Summary
Här introducerar och beskriver vi allmänt tillgängliga metoder som använder några mångsidiga nematodmodeller, inklusive hyperaktiverad jonkanalinducerad nekros och proteinaggregerad neurotoxicitet, för att övervaka och dissekera de cellulära och molekylära underbyggnaderna av ålderssasocierade neurodegenerativa sjukdomar.
Abstract
Att bekämpa mänskliga neurodegenerativa patologier och hantera deras genomgripande socioekonomiska effekter håller på att bli en global prioritet. Trots deras skadliga effekter på människors livskvalitet och hälso- och sjukvårdssystemet är majoriteten av de mänskliga neurodegenerativa sjukdomarna fortfarande obotliga och kan inte förebyggas. Därför blir utvecklingen av nya terapeutiska interventioner mot sådana sjukdomar en brådskande brådska. Åldersassocierad försämring av neuronala kretsar och funktion är evolutionärt bevaras i organismer så olika som den ringa masken Caenorhabditis elegans och människor, vilket innebär likheter i de underliggande cellulära och molekylära mekanismer. C. elegans är en mycket formbar genetisk modell, som erbjuder ett väl karakteriserat nervsystem, kroppstransparens och en mångsidig repertoar av genetiska och bildframställningstekniker för att bedöma neuronal aktivitet och kvalitetskontroll under åldrandet. Här introducerar och beskriver vi metoder som använder några mångsidiga nematodmodeller, inklusive hyperaktiverad jonkanalinducerad nekros (t.ex. deg-3(d) och mec-4(d)) och proteinaggregat (t.ex. α-syunclein och polyglutamat)-inducerad neurotoxicitet, för att övervaka och dissekera den cellulära och cellulära underbyggnad av åldersrelaterad neuronal nedbrytning. En kombination av dessa djurneurindegenerationsmodeller, tillsammans med genetiska och farmakologiska skärmar för celldödsmodulatorer, kommer att leda till en aldrig tidigare skådad förståelse av åldersrelaterad nedbrytning av neuronal funktion och kommer att ge kritiska insikter med bred relevans för människors hälsa och livskvalitet.
Introduction
Under de senaste två decennierna har C. elegans använts i stor utsträckning som en modell organism för att undersöka de molekylära mekanismerna för nekrotisk celldöd. C. elegans erbjuder ett exceptionellt väl karakteriserat och kartlagt nervsystem, transparent kroppsstruktur och en mångsidig repertoar av genetiska metoder och avbildningsmetoder för att övervaka in vivo cellulär funktion och överlevnad under hela åldrandet. Således har flera C. elegans genetiska modeller av neurodegeneration redan utvecklats för att bedöma neuronal lönsamhet. I synnerhet, väl beskrivna och används nematod modeller inkluderar hyperaktiv jon kanal-inducerad nekros1,2,3 och celldöd utlöses av ökad protein aggregering4,5,6,77,8,9,10 och värmeslag11,12, bland andra.
Kortvarig exponering för sub-dödliga temperaturer gav resistens mot nekrotisk celldöd, utlöses av en efterföljande värmestress både i nematoder och däggdjursneuron11. Intressant, daglig förkonditionering av nematoder vid en mild förhöjd temperatur skyddar mot neurodegeneration, som orsakas av olika stimuli, såsom jonisk obalans (t.ex. mec-4(u231) och/eller deg-3(u662)) och proteinaggregering (t.ex. α-synuclein och polyQ40)11,13.
Här beskriver vi mångsidiga metoder som använder C. elegans för att övervaka och utvärdera åldersberoende neurodegeneration i väletablerade modeller av mänskliga sjukdomar, såsom excitotoxicitet-utlöst celldöd, Parkinsons och Huntingtons sjukdom. Dessutom understryker vi den nervskyddande roll värmekonditionering i flera modeller av neurodegeneration. En kombination av dessa tekniker tillsammans med genetiska och/eller farmakologiska skärmar kommer att resultera i identifiering och karakterisering av nya celldödsmodulatorer, med potentiellt terapeutiskt intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nekrotisk celldödsinducerad av hyperaktiva jonkanaler
OBS: Gain-of-function mutationer i genfamiljen av degeneriner, inklusive mec-4 och deg-3 bland andra, resulterar i generering av hyperaktiva jonkanaler utlöser nekrotisk cell död av sex touch receptor nervceller som krävs för mekanosensation i maskar3. Nekros framkallas av avvikande stimulering av degenerins visar flera mekanistiska och morfologiska likheter med excitotoxicitet hos däggdjur. Underhåll av energiomsättning och kalcium homeostas har en avgörande roll på neuronal överlevnad under nekros11. Följande stammar kan användas för att övervaka nekrotisk celldöd utlöses av hyperaktiva jonkanaler, mec-4(u231)X och deg-3(u662)V.
