Summary
Burada, yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıkların hücresel ve moleküler temellerini izlemek ve incelemek için hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan yaygın olarak erişilebilir metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz.
Abstract
İnsan nörodejeneratif patolojileri ile mücadele ve yaygın sosyoekonomik etkileri yönetmek küresel bir öncelik haline gelmektedir. İnsan yaşam kalitesi ve sağlık sistemi üzerindeki zararlı etkilerine rağmen, insan nörodejeneratif bozuklukların çoğunluğu hala tedavi edilemez ve engellenemez kalır. Bu nedenle, bu tür hastalıklara karşı yeni terapötik müdahalelerin geliştirilmesi acil bir aciliyet haline gelmektedir. Nöronal devrelerin ve fonksiyonun yaşla ilişkili bozulması, düşük solucan Caenorhabditis elegans ve insanlar gibi çeşitli organizmalarda evrimsel olarak korunur ve altta yatan hücresel ve moleküler mekanizmalarda benzerlikleri belirtir. C. elegans, yaşlanma sırasında nöronal aktivite ve kalite kontrolünü değerlendirmek için iyi karakterize bir sinir sistemi, vücut şeffaflığı ve genetik ve görüntüleme tekniklerinin çeşitli repertoire'sini sunan son derece biçimlendirilebilir bir genetik modeldir. Burada, hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz (örneğin, deg-3(d) ve mec-4(d)ve protein agregası (örn. α-syunclein ve poli-glutamat) kaynaklı nörotoksisite, yaşla ilgili nöronsal inancının hücresel ve moleküler alt çökmelerini izlemek ve incelemek gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz. Bu hayvan nörodejenerasyon modellerinin bir kombinasyonu, hücre ölümü modülatörleri için genetik ve farmakolojik ekranlar ile birlikte nöronal fonksiyonun yaşa bağlı arıza benzeri görülmemiş bir anlayış yol açacaktır ve insan sağlığı ve yaşam kalitesi için geniş alaka ile kritik anlayışlar sağlayacaktır.
Introduction
Son yirmi yılda, C. elegans yaygın nekrotik hücre ölümünün moleküler mekanizmalarını araştırmak için bir model organizma olarak kullanılmıştır. C. elegans son derece iyi karakterize ve eşlenmiş sinir sistemi, şeffaf vücut yapısı ve genetik ve görüntüleme yöntemleri nin çeşitli repertoire in vivo hücresel fonksiyon ve yaşlanma boyunca sağkalım izlemek için sunuyor. Böylece, nörodejenerasyon çeşitli C. elegans genetik modelleri zaten nöronal canlılık değerlendirmek için geliştirilmiştir. Özellikle, iyi tanımlanmış ve kullanılan nematod modelleri hiperaktif iyon kanal kaynaklı nekroziçerir 1,2,3 ve hücre ölümü artan protein toplama tarafından tetiklenen4,5,,6,,7,99,10 ve sıcak çarpması11,12, diğerleri arasında.
Nematodlarda ve memeli nöronlarında sonraki bir ısı stresinin tetiklediği nekrotik hücre ölümüne karşı direnç kazandırAn alt öldürücü sıcaklıklara kısa süreli maruz kalma11. İlginçtir ki, nematodların hafif yüksek sıcaklıkta günlük ön koşullandırması, iyonik dengesizlik (örn. mec-4(u231) ve/veya deg-3(u662)ve protein toplama (örn., α-synüklein ve poliQ40)11,13gibi çeşitli uyaranların neden olduğu nörodejenerasyona karşı korur.
