Summary
ここでは、過活性化イオンチャネル誘導性壊死やタンパク質凝集誘発神経毒性を含む、多目的な線虫モデルを利用した広くアクセス可能な方法論を紹介し、年齢関連神経変性疾患の細胞および分子基盤を監視および解剖する。
Abstract
ヒトの神経変性病理と闘い、その広範な社会経済的影響を管理することは、世界的な優先事項になりつつあります。人間の生活の質と医療システムに対する有害な影響にもかかわらず、人間の神経変性疾患の大半は依然として不治で予防不可能なままです。したがって、このような病気に対する新たな治療介入の開発は、緊急性を迫っている。神経回路および機能の年齢関連の悪化は、低ワーム のカエノハブディティス・エレガンス やヒトと同じくらい多様な生物において進化的に保存され、基礎となる細胞および分子メカニズムの類似性を意味する。 C.エレガンス は非常に可鍛性の高い遺伝モデルであり、よく特徴付けられる神経系、身体の透明性、および老化時の神経活動と品質管理を評価するための遺伝的およびイメージング技術の多様なレパートリーを提供する。ここでは、過活性化イオンチャネル誘発壊死( 例えば、deg-3(d) および mec-4(d))およびタンパク質凝集(例えば、α-シリン酸およびポリグルタミン酸)誘導神経毒性を含むいくつかの汎用性の高い線虫モデルを利用した方法論を紹介し、説明する。これらの動物神経変性モデルと細胞死モジュレーターの遺伝的および薬理学的スクリーンの組み合わせは、神経機能の年齢関連の内訳の前例のない理解をもたらし、人間の健康と生活の質に広く関連する重要な洞察を提供します。
Introduction
過去20年間、C.エレガンスは壊死細胞死の分子メカニズムを調べるモデル生物として広く使用されてきました。C.エレガンスは、非常によく特徴付け、マッピングされた神経系、透明な身体構造、および老化を通して生体内細胞機能および生存を監視する遺伝的およびイメージング方法の多様なレパートリーを提供する。したがって、神経変性のいくつかのC.エレガンス遺伝モデルは、神経細胞の生存率を評価するために既に開発されている。,特に、よく説明され、使用される線虫モデルは、タンパク質凝集,,,,,44、5、6、7、8、9、105および熱中ストローク,896711、12、とりわけ増加したタンパク質凝集によって引き起こされる多動11性イオンチャネル誘導性壊死12101、2、3および細胞死を含む。3 ,
致死下の温度への短期的な暴露は、壊死細胞死に対する耐性を与え、線虫および哺乳類ニューロン11の両方におけるその後の熱ストレスによって引き起こされた。興味深いことに、穏やかな高温での線虫の毎日の予備調整は、イオン的不均衡(例えば、mec-4(u231)および/またはdeg-3(u662))およびタンパク質凝集(例えば、α-シヌクレインおよびPolyQ40)11,13のような多様な刺激によって引き起こされる神経変性から11,13保護する。
ここでは 、C.エレガンス を使用して、興奮性毒性誘発細胞死、パーキンソン病およびハンチントン病などのヒト疾患の確立されたモデルにおける年齢依存性神経変性を監視および評価するための汎用性の高い方法論について説明する。さらに、我々は、神経変性のいくつかのモデルにおける熱プレコンディショニングの神経保護的役割を強調する。これらの技術を遺伝的および/または薬理学的スクリーンと組み合わせることで、新しい細胞死モジュレーターの同定と特性化が生じ、潜在的な治療上の関心を持つ。
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Protocol
1. 多動性イオンチャネルによる壊死細胞死
注:デゲネリンの遺伝子ファミリーにおける機能の利益変異は、とりわけ mec-4 および deg-3 を含む、ワーム3のメカノセンセーションに必要な6つのタッチ受容体ニューロンの壊死細胞死を引き起こす多動性イオンチャネルの生成をもたらす。デゲネリンの異常刺激によって誘発される壊死は、哺乳類における興奮毒性に対するいくつかの機械学的および形態学的類似性を示す。エネルギー代謝とカルシウム恒常性の維持は、壊死中の神経細胞生存に重要な役割を持っています 11.以下の株は、多動性イオンチャネル 、mec-4(u231)X および deg-3(u662)Vによって引き起こされる壊死細胞死を監視するために使用することができる。
- 壊死の検査のための変異型ワームの維持、同期および調製
- 1日目: メック-4(u231) または deg-3(u662) 変異線虫のL4幼虫を線虫成長培地(NGM)にピックする。 表 1)解剖の天体顕微鏡を用いた 大腸菌 (OP50)をまいたプレート。
- 播種されたNGMプレートごとに10 L4線虫を配置し、20°Cの標準温度で成長させます。
- 5日目:M9バッファー(表1)の1mLでプレートを洗浄し、1.5mLチューブで動物を採取します。
