFP exdrücken.
- Montage der Proben für die mikroskopische Untersuchung
- Bereiten Sie 2% Agarose Pads (Tabelle 1).
- Fügen Sie in der Mitte des Agarose-Pads 10 l von 20 mM M9/Levamisol-Pufferabfall hinzu.
- Wählen Sie die jeweiligen transgenen Nematoden und übertragen Sie sie in einem M9/Levamisol-Tropfen.
HINWEIS: Platzieren Sie 20-30 Nematoden pro Tropfen. - Legen Sie vorsichtig einen Coverslip auf die Oberseite der Probe.
HINWEIS: Versiegeln Sie den Deckelschlupf mit Nagellack, um die Feuchtigkeit während des gesamten Bildgebungsprozesses zu erhalten. - Fahren Sie mit der mikroskopischen Untersuchung der jeweiligen Proben fort.
- Erfassungsprozess und Datenanalyse von transgenen Nematoden, die in dopaminergen Neuronen mit-Synuclein und zytosolic GFP exzessieren
- Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop in Kombination mit einer Kamera (z. B. EVOS FL Auto 2).
- Erkennen und erfassen Sie Z-Stack-Bilder des Kopfbereichs bei 20-facher Vergrößerung.
- Speichern und sammeln Sie die maximale Intensität Projektionsbilder.
- Fahren Sie mit der Analyse der erfassten Bilder fort.
- Untersuchen Sie die transgenen Würmer für die Neurodegeneration, indem Sie die folgenden zellulären Merkmale, (i) Denkodivenverlust von Neuronen, die GFP unter dem Promotor von dat-1, (ii) Neuronen zeigen, die Soma und/oder axonale Blebbing, Auswüchse oder dendritischen Verlust aufweisen, bewertet.
- Importieren und Analysieren der Daten mithilfe eines Softwarepakets (z. B. Excel).
3. Erfassungsprozess und Datenanalyse von transgenen Nematoden, die panneuronal PolyQ40 mit YFP verschmolzen
- Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop in Kombination mit einer Kamera (z. B. EVOS FL Auto 2).
- Erkennen und erfassen Sie Z-Stack-Bilder des Kopfbereichs bei 20-facher Vergrößerung.
- Speichern und sammeln Sie die maximale Intensität Projektionsbilder.
- Fahren Sie mit der Analyse der erfassten Bilder fort, indem Sie Die Fidschi-Software verwenden.
- Öffnen Sie Bilder mit Fidschi-Programm14.
- Wählen Sie den Befehl Kanäle teilen über das Dropdown-Menü Bild und Farbe aus.
HINWEIS: Behalten Sie das Grüne Kanalbild bei. - Verwenden Sie das Freihandauswahltool, um den fluoreszierenden Bereich manuell einzustellen (ROI; z.B. Kopf).
- Fügen Sie den jeweiligen ROI im ROI Manager über das Dropdown-Menü Analysieren und Tools hinzu.
- Subtrahieren Sie den Hintergrund auf 50 %, indem Sie Prozess und Hintergrund subtrahierenauswählen.
- Festlegen und Anwenden von Schwellenwerten über den Menübefehl Bild | Anpassen | Schwellenwert. Behalten Sie die gleichen Schwellenwerte während der gesamten Bildanalyse des gesamten Experiments bei und legen Sie sie fest.
- Wählen Sie den jeweiligen ROI aus dem ROI Manageraus.
- Analysieren Sie die Anzahl der Proteinaggregate mithilfe des Menübefehls Partikel analysieren und analysieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.12 für jedes aufgenommene Bild.
- Kopieren Sie die Anzeigewerte aus dem separaten Ergebnisfenster.
- Fügen Sie die Ergebnisse ein/importieren und analysieren Sie sie mithilfe eines Softwarepakets.
4. Statistische Auswertung melden
- Verwenden Sie mindestens 30 Nematoden für jede experimentelle Erkrankung. Führen Sie drei biologische Replikationen durch.