- Underhåll, synkronisering och förberedelse av muterade maskar för undersökning av nekrotisk celldöd
- Dag 1: Välj L4 larver av mec-4(u231) eller deg-3(u662) muterade nematoder på Nematod Growth Media (NGM; Tabell 1) plattor sådd med Escherichia coli (OP50) med hjälp av en dissekera stereomicroscope.
- Placera 10 L4 nematoder per sådd NGM-platta och odla dem vid standardtemperaturen på 20 °C.
- Dag 5: Tvätta plattorna med 1 ml M9 buffert (tabell 1) och samla djuren i ett 1,5 ml-rör.
- Centrifugera vid 10 000 x g i 30 s och ta bort supernatanten.
- Tillsätt 0,5 ml blekningslösning (7 ml H2O, 1 ml 5 N NaOH och 2 ml blekmedel).
OBS: Blekning lösning gradvis förlora sin effektivitet; därför bör det förberedas dagligen. - Vortex och övervaka regelbundet tills maskarna har lösts upp.
OBS: Undvik blekning under längre tid än 5 minuter eftersom embryonas livskraft kommer att påverkas. - Centrifugera vid 10 000 x g i 30 s och ta bort supernatanten.
- Tvätta två gånger pelleten (ägg) med 1 ml M9 buffert.
- Efter tvättning, återsuspend äggen i 200 μL M9 buffert och inkubera dem i 25 min vid 34 °C i ett vattenbad.
- Håll en separat grupp kontrollprov (ägg) vid 20 °C.
- Pipettera 100 μL kontroll- eller värmechockbehandlade ägg och placera dem på oseedade NGM-plattor. Varje platta innehåller minst 100-200 ägg.
- Inkuberade äggen vid 20 °C tills kläckningen.
- Montering av L1 larver för undersökning med differentialinterferenskontrast (DIC; Nomarsky) mikroskopi
- Förbered 2% agaros kuddar.
- Använd 1 ml M9 buffert för att tvätta plattorna och samla L1 larver nematoder i 1,5 ml-rör.
- Centrifug på 10.000 x g för 30 s.
- Ta bort supernatanten och behåll pelleten (nematoder).
- Tillsätt 100 μL 20 mM M9/levamisole buffert för att söva nematoderna.
OBS: Undvik natriumazid som bedövningsmedel. Natriumazid utlöser mitokondriell skada och oxidativ stress som så småningom leder till celldödsinduktion - Pipetter 10 μL M9/levamisole buffert som innehåller L1 maskar och montera dem på 2% agaros kuddar (tabell 1).
- Placera försiktigt ett täckslip på provets ovantill.
OBS: Täta täckslipen med nagellack för att bevara luftfuktigheten under hela bildprocessen. - Observera maskar med differentialinterferenskontrast (DIC; Nomarsky) mikroskopi.
- Betyg neurodegeneration av de sex touch receptor nervceller genom att räkna celler med den karakteristiska vakuolated utseende per nematod.
2. Proteinaggregerad neurodegeneration
OBS: Följande stammar kan användas för att undersöka proteinaggregat-inducerad neurotoxicitet: (A) överuttryck av humant α-synuklein i dopaminerga nervceller, UA44: Är[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] och (B) överuttryck av humant polyglutaminprotein (PolyQ) pan-neuronally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
- Underhåll, synkronisering och beredning av transgena nematoder för neurodegenerationsanalys
- Använd ett dissekerande stereomikroskop för att övervaka C. eleganss utveckling och tillväxt.
- Dag 1: Synkronisera populationen av transgena nematoder genom att plocka och överföra 15-20 L4 larver av varje stam på nyligen OP50-seedade NGM plattor.
OBS: Använd minst tre plattor av varje stam per tillstånd. - Inkubera och låt nematoderna växa vid standardtemperaturen på 20 °C.
- Dag 2: Utför daglig förkonditionering i 30 minuter genom att överföra plattorna i en inkubator inställd på 34 °C. Sedan, returnera de förindämda nematod tillbaka vid standardtemperaturen på 20 °C.