- 30 sの10,000 x g で遠心分離機を使用し、上清を除去します。
- 漂白液0.5mL(H2O7 mL、52N NaOHの1mL、漂白剤2mL)を加えます。
注:漂白ソリューションは徐々にその効率を失います。したがって、毎日準備する必要があります。 - ボルテックスと監視は、ワームが溶解するまで定期的に行います。
注意:胚の生存率が影響を受けるため、5分以上の期間は漂白しないでください。 - 30 sの10,000 x g で遠心分離機を使用し、上清を除去します。
- ペレット(卵)を1mLのM9バッファーで2回洗います。
- 洗浄後、M9バッファー200μLで卵を再懸濁し、水浴中の34°Cで25分間インキュベートします。
- コントロールサンプル(卵)の別のグループを20°Cに維持します。
- ピペット100μLのコントロールまたは熱ショック処理卵を、種なしNGMプレートに置きます。各プレートには、少なくとも100〜200個の卵が含まれています。
- 卵を孵化するまで20°Cでインキュベートした。
- 差動干渉コントラスト(DIC;ノマルスキー)顕微鏡
- 2%アガロースパッドを準備します。
- M9バッファーの1 mLを使用してプレートを洗浄し、1.5 mLチューブでL1幼虫を採取します。
- 遠心分離機は10,000 x g で30s。
- 上清を取り除き、ペレット(線虫)を保管してください。
- 20 mM M9/レバミソールバッファーの100 μLを加え、線虫を麻酔します。
注:麻酔薬としてアジドナトリウムを避けてください。アジドナトリウムは、最終的に細胞死誘導につながるミトコンドリアの損傷と酸化ストレスを引き起こす - L1ワームを含むM9/レバミゾールバッファーのピペット10 μLを2%アガロースパッドに取り付けます(表1)。
- サンプルの上部にカバースリップをそっと置きます。
注:マニキュアでカバースリップを密封して、イメージングのプロセス全体で湿度を維持します。 - 微分干渉コントラスト(DIC;)ノマルスキー)顕微鏡。
- 線虫ごとに特徴的な空胞体外観を有する細胞を数えることによって、6つのタッチ受容体ニューロンの神経変性をスコア付けする。
2. タンパク質凝集誘発神経変性
注:以下の株は、タンパク質凝集体誘発神経毒性を調査するために使用することができる:(A)ドーパミン作動性ニューロンにおけるヒトα-シヌクレインの過剰発現、 UA44: [baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] および(B) ヒトポリグルタミンタンパク質 (PolyQ) 汎神経細胞の過剰発現, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] Is6,,10.
- 神経変性アッセイ用トランスジェニック線虫の維持・同期・調製
- 解剖の実体顕微鏡を使用して 、C.エレガンスの 発達と成長を監視します。
- 1日目:新たに種を付けたNGMプレート上の各株の15-20 L4幼虫を摘み取り、移送することにより、トランスジェニック線虫の集団を同期させます。
注: 各ひずみのプレートを少なくとも 3 枚使用します。 - インキュベートし、線虫を20°Cの標準温度で成長させます。
- 2日目:34°Cにセットしたインキュベーターでプレートを移し、30分間のプレコンディショニングを行います。次いで、予め調整された線虫を20°Cの標準温度で戻す。
注:異なる遺伝的背景は、長時間の暴露のために高温に敏感である可能性があります。 - (A) ドーパミン作動性ニューロンにおけるヒトα-シヌクレインの過剰発現を調査する場合、UA44: [baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]:9日目に、ドーパミン作動性神経細胞死に対する7日前のトランスジェニック線虫を監視する。 Is
- (B) ヒトポリグルタミンタンパク質(PolyQ)汎神経細胞の過剰発現を調べる場合 、AM101:rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]:5日目に、Q40::YFPを発現する4日間のトランスジェニック動物の頭部領域における神経ポリQ凝集体を測定する。
- 顕微鏡検査用サンプルの取り付け
- 2%アガロースパッドを準備する(表1)。
- アガロースパッドの中央に20 mM M9/レバミソールバッファードロップの10 μLを追加します。
- それぞれのトランスジェニック線虫を選び、M9/レバミソールドロップで転送します。
注:1滴あたり20-30線虫を置きます。 - サンプルの上部にカバースリップをそっと置きます。