- Verwenden Sie statistische Analysesoftware, um entweder Studenten-t-Test(Vergleich zwischen zwei Gruppen) oder ANOVA (Vergleich zwischen mehreren Gruppen) für statistische Analysen mit p < 0,05 als signifikant durchzuführen.
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Representative Results
Nekrotische Zelltod-induziert durch hyperaktive Ionenkanäle
Mit den hier vorgestellten Verfahren wurden mec-4(u231) und deg-3u662) mutierte Embryonen entweder 25 min bei 34 °C inkubiert oder bei der Standardtemperatur von 20 °C gehalten. Beim Schlüpfen wurde die Anzahl der neuronalen Zellleichen im L1-Larvenstadium beider Gruppen bestimmt. Nekrotische Zelltod wird in Nematoden, die aus Hitzeschock vorkonditionierte Eier geschlüpft vermindert(Abbildung 1A-1B).
Proteinaggregat-induzierte Neurodegeneration
Transgene Nematoden, die in dopaminergen Neuronen und (B) humanem Polyglutaminprotein (PolyQ), das mit YFP panneuronal verschmolzen ist, mit YFP pan-neuronal verschmolzen sind, wurden täglich für 30 min bei 34 °C exponiert. Die Vorbedingung für Hitzeschocks fördert den Neuroprotektionsschutz gegen den bei 7-Tage-alten erwachsenen Hermaphroditen durch Diessynuclein-induzierten Zelltod (Abbildung 2A) und verringert Q40::YFP-Proteinaggregate im Kopfbereich von 4 Tage alten Erwachsenen (Abbildung 2B und Abbildung 3).
Abbildung 1: Hyperaktive Ionenkanal-induzierte Nekrose. (A) Repräsentatives DIC-Mikroskopiebild von mec-4(u231) L1 Larve, wobei Pfeilspitzen charakteristische nekrotische Vakuole anzeigen. Im frühen Stadium der Neurodegeneration werden geschwollene Kerne in den Zellen angezeigt. Das Bild wurde mit einer 40-fachen Einspruchslinse aufgenommen. Schuppenstange, 20 m. (B) Anzahl der neuronalen Zellleichen im L1-Larvenstadium der Entwicklung, je 100 Tiere, die die neurotoxischen Mec-4(u231) oder Deg-3(u662) Allele tragen. Der nekrotische Zelltod wird in L1-Larven unterdrückt, die aus vorkonditionierten Eiern geschlüpft sind, im Vergleich zu unbehandelten Gegenstücken (n= 100 Tiere pro Genotyp und Assay; Die Daten entsprechen dem Mittelwert von S.E.M., ***P< 0,001 für unbehandelt e.V. t-test) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die tägliche Vorkonditionierung bei 34 °C verleiht einen Neuroprotektionsschutz gegen das Synuclein und verringert PolyQ-Aggregate in C. elegans. ()Überleben von vorderen dopaminergen Neuronen (CEPs und ADEs) in unbehandelten und vorkonditionierten Nematoden, die zytoplasmatischeGFP zusammen mit dem menschlichen Synuclein mitdrücken. Vorkonditionierte Nematoden zeigen einen verbesserten Neuroprotektion im Vergleich zu unbehandelt. Reste von neuronalen Zellkörpern (Sternchen) und axonalen Perlen (Pfeilspitzen) sind in unbehandelten Nematoden (obere Platte) zu sehen. Sowohl Soma (Sternchen) als auch neuronale Prozesse (Pfeilspitzen) bleiben bei der Vorbedingung erhalten. Bilder, die mit einer 20-fachen Einwandlinse aufgenommen wurden und die maximale Intensität der Z-Projektion darstellen. Akquisitionsdetails: Bright, 0.15. Schuppenstange, 20 m. Würmer wurden für das neuronale Überleben der vorderen dopaminergen Neuronen am siebten Tag des Erwachsenenalters bewertet. (B) Neuronale PolyQ-Aggregate, die am vierten Tag des Erwachsenenalters im Kopfbereich unbehandelter und vorkonditionierter transgener Nematoden nachgewiesen wurden. Vorkonditionierte transgene Würmer präsentieren weniger neuronale Q40::YFP-Aggregate im Vergleich zu unbehandelten. Repräsentative Bilder des