Burada, excitotoksisite tetikli hücre ölümü, Parkinson ve Huntington hastalığı gibi insan hastalıklarının köklü modellerinde yaşa bağlı nörodejenerasyonu izlemek ve değerlendirmek için C. elegans kullanarak çok yönlü metodolojileri tanımlıyoruz. Ayrıca, nörodejenerasyon çeşitli modellerde ısı önkoşullanma nöroprotektif rolü altını çizer. Bu tekniklerin genetik ve/veya farmakolojik ekranlarla bir leşi sonucu, yeni hücre ölümü modülatörlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu potansiyel terapötik ilgi ile sonuçlanacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hiperaktif iyon kanalları tarafından indüklenen nekrotik hücre ölümü
NOT: Mec-4 ve deg-3 dahil olmak üzere degenerinlerin gen ailesindeki fonksiyon kazanım mutasyonları, solucanlarda mekanosansasyon için gerekli olan altı dokunma reseptör nöronunne nekrotik hücre ölümünü tetikleyen hiperaktif iyon kanallarının oluşumuyla sonuçlanır3. Dejenerinlerin anormal uyarılması ile indüklenen nekroz, memelilerde eksitotoksisite ile çeşitli mekanistik ve morfolojik benzerlikler gösterir. Enerji metabolizması ve kalsiyum homeostaz bakımı nekroz sırasında nöronal sağkalım üzerinde önemli bir role sahiptir11. Hiperaktif iyon kanalları, mec-4(u231)X ve deg-3(u662)Vtarafından tetiklenen nekrotik hücre ölümünü izlemek için aşağıdaki suşlar kullanılabilir.
- Nekrotik hücre ölümünün incelenmesi için mutant solucanların bakımı, senkronizasyonu ve hazırlanması
- 1. Gün: Nematode Growth Media (NGM) üzerine mec-4(u231) veya deg-3(u662) mutant nematodların L4 larvalarını seçin; Tablo 1) escherichia coli (OP50) ile bir diseksiyon stereomikroskop kullanılarak tohumlanmış plakalar.
- Tohumlu NGM plakabaşına 10 L4 nematod yerleştirin ve 20 °C'lik standart sıcaklıkta yetiştirin.
- 5. Gün: Plakaları 1 mL M9 tamponuyla yıkayın(Tablo 1) ve hayvanları 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın.
- 30 s için 10.000 x g santrifüj ve supernatant kaldırın.
- 0,5 mL beyazlatma çözeltisi (7 mL H2O, 1 mL 5 N NaOH ve 2 mL çamaşır suyu) ekleyin.
NOT: Beyazlatma çözümü yavaş yavaş etkinliğini kaybeder; bu nedenle günlük olarak hazırlanmalıdır. - Girdap ve solucanlar eriyene kadar periyodik olarak izleyin.
NOT: Embriyoların canlılığı etkileneceği için 5 dakikadan uzun sürebeyaztlandırmadan kaçının. - 30 s için 10.000 x g santrifüj ve supernatant kaldırın.
- 1 mL M9 tamponu ile iki kat pelet (yumurta) yıkayın.
- Yıkandıktan sonra, 200 μL M9 tampon yumurta yeniden askıya ve bir su banyosunda 34 °C'de 25 dakika kuluçka.
- 20 °C'de ayrı bir kontrol numunesi (yumurta) grubu koruyun.
- Pipet 100 μL kontrol veya ısı şoku ile işlenmiş yumurtave tohumsuz NGM plakaları üzerine yerleştirin. Her tabakta en az 100-200 yumurta var.
- Yumurtaları kuluçkaya yatana kadar 20 °C'de kuluçkaya yatırdı.
- Diferansiyel girişim kontrastı kullanılarak muayene için L1 larvalarının montajı (DIC; Nomarsky) mikroskopi
- % 2 agarose pedleri hazırlayın.
- Plakaları yıkamak ve 1,5 mL tüplerde L1 larva nematodları toplamak için 1 mL M9 tampon kullanın.
- 30 s için 10.000 x g santrifüj.
- Supernatant çıkarın ve pelet (nematodlar) tutun.
- Nematodları anestezik için 100 mL 20 mM M9/levamisole tampon ekleyin.
NOT: Anestezi olarak sodyum azitten kaçının. Sodyum azit mitokondriyal hasarı ve oksidatif stresi tetikler ve sonunda hücre ölümü indüksiyonuna yol açar - L1 solucanları içeren M9/levamisole tampon pipet 10 μL ve % 2 agarose pedleri üzerine monte(Tablo 1).
- Numunenin üstüne bir kapak slipini yavaşça yerleştirin.
NOT: Görüntüleme işlemi boyunca nemi korumak için kapağı oje ile kapatın. - Diferansiyel girişim kontrastı kullanarak solucanları gözlemleyin (DIC; Nomarsky) mikroskopi.