注:マニキュアでカバースリップを密封して、イメージングのプロセス全体で湿度を維持します。 - それぞれのサンプルの顕微鏡検査に進みます。
- ドーパミン作動性ニューロンにおけるα-シヌクレインおよびサイトゾースGFPを共同発現するトランスジェニック線虫の取得過程とデータ解析
- カメラと組み合わせた蛍光顕微鏡(例えば、EVOS FLオート2)を使用してください。
- 20倍の倍率でヘッド領域のZスタック画像を検出してキャプチャします。
- 最大強度投影画像を保存して収集します。
- 取得した画像の解析に進みます。
- 以下の細胞特性をスコアリングすることにより、神経変性のトランスジェニックワームを調べ 、(i)dat-1のプロモーター下でGFPを発現するニューロンからの蛍光の喪失、(ii)腫および/または軸索の出血、成長または樹状障害を示すニューロンを調べる。
- ソフトウェア パッケージ (Excel など) を使用してデータをインポートおよび分析します。
3. YFPと融合した汎神経細胞質PolyQ40を発現するトランスジェニック線虫の取得過程とデータ解析
- カメラと組み合わせた蛍光顕微鏡(例えば、EVOS FLオート2)を使用してください。
- 20倍の倍率でヘッド領域のZスタック画像を検出してキャプチャします。
- 最大強度投影画像を保存して収集します。
- フィジーソフトウェアを使用して取得した画像の分析に進みます。
- フィジープログラム14で画像を開きます。
- [画像と色] ドロップダウン メニューから [チャンネルの分割] コマンドを選択します。
注: 緑色のチャンネルイメージを保持します。 - フリーハンド選択ツールを使用して、対象の蛍光領域(ROI、例えばヘッド)を手動で設定します。
- [分析とツール]ドロップダウン メニューから、ROI マネージャの ROIを追加します。
- [ プロセス ] と [背景を減算] を選択して、背景を 50% に引きます。
- メニューコマンド 画像 を使用してしきい値を設定および適用する | 調整 | しきい値:実験全体の画像解析全体を通して、同じしきい値を維持し、設定します。
- ROI マネージャから、対応する ROI を選択します。
- メニューコマンド「パーティクルの分析と分析」コマンドを使用して、タンパク質凝集体の数を分析します。
- 取得した画像ごとに手順 3.5 ~ 3.12 を繰り返します。
- 別の結果ウィンドウから表示値をコピーします。
- ソフトウェア パッケージを使用して結果を貼り付け/インポートし、分析します。
4. 統計分析の報告
- 実験条件ごとに少なくとも30線虫を使用してください。3つの生物学的複製を行う。
- 統計的分析ソフトウェアを使用して、学生 t-検定(2つのグループ間の比較)またはANOVA(複数グループ間の比較)を実施して、p<0.05を有意として統計分析します。
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Representative Results
多動性イオンチャネルによる壊死細胞死
ここで示した手順を用いて、mec-4(u231)およびdeg-3u662)変異胚を34°Cで25分間インキュベートするか、または20°Cの標準温度で保った。孵化の際、両群のL1幼虫段階で神経細胞の死体数が決定された。壊死細胞死は、熱ショック予調卵から孵化した線虫において減少する(図1A-1B)。
タンパク質凝集誘発神経変性
ドーパミン作動性ニューロンにおける(A)ヒトα-シヌクレインおよび細胞質GFPを過剰発現するトランスジェニック線虫及び(B)ヒトポリグルタミンタンパク質(PolyQ)とYFP汎ニューロンと融合し、34°Cで毎日30分間曝露した。ヒートショックプレコンディショニングは、7日齢の成人雌雄同体におけるα-シヌクレイン誘発細胞死に対する神経保護を促進し、4日齢成人の頭領域におけるQ40::YFPタンパク質凝集体を減少させる(図2Bおよび図3)。
図1:多動性イオンチャネル誘発性壊死。()代表的なDIC顕微鏡画像mec-4(u231) L1幼虫の, 特徴的な壊死性の空胞を示す矢印を有する.神経変性の初期段階では、腫れた核が細胞内に表示される。画像は40倍の異議レンズを用いて取得した。スケールバー、20 μm。(B) L1幼虫の発達段階における神経細胞の死体数(神経毒性mec-4(u231)またはdeg-3(u662)対立体を持つ100匹あたり。壊死細胞死は、未治療の卵と比較して予め調整された卵から孵化したL1幼虫で抑制される(n= 遺伝子型およびアッセイあたり100匹の動物;データは、未処理と事前に処理された場合の平均 ±S.E.M.、***P< 0.001 を表します。t-test)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:34°Cでの毎日のプレコンディショニングは、α-シヌクレインに対する神経保護を与え 、C.