Kopfbereichs werden mit Pfeilspitzen dargestellt, die polyQ-Proteinaggregate in neuronalen Zellen anzeigen. Bilder, die mit einer 20-fachen Einwandlinse aufgenommen wurden und die maximale Intensität der Z-Projektion darstellen. Akquisitionsdetails: Bright, 0.0175. Schuppenstange, 20 m. 30-35 Tiere wurden pro Zustand in jedem der drei unabhängigen Experimente quantifiziert. Die Daten entsprechen dem Mittelwert s.E.M., ***P < 0,05, ungepaartert-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bildanalyse mit Fidschi-Software. 1. Öffnen Sie ein erworbenes Bild mit Fidschi-Software; 2. Wählen Sie "Split Channel" Befehl über die Dropdown-Menü "Bild" und "Farbe", um das Bild zu konvertieren; 3, 4. Halten Sie das "grüne Kanal"-Bild und umschließen Sie mit dem Werkzeug "Freihandauswahl" den fluoreszierenden Bereich von Interesse (ROI; z.B. Kopf). Fügen Sie den jeweiligen ROI im Dropdown-Menü "ROI Manager" über das Dropdown-Menü "Analyze" und "Tools" hinzu; 5, 6. Subtrahieren Sie den Hintergrund auf 50 %, indem Sie "Prozess" und "Hintergrund subtrahieren" auswählen; 7, 8. Einrichten und Anwenden von Schwellenwerten über den Menübefehl "Bild", "Anpassen" und "Schwellenwert"; 9. Wählen Sie den jeweiligen ROI aus dem "ROI Manager"; 10-12. Analysieren Sie die Anzahl der Proteinaggregate mit dem Menübefehl "Analyze" und "Analyze Particles". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reagenz | Rezept | |
| 2% Agarose Pads | 1. Wiegen Sie 0,5 g Agarose in einem zylindrischen Glasbecher. | |
| 2. Fügen Sie 25 ml M9-Puffer hinzu. | ||
| 3. Erhitzen Sie in einer Mikrowelle, bis sie kurz vor dem Kochen ist. Herausnehmen, mit einer Pipettenspitze rühren und wieder kochen. Wiederholen Sie dies, bis die Agarose aufgelöst ist. | ||
| 4. Legen Sie einen leeren Mikroskopschlitten auf die Bank. | ||
| 5. Legen Sie einen Tropfen (ca. 50 l) frischer 2% Agarose-Lösung in die Mitte des Schlittens. | ||
| 6. Nehmen Sie ein zweites Mikroskop-Dia und legen Sie es auf den Agarose-Tropfen. Drücken Sie vorsichtig nach unten, um den Tropfen abzuflachen. | ||
| 7. Lassen Sie die Agarose 30 Sekunden lang aushärten und entfernen Sie das obere Mikroskop vorsichtig. | ||
| 8. Gehen Sie sofort mit der Probenvorbereitung fort, da die Agarose-Pads innerhalb von ca. 5 Minuten zu trocknen beginnen. | ||
| Tipp: Lassen Sie das obere Mikroskopschlitten als Abdeckung, um die Feuchtigkeit länger zu erhalten (ca. 1 Stunde). So können mehrere Agarose-Pads während der Experimente schnell vorbereitet und eingesetzt werden. | ||
| M9-Puffer | 1. 3 g KH2PO4,6 g Na2HPO4,5 g NaCl in 1 L destilliertem Wasser und Autoklaven auflösen. | |
| 2. Abkühlen lassen und 1 ml 1 M MgSO4 (steril) hinzufügen. | ||
| 3. M9-Puffer bei 4 °C aufbewahren. | ||
| Nematode Wachstumsmedium (NGM) Agarplatten | 1. 3 g NaCl, 2,5 g Bactopepton, 0,2 g Streptomycin, 17 g Agar mischen und 900 ml destilliertes Wasser hinzufügen. Autoklaven. | |
| 2. Auf 55-60 °C abkühlen lassen. | ||
| 3. Fügen Sie 1 ml Cholesterin-Stammlösung, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml Nystatin-Stammlösung, 25 ml sterilen 1 M Phosphatpuffer, pH 6,0 und destilliertes steriles Wasser bis 1 L hinzu. | ||
| 4. Pipette 10 ml Medium pro Petrischale und erstarren lassen. | ||
| 5. Bewahren Sie die Platten bei 4 °C auf, bis sie verwendet werden. | ||
Tabelle 1: Empfohlene Rezepturen für verwendete Reagenzien. Hier werden alle im vorgestellten Protokoll verwendeten Reagenzienrezepturen beschrieben.