- Nematod başına karakteristik vacuolated görünüm ile hücreleri sayarak altı dokunmatik reseptör nöronların puan nörodejenerasyon.
2. Protein agregakaynaklı nörodejenerasyon
NOT: Aşağıdaki suşlar protein agregalarına bağlı nörotoksisitenin araştırılmasında kullanılabilir: (A) dopaminerjik nöronlarda insan α-sinükleinaşırı ekspresyonu, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] ve (B) insan poliglutamin proteinaşırı ekspresyonu (PolyQ) pan-nöronally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
- Nörodejenerasyon teşpini için transgenik nematodların bakımı, senkronizasyonu ve hazırlanması
- C. elegans gelişimini ve büyümesini izlemek için bir diseksiyon stereomikroskop kullanın.
- 1. Gün: Taze OP50 tohumlu NGM plakaları üzerinde her bir suş 15-20 L4 larvaları toplayıp aktararak transgenik nematod popülasyonunu senkronize edin.
NOT: Her koşulda her bir zorlanmadan en az üç plaka kullanın. - Kuluçka ve nematodlar 20 ° C standart sıcaklıkta büyümeye izin.
- 2. Gün: 34 °C'de ayarlanmış bir kuluçka makinesinde plakaları transfer ederek 30 dakika boyunca günlük ön koşullandırma gerçekleştirin. Daha sonra, önceden koşullandırılmış nematodları 20 °C'lik standart sıcaklıkta geri getirin.
NOT: Farklı genetik arka planlar uzun süre maruz kalmak için yüksek sıcaklığa duyarlı olabilir. - (A) Dopaminerjik nöronlarda insan α-sinüklein aşırı ekspresyonu araştırıyorsanız, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: Gün 9, dopaminerjik nöronal hücre ölümü için 7 günlük transgenik nematodları izlemek.
- (B) İnsan poliglutamin proteininin aşırı ekspresyonu araştırırsanız (PolyQ) pan-nöronally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: 5.
- Mikroskobik inceleme için numunelerin montajı
- %2 agarose pedleri hazırlayın (Tablo 1).
- Agarose pedin ortasına 10 μL 20 mM M9/levamisole tampon damlası ekleyin.
- İlgili transgenik nematodları seçin ve m9/levamisole damlasına aktarın.
NOT: Damla başına 20-30 nematod yerleştirin. - Numunenin üstüne hafifçe bir kapak kaydırın.
NOT: Görüntüleme işlemi boyunca nemi korumak için kapağı oje ile kapatın. - İlgili numunelerin mikroskobik incelemesine devam edin.
- Dopaminerjik nöronlarda α-sinüklein ve sitosolik GFP'yi birlikte ifade eden transgenik nematodların elde etme süreci ve veri analizi
- Bir kamera ile birlikte bir epifloresan mikroskobu kullanın (örneğin, EVOS FL Auto 2).
- 20x büyütmede kafa bölgesinin z-stack görüntülerini algılayıp yakalayın.
- Maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntülerini kaydedin ve toplayın.
- Edinilen görüntülerin analizine devam edin.
- Aşağıdaki hücresel özellikleri puanlama tarafından nörodejenerasyon için transgenik solucanlar inceleyin, (i) dat-1organizatörü altında GFP ifade nöronlardan floresan kaybı , (ii) soma ve / veya aksonal blebbing gösteren nöronlar, outgrowths veya dendritik kaybı.
- Bir yazılım paketi (örneğin, Excel) kullanarak verileri içe aktarın ve analiz edin.
3. YFP ile kaynaşmış pan-nöronal PolyQ40 ifade transgenik nematodların edinim süreci ve veri analizi
- Bir kamera ile birlikte bir epifloresan mikroskobu kullanın (örneğin, EVOS FL Auto 2).
- 20x büyütmede kafa bölgesinin z-stack görüntülerini algılayıp yakalayın.
- Maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntülerini kaydedin ve toplayın.
- Fiji yazılımını kullanarak elde edilen görüntülerin analizine devam edin.
- Fiji programı14ile açık görüntüler .
- Görüntü ve Renk açılır menüsünden Kanalları Böl komutunu seçin.