OBS: Olika genetiska bakgrunder kan vara känsliga för hög temperatur under lång exponering. - (A)Om man undersöker överuttryck av humant α-synuklein i dopaminerga nervceller, UA44: Är[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: På dag 9, övervaka 7 dagar gamla transgena nematoder för dopaminerg neuronal celldöd.
- (B)Om man undersöker överuttryck av humant polyglutaminprotein (PolyQ) pan-neuronally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: på dag 5, mät neuronala PolyQ-aggregat i huvudregionen av 4 dagar gamla transgena djur som uttrycker Q40::YFP.
- Montering av proverna för mikroskopisk undersökning
- Förbered 2 % agaroskuddar (tabell 1).
- Tillsätt 10 μL 20 mM M9/levamisole buffert droppe i mitten av agaros pad.
- Välj respektive transgena nematoder och överför dem i en M9/levamisole droppe.
OBS: Placera 20-30 nematoder per droppe. - Placera försiktigt ett täckslip på provets ovan.
OBS: Täta täckslipen med nagellack för att bevara luftfuktigheten under hela bildprocessen. - Fortsätt till mikroskopisk undersökning av respektive prov.
- Förvärvsprocess och dataanalys av transgena nematoder som uttrycker α-synuclein och cytosoliskt GFP i dopaminerga nervceller
- Använd ett epifluorescensmikroskop kombinerat med en kamera (t.ex.
- Identifiera och fånga z-stack bilder av huvudet regionen vid 20x förstoring.
- Spara och samla in projektionsbilder med maximal intensitet.
- Fortsätt till analysen av de förvärvade bilderna.
- Undersök de transgena maskarna för neurodegeneration genom att göra poäng på följande cellulära egenskaper, (i) förlust av fluorescens från nervceller som uttrycker GFP under initiativtagare till dat-1, (ii) nervceller som visar soma och/eller axonal blebbing, utväxter eller dendritisk förlust.
- Importera och analysera data med hjälp av ett programpaket (t.ex.
3. Förvärvsprocess och dataanalys av transgena nematoder som uttrycker pan-neuronally PolyQ40 smält med YFP
- Använd ett epifluorescensmikroskop kombinerat med en kamera (t.ex.
- Identifiera och fånga z-stack bilder av huvudet regionen vid 20x förstoring.
- Spara och samla in projektionsbilder med maximal intensitet.
- Fortsätt till analysen av de förvärvade bilderna med hjälp av Fiji programvara.
- Öppna bilder med Fiji program14.
- Välj kommandot Dela kanaler via den nedrullningsbara menyn Bild och Färg.
Behåll den gröna kanalbilden. - Använd frihandsvalverktyget för att manuellt ställa in det fluorescerande området av intresse (ROI; t.ex.
- Lägg till respektive ROI i ROI Manager via rullgardinsmenyn Analysera och Verktyg.
- Subtrahera bakgrunden till 50 % genom att välja Process och Subtrahera bakgrund.
- Ställa in och tillämpa tröskelvärden via menykommandot Bild | Justera | Tröskelvärdet. Behåll och ange samma tröskelvärden under hela bildanalysen av hela experimentet.
- Välj respektive AVKASTNING från ROI Manager.
- Analysera antalet proteinaggregat med hjälp av menykommandot Analysera och analysera partiklar.
- Upprepa steg 3.5-3.12 för varje förvärvad bild.
- Kopiera visningsvärdena från det separata resultatfönstret.
- Klistra in/importera och analysera resultaten med hjälp av ett programpaket.
4. Rapportera statistisk analys
- Använd minst 30 nematoder för varje experimentellt tillstånd. Utför tre biologiska replikat.
- Använd statistisk analysprogramvara för att antingen genomföra studenttrö-test(jämförelse mellan två grupper) eller ANOVA (jämförelse mellan flera grupper) för statistisk analys med p < 0,05 som signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nekrotisk celldöd-inducerad av hyperaktiva jonkanaler
Med hjälp av de förfaranden som presenteras här inkuberades muterade embryon antingen mec-4(u231) och deg-3u662) i 25 minuter vid 34 °C eller hölls vid standardtemperaturen på 20 °C. Vid kläckning fastställdes antalet neuronala celllik vid L1 larvstadiet i båda grupperna. Nematoder som kläckts från värmechockkonditionerade ägg (figur 1A-1B).