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Discussion
Hier stellen wir allgemein zugängliche Methoden für Wachstum, Synchronisation und mikroskopische Untersuchung einiger vielseitiger C. elegans-Modelle zur Untersuchung der altersabhängigen Neurodegeneration vor und beschreiben sie. Insbesondere bewerten und sezieren wir die zellulären und molekularen Grundlagen des altersbedingten neuronalen Abbaus unter Verwendung von hyperaktivierter Ionenkanal-induzierter Nekrose und Protein-Aggregat-induzierter Neurotoxizität1,2,3,4,5,7,9,10,11.
Obwohl die beschriebenen Verfahren zur In-vivo-Zelltodbewertung einfach sind und in jedem Labor leicht durchgeführt werden können, gibt es einige kritische Schritte, die berücksichtigt werden sollten. Kalorische Restriktion und Hunger sind dafür bekannt, mehrere Stresswege zu induzieren, wie Autophagie, die die Neurodegeneration oder Proteinaggregate Akkumulation stören könnte13,15,16. Daher sollten gut gefütterte und nicht ausgehungerte Nematoden verwendet werden. Hitzeschock-Vorbedingung verleiht Neuroprotektion gegen mehrere neurodegenerative Reize und wird als etablierter Zelltodmodulator11,13eingesetzt. Einige Mutanten sind jedoch über lange Zeiträume anfällig für hochtemperaturbelastliche Exposition. Daher sollte das geeignete Entwicklungsstadium, das Alter und die Dauer der Hitzeschock-Vorbedingungen jedes Mal experimentell bestimmt werden, wenn Tiere unterschiedlichen genetischen Hintergrunds verwendet werden, die empfindlich auf hohe Temperaturen reagieren könnten. Eine allmähliche Zunahme der Nematoden-Darm-Autofluoreszenz wird während der Alterung beobachtet. Daher sollten neuronale Zellkörper und Prozesse in der Nähe des Darmbereichs während des Bildgebungsprozesses des AM101-Stamms vermieden werden. Konzentrieren Sie sich auf neuronale Zellen, die sich im Kopf- und/oder Schwanzbereich befinden, um die durch den Darm abgeleitete Autofluoreszenz zu umgehen. Verwenden Sie M9-Puffer anstelle von Wasser, um M9/Levamisome-Puffer und 2% Agarose-Pads zu erzeugen. M9-Puffer sorgen für eine günstige osmotische Umgebung, die die Nematoden vor dem Austrocknen während der mikroskopischen Visualisierung und Analyse schützt.
Die beschriebenen Methoden unterstreichen, dass die Kombination von Nematodenmodellen der Neurodegeneration zusammen mit genetischen und pharmakologischen Screens für Zelltodmodulatoren zu einem beispiellosen Verständnis der altersbedingten Beeinträchtigung neuronaler Schaltkreise führen und die Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen gegen neurodegenerative Störungen zur Förderung der menschlichen Gesundheit und Lebensqualität fördern könnte.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Chaniotakis M. und Kounakis K. für die Videoaufnahme und -bearbeitung. K.P. wird durch ein Stipendium der Hellenischen Stiftung für Forschung und Innovation (HFRI) und des Generalsekretariats für Forschung und Technologie (GSRT) finanziert. N.T. wird durch Zuschüsse des Europäischen Forschungsrats (ERC – GA695190 – MANNA), der Rahmenprogramme der Europäischen Kommission und des griechischen Bildungsministeriums finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
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