NOT: Yeşil kanal görüntüsünü saklayın. - Floresan alanı el ile ayarlamak için serbest seçim aracını kullanın (RoI; örneğin, kafa).
- Çözümle ve Araçlar açılır menüsü nden yatırım getirisi yöneticisine ilgili yg'yi ekleyin.
- İşlem ve Arka Planı Çıkar'ı seçerek arka planı %50'ye çıkarın.
- Menü komutu Resim üzerinden eşik değerlerini ayarlama ve uygulama | Ayarla | Eşik. Tüm denemenin görüntü analizi boyunca aynı eşik değerlerini tutun ve ayarlayın.
- YG Yöneticisi'ndenilgili YG'yi seçin.
- Menü komutunu kullanarak protein agregalarının sayısını analiz edin Analiz et ve Parçacıkları Analiz Et.
- Edinilen her görüntü için 3,5-3,12 adımlarını yineleyin.
- Ayrı Sonuçlar penceresinden ekran değerlerini kopyalayın.
- Bir yazılım paketi kullanarak sonuçları yapıştırın/içe aktarın ve analiz edin.
4. Rapor istatistiksel analiz
- Her deneysel durum için en az 30 nematod kullanın. Üç biyolojik kopya gerçekleştirin.
- P < 0.05 ile istatistiksel analiz için öğrenci t-testi (iki grup arasında karşılaştırma) veya ANOVA (birden fazla grup arasında karşılaştırma) yapmak için istatistiksel analiz yazılımını kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hiperaktif iyon kanalları tarafından indüklenen nekrotik hücre ölümü
Burada sunulan prosedürler kullanılarak mec-4(u231) ve deg-3u662 mutant embriyolar ya 34 °C'de 25 dakika kuluçkaya yatırıldı ya da 20 °C'de standart sıcaklıkta tutuldu. Kuluçka sırasında her iki grubun L1 larva evresinde nöronal hücre cesetlerinin sayısı belirlendi. Nekrotik hücre ölümü, ısı şoku ön koşullu yumurtalardan yumurtadan çıkan nematodlarda azalır (Şekil 1A-1B).
Protein agregakaynaklı nörodejenerasyon
Dopaminerjik nöronlarda (A) insan α-sinüklein ve sitoplazmik GFP'yi aşırı ekspresye eden transgenik nematodlar ve (B) YFP pan-nöronla kaynaşmış insan poliglutamin proteini (PolyQ) 34 °C'de günlük 30 dakika boyunca maruz kalmıştır. Isı şoku ön koşullandırması 7 günlük erişkin hermafroditlerde α-sinüklein indüklenen hücre ölümüne karşı nöro-korumayı teşvik eder(Şekil 2A) ve Q40 azalır::4 günlük erişkinlerin baş bölgesinde YFP protein agregaları azalır(Şekil 2B ve Şekil 3).
Şekil 1: Hiperaktif iyon kanal kaynaklı nekroz. (A) Mec-4(u231) L1 larvasının temsili DIC mikroskopi görüntüsü, ok başları karakteristik nekrotik vakuolleri gösterir. Nörodejenerasyonun erken evresinde şişmiş çekirdekler hücrelerde görüntülenir. Görüntü 40x itiraz lens kullanılarak elde edildi. Ölçek çubuğu, 20 μm. (B) Gelişimin L1 larva evresinde nöronal hücre cesetlerinin sayısı, nörotoksik mec-4(u231) veya deg-3(u662) alelleri taşıyan 100 hayvan başına. Nekrotik hücre ölümü, ön koşullu yumurtalardan yumurtadan çıkan L1 larvalarında, tedavi edilmeyen karşılıklara göre bastırılır (genotip ve teşrin başına n= 100 hayvan; Veriler , %/4000,****P< 0,001 anlamına gelir. t-test) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: 34 °C'de günlük ön koşullanma α-sinükleine karşı nöro-koruma sağlar ve C. eleganspoliQ agregalarını azaltır. (Α) Tedavi edilmeyen ve ön koşullu nematodlarda anterior dopaminerjik nöronların (CEP ve AAD'ler) insan α-sinüklein ile birlikte sitoplazmik GFP'yi birlikte ifade eden sağkalım. Ön koşullu nematodlar tedavi edilmezse gelişmiş nörokoruma gösterirler. Nöronal hücre organlarının kalıntıları (yıldız) ve aksonal boncuk (ok başları) tedavi edilmemiş nematodlarda (üst panel) görülür. Hem soma (yıldız işareti) hem de nöronal süreçler (ok başları) ön koşullandırma üzerine korunur. 