Proteinaggregerad neurodegeneration
Transgena nematoder överuttryck (A) mänskliga α-synuclein och cytoplasmatiska GFP i dopaminerga nervceller och (B) mänskliga polyglutamin protein (PolyQ) smält med YFP pan-neuronally, exponerades dagligen för 30 min vid 34 °C. Förkonditionering av värmechock främjar neuroprotektion mot α-synucleininducerad celldöd hos 7 dagar gamla vuxna hermafroditer (figur 2A) och minskar Q40::YFP proteinaggregat i huvudregionen av 4-dagars-gamla vuxna (figur 2B och figur 3).
Figur 1: Hyperaktiv jonkanalinducerad nekros. a) Representativ DIC-mikroskopibild av mec-4(u231) L1 larva, med pilspetsar som anger karakteristiska nekrotiska vakuoler. I ett tidigt skede av neurodegeneration svullna kärnor visas i celler. Bilden förvärvades med hjälp av en 40x invändning lins. Skala bar, 20 μm. (B)Antal neuronala cell lik vid L1 larvstadiet av utveckling, per 100 djur som transporterar neurotoxiska mec-4(u231) eller deg-3(u662) alleler. Nekrotisk celldöd undertrycks i L1 larver kläckts från fördämda ägg jämfört med obehandlade motsvarigheter (n= 100 djur per genotyp och analys; Data representerar medelvärdet ±S.E.M., ***P< 0.001 för obehandlad kontra förutsättningsförd; t-test) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Daglig förkonditionering vid 34 °C ger neuroprotektion mot α-synuklein och minskar polyQ-aggregaten i C. elegans. (Α) Överlevnad av främre dopaminerga nervceller (CEPs och ADEs) i obehandlade och förkonditionerade nematoder som samutvisar cytoplasmatiska GFP tillsammans med humant α-synuclein. Förkonditionerade nematoder visar förbättrad neuroprotektion jämfört med obehandlade. Rester av neuronala cellkroppar (asterisker) och axonal beading (pilspetsar) ses i obehandlade nematoder (övre panelen). Både soma (asterisker) och neuronala processer (pilspetsar) bevaras vid förkonditionering. Bilder som förvärvats med hjälp av en 20x invändning lins och skildra maximal intensitet z-projektion. Uppgifter: Bright, 0,15. Skala bar, 20 μm. Maskar gjordes för neuronal överlevnad av de främre dopaminerga nervceller på den sjunde dagen i vuxen ålder. (B)Neuronal polyQ aggregat upptäcks på den fjärde dagen av vuxen ålder i regionen huvudet av obehandlade och fördämda transgena nematoder. Förkonditionerade transgena maskar presenterar mindre neuronala Q40::YFP aggregat jämfört med obehandlade. Representativa bilder av huvudregionen visas med pilspetsar som anger polyQ proteinaggregat i neuronala celler. Bilder som förvärvats med hjälp av en 20x invändning lins och skildra maximal intensitet z-projektion. Förvärvsdetaljer: Bright, 0,0175. Skala bar, 20 μm. 30-35 djur kvantifierades per villkor i vart och ett av tre oberoende experiment. Data representerar medelvärdet ±S.E.M., ***P < 0,05, opartat t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bildanalys med hjälp av Fiji programvara. 1. Öppna en förvärvad bild med Fiji programvara; 2. Välj "Dela kanal" kommando via "Bild" och "Färg" rullgardinsmenyn för att konvertera bilden; 3, 4. Håll "grön kanal" bild och med hjälp av "frihand val" verktyg, packa fluorescerande region av intresse (ROI, t.ex. huvud). Lägg till respektive ROI i "ROI Manager" via rullgardinsmenyn "Analysera" och "Verktyg". 5, 6. Subtrahera bakgrunden till 50% genom att välja "Process" och "Subtrahera bakgrund"; 7, 8. Ställa in och tillämpa tröskelvärden via menykommandot "Bild", "Justera" och "Tröskelvärde"; 9. Välj respektive avkastning från "ROI Manager"; 10-12. Analysera antalet proteinaggregat med hjälp av menykommandot "Analysera" och "Analysera partiklar". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Recept | |
| 2% agaros kuddar | 1. Väg 0,5 g agaros i en cylindrisk glasbägare. | |
| 2. Tillsätt 25 ml M9 buffert. | ||
| 3. Värm i en mikrovågsugn tills den är nära kokning. Ta ut, rör om med en pipettspets och koka igen. Upprepa tills agatuppen är upplöst. | ||
| 4. Placera ett tomt mikroskop på bänken. | ||
| 5. Sätt en droppe (~ 50 μL) av färsk 2% agaros lösning i mitten av bilden. | ||
| 6. Ta en andra mikroskop bild och placera den ovanpå agaros droppe. Tryck försiktigt ner för att platta till droppen. | ||