20x itiraz lensi kullanılarak elde edilen görüntüler maksimum yoğunluklu z-projeksiyonu betimledir. Satın alma detayları: Parlak, 0.15. Ölçek çubuğu, 20 μm. Solucanlar yetişkinliğin yedinci gününde anterior dopaminerjik nöronların nöronal sağkalım için puanlandı. (B) Tedavi edilmeyen ve ön koşullu transgenik nematodların baş bölgesinde erişkinliğin dördüncü gününde saptanan nöronal poliQ agregaları. Ön koşullu transgenik solucanlar tedavi edilmeyene göre daha az nöronal Q40 sunar::YFP agregaları. Baş bölgesinin temsili görüntüleri nöronal hücrelerde poliQ protein agregalarını gösteren ok başları ile gösterilir. 20x itiraz lensi kullanılarak elde edilen görüntüler maksimum yoğunluklu z-projeksiyonu betimledir. Satın alma detayları: Parlak, 0.0175. Ölçek çubuğu, 20 μm. Üç bağımsız deneyin her birinde 30-35 hayvan her koşulda ölçüldü. Veriler ±S.E.M., ***P < 0.05, eşleşmemiş t-testi anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fiji yazılımı kullanılarak görüntü analizi. 1. Fiji yazılımı ile edinilmiş bir görüntü açın; 2. Görüntüyü dönüştürmek için "Görüntü" ve "Renk" menüsünden "Split kanal" komutunu seçin; 3, 4. "Yeşil kanal" görüntüsünü koruyun ve "serbest seçim" aracını kullanarak floresan bölgeyi (RoI; örneğin, kafa) sarın. "Çözümle" ve "Araçlar" açılır menüsü nden ilgili YG Yöneticisi'ni ekleyin; 5, 6. "İşlem" ve "Arka Planı Çıkar" seçeneğini seçerek arka planı %50'ye çıkarın; 7, 8. "Resim", "Ayarla" ve "Eşik" menü komutu ile eşik değerlerini ayarlayın ve uygulayın; 9. "YG Yöneticisi"nden ilgili YG'yi seçin; 10-12. "Analiz et" ve "Parçacıkları Analiz Et" komutunu kullanarak protein agregalarının sayısını analiz edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | Tarifi | |
| %2 agarose ped | 1. Silindirik cam bir kabın içinde 0,5 g agarose tartın. | |
| 2. 25 mL M9 arabelleği ekleyin. | ||
| 3. Kaynamaya yakın kadar bir mikrodalga Da ısıtın. Alın, bir pipet ucu ile karıştırın ve tekrar kaynatın. Agarose eriyene kadar tekrarlayın. | ||
| 4. Tezgahüzerine boş bir mikroskop slayt yerleştirin. | ||
| 5. Slaytın ortasına %2'lik taze agarose çözeltisi damlatın (~ 50 μL). | ||
| 6. İkinci bir mikroskop slayt alın ve agarose damla üstüne yerleştirin. Yavaşça damla düzleştirmek için aşağı basın. | ||
| 7. Agarose 30 saniye sertleşsin ve yavaşça üst mikroskop slayt kaldırın. | ||
| 8. Agarose pedleri yaklaşık 5 dakika içinde kurumaya başlayacağından, numune hazırlamaya hemen devam edin. | ||
| İpucu: Nemi daha uzun süre korumak için üst mikroskop kaydıraktan daha uzun süre (~ 1 saat) bir kapak olarak bırakın. Böylece, çeşitli agarose pedleri hazırlanabilir ve deneyler sırasında hızla kullanılabilir. | ||
| M9 arabellek | 1. Çözün3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl 1 L distile su ve otoklav. | |
| 2. Soğumaya bırakın ve 1 M MgSO4 (steril) 1 mL ekleyin. | ||
| 3. M9 tamponu 4 °C'de saklayın. | ||
| Nematod büyüme ortamı (NGM) agar plakaları | 1. Mix 3 g NaCl, 2.5 g bactopeptone g, 0.2 g streptomisin, 17 g agar ve distile su 900 mL ekleyin. Otoklav. | |
| 2. 55-60 °C'ye soğumaya bırakın. | ||
| 3. 1 mL kolesterol stok çözeltisi, 1 mL 1 M CaCl2,1 mL 1 M MgSO4,1 mL nystatin stok çözeltisi, 25 mL steril 1 M fosfat tampon, pH 6.0 ve 1 L'ye kadar distile steril su ekleyin. | ||
| 4. Pipet Petri çanak başına orta 10 mL ve katılaşmak için bırakın. | ||
| 5. Plakaları kullanılana kadar 4 °C'de saklayın. | ||
Tablo 1: Kullanılan reaktifler için önerilen tarifler. Sunulan protokolde kullanılan tüm reaktif tarifleri burada özetlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, yaşa bağlı nörodejenerasyonu araştıran çok yönlü C. elegans modellerinin büyüme, senkronizasyon ve mikroskobik incelemesi için yaygın olarak erişilebilir metodolojiler sokulmaktadır. Özellikle, biz değerlendirmek ve hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite1,2,,3,,4,5,7,9,10,11kullanarak yaşa bağlı nöronal arıza hücresel ve moleküler temelleri incelemek .
In vivo hücre ölümü değerlendirmesi için açıklanan prosedürler basit ve herhangi bir laboratuvarda kolayca yapılabilir rağmen, dikkate alınması gereken bazı kritik adımlar vardır. Kalori kısıtlaması ve açlık birden fazla stres yolları neden olduğu bilinmektedir, otofaji gibi, nörodejenerasyon veya protein agregabirikimi ile müdahale edebilir13,15,16. Bu nedenle iyi beslenen ve aç olmayan nematodlar kullanılmalıdır. Isı şoku önkoşullanma çeşitli nörodejeneratif uyaranlara karşı nörokoruma confers ve kurulmuş bir hücre ölümü modülatör olarak kullanılır11,13. Ancak, bazı mutantlar uzun süre yüksek sıcaklık maruz kalma duyarlıdır. Bu nedenle, yüksek sıcaklıklara duyarlı olabilecek farklı genetik geçmişe sahip hayvanlar kullanıldığında, uygun gelişim evresi, yaş ve ısı şoku ön koşullandırmasüresi deneysel olarak her zaman belirlenmelidir. Yaşlanma sırasında nematod intestinal otofloresans kademeli bir artış gözlenir. Bu nedenle AM101 suşlarının görüntüleme sürecinde nöral hücre organları ve bağırsak bölgesine yakın süreçlerden kaçınılmalıdır. Bağırsak kaynaklı otofloresans atlamak için baş ve / veya kuyruk bölgesinde bulunan nöronal hücreler, odaklanın. M9/levamisome tampon ve% 2 agarose pedleri oluşturmak için su yerine M9 tampon kullanın. M9 tampon mikroskobik görüntüleme ve analiz boyunca kurumasını nematodları koruyan olumlu bir ozmotik ortam sağlar.
Açıklanan metodolojiler, nörodejenerasyonne ait nematod modellerinin, hücre ölümü modülatörleri için genetik ve farmakolojik ekranlarla birlikte, nöronal devrelerin yaşla ilişkili bozulmasının eşi görülmemiş bir şekilde anlaşılmasına yol açabileceğini ve insan sağlığını ve yaşam kalitesini teşvik eden nörodejeneratif bozukluklara karşı yeni terapötik müdahalelerin gelişimini hızlandırabileceğinin altını çizer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.
Acknowledgments
Chaniotakis M. ve Kounakis K.'ya video kaydı ve kurgusu için teşekkür ederiz. K.P., Yunanistan Araştırma ve İnovasyon Vakfı (HFRI) ve Araştırma ve Teknoloji Genel Sekreterliği'nin (GSRT) bir bağışı ile finanse edilmektedir. N.T. Avrupa Araştırma Konseyi (ERC – GA695190 – MANNA), Avrupa Komisyonu Çerçeve Programları ve Yunanistan Eğitim Bakanlığı'nın bağışları ile finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