| 7. Låt agarosen härda i 30 sekunder och ta försiktigt bort den övre mikroskopbilden. | ||
| 8. Fortsätt omedelbart med provberedningen, eftersom agaroskuddarna börjar torka inom cirka 5 minuter. | ||
| Tips: Låt den övre mikroskopbilden som ett lock bevara luftfuktigheten längre (~ 1 timme). Således kan flera agarose kuddar förberedas och användas snabbt under experimenten. | ||
| M9-buffert | 1. Lös upp 3 g KH2PO4,6 g Na2HPO4,5 g NaCl i 1 L destillerat vatten och autoklav. | |
| 2. Låt svalna och tillsätt 1 ml 1 M MgSO4 (steril). | ||
| 3. Förvara M9-bufferten vid 4 °C. | ||
| Nematod tillväxtmedium (NGM) agar plattor | 1. Blanda 3 g NaCl, 2,5 g bactopeptone, 0,2 g streptomycin, 17 g agar och tillsätt 900 ml destillerat vatten. Autoklav. | |
| 2. Låt svalna till 55-60 °C. | ||
| 3. Tillsätt 1 ml kolesterollagerlösning, 1 ml 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4,1 ml nystatinlagerlösning, 25 ml steril fosfatbuffert, pH 6.0 och destillerat sterilt vatten upp till 1 L. | ||
| 4. Pipettera 10 ml medium per petriskål och låt stelna. | ||
| 5. Förvara plattorna vid 4 °C tills de används. | ||
Tabell 1: Rekommenderade recept för använda reagenser. Alla reagensrecept som används i det presenterade protokollet beskrivs här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här introducerar och beskriver vi allmänt tillgängliga metoder för tillväxt, synkronisering och mikroskopisk undersökning av några mångsidiga C. elegans-modeller som undersöker åldersberoende neurodegeneration. Särskilt bedömer och dissekerar vi de cellulära och molekylära underbyggnaderna av åldersrelaterad neuronal nedbrytning genom att använda hyperaktiverad jonkanalinducerad nekros och proteinaggregatinducerad neurotoxicitet1,2,3,4,,5,7,9,10,11.,
Även om de beskrivna förfarandena för in vivo-celldöd bedömning är enkla och lätt kan utföras i alla laboratorium, det finns några kritiska åtgärder som bör beaktas. Kalorirestriktion och svält är kända för att framkalla flera stressvägar, såsom autofagi, som kan störa neurodegeneration eller proteinaggregat ackumulering13,,15,16. Således bör välmatade och icke-utsvultna nematoder användas. Värmechockkonditionering ger neuroprotektion mot flera neurodegenerativa stimuli och används som en etablerad celldödsmodulator11,13. Vissa mutanter är dock mottagliga för hög temperaturexponering under långa perioder. Det lämpliga utvecklingsstadiumet, ålder och varaktighet för förkonditionering av värmechock bör därför bestämmas experimentellt varje gång, när djur med olika genetisk bakgrund, som kan vara känsliga för höga temperaturer, används. En gradvis ökning av nematod intestinal autofluorescens observeras under åldrande. Således bör neuronala cellkroppar och processer nära tarmområdet undvikas under bildframställningsprocessen av AM101-stam. Fokus på neuronala celler, som ligger i huvudet och /eller svans regionen för att kringgå tarmen-härledda autofluorescens. Använd M9 buffert istället för vatten för att generera M9/levamisome buffert och 2% agaros kuddar. M9 buffert säkerställa en gynnsam osmotisk miljö skydda nematod från torkning ut hela mikroskopisk visualisering och analys.
De beskrivna metoderna understryker att kombinationen av nematoder modeller av neurodegeneration, tillsammans med genetiska och farmakologiska skärmar för celldöd modulatorer kan leda till en aldrig tidigare skådad förståelse av åldersrelaterade försämringar av neuronala kretsar och öka utvecklingen av nya terapeutiska insatser mot neurodegenerativa sjukdomar främja människors hälsa och livskvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Chaniotakis M. och Kounakis K. för videoinspelning och redigering. K.P. finansieras genom ett bidrag från Hellenic Foundation for Research and Innovation (HFRI) och Generalsekretariatet för forskning och teknik (GSRT). N.T. finansieras genom bidrag från Europeiska forskningsrådet (ERC – GA695190 – MANNA), Europeiska kommissionens ramprogram och det grekiska utbildningsministeriet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