エレガンスのポリQ凝集体を減少させる。(Α) ヒトα-シヌクレインと共に未治療および予条件線虫を共同発現させる細胞質GFPにおける前ドーパミン作動性ニューロン(CepsおよびAES)の生存。事前調整された線虫は、未治療と比較して強化された神経保護を表示します。神経細胞体(アスタリスク)と軸索ビーズ(矢印)の残骸は、未処理の線虫(上部パネル)に見られます。相馬(アスタリスク)と神経細胞のプロセス(矢印)は、両方ともプレコンディショニング時に保存されます。20xオブジェクションレンズを使用して取得した画像で、最大強度のZ投影を示しています。取得の詳細: ブライト, 0.15.スケールバー、20 μm。ワームは、成人期の7日目に前ドーパミン作動性ニューロンのニューロン生存のために採点された。(B) 未治療および未調整のトランスジェニック線虫の頭領域において成人の4日目に検出された神経ポリQ凝集体。未治療と比較して、未治療のトランスジェニックワームは、より少ないニューロンQ40:::YFP凝集体を提示する。頭部領域の代表的な画像は、神経細胞中のポリQタンパク質凝集体を示す矢印と共に示されている。20xオブジェクションレンズを使用して取得した画像で、最大強度のZ投影を示しています。取得の詳細: ブライト, 0.0175.スケールバー、20 μm。30〜35匹の動物を、3つの独立した実験のそれぞれで条件ごとに定量した。データは平均 ±S.E.M.、***P < 0.05、ペアになっていない t-test を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: フィジーソフトウェアを使用した画像解析1. フィジーのソフトウェアで取得した画像を開く; 2. 「画像」と「色」ドロップダウンメニューから「チャンネルを分割」コマンドを選択して、画像を変換します。 3、4。 「緑のチャネル」画像を維持し、「フリーハンド選択」ツールを使用して、目的の蛍光領域(ROI;例えば、頭)を包み込みます。「分析」と「ツール」ドロップダウンメニューから「ROIマネージャ」にそれぞれのROIを追加します。 5、6。 「プロセス」と「背景を減算」を選択して、背景を50%に引きます。 7、8。 メニューコマンド「画像」、「調整」、「しきい値」を使用してしきい値を設定し、適用します。 9. 「ROIマネージャ」からそれぞれのROIを選択します。 10-12. メニューコマンド「分析」と「粒子の解析」を使用して、タンパク質凝集体の数を分析します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬 | レシピ | |
| 2%アガロースパッド | 1. 円筒形ガラスビーカーでアガロースの0.5gを量る。 | |
| 2. M9バッファを25 mL追加します。 | ||
| 3. 沸騰に近づくまで電子レンジで熱します。取り出し、ピペットチップでかき混ぜ、再び沸騰させます。アガロースが溶解するまで繰り返します。 | ||
| 4. ベンチに空の顕微鏡スライドを置きます。 | ||
| 5. スライドの中央に、新鮮な2%アガロース溶液の滴(〜50μL)を入れます。 | ||
| 6. 2つ目の顕微鏡スライドを取り、アガロースドロップの上に置きます。落としを平らにするためにそっと押し下げます。 | ||
| 7. アガロースを30秒間硬化させ、上顕微鏡をそっと取り出します。 | ||
| 8. アガロースパッドは約5分以内に乾燥を開始するので、すぐにサンプル調製を進めます。 | ||
| ヒント: 上部顕微鏡スライドをカバーとして、湿度を長く保つ(〜1時間) のままにしておきます。したがって、いくつかのアガロースパッドは、実験中に迅速に調製し、使用することができる。 | ||
| M9 バッファ | 1. KH2PO4の3g、Na2 HPO4の6g、1LのNaClの5gの蒸留水とオートクレーブを溶解する。2 | |
| 2. 冷却し、1 M MgSO4 (滅菌) の 1 mL を追加します。 | ||
| 3. M9バッファーを4°Cに保存します。 | ||
| 線虫成長培地(NGM)寒天プレート | 1. 3 g の NaCl、2.5 g のバクトペプトン、0.2 g のストレプトマイシン、寒天 17 g、蒸留水 900 mL を加えます。オートクレーブ。 | |
| 2. 55~60°Cに冷却します。 | ||
| 3. 1 mLのコレステロールストック溶液、1 M CaCl2の1 mL、1 M MgSO4の1 mL、ナイスタチンストック溶液の1 mL、25 mLの無菌1 Mリン酸緩衝液、pH 6.0、および1 Lまでの蒸留無菌水を加える。 | ||
| 4. ピペット 10 mL のペトリ皿あたり培地を固めます。 | ||
| 5. 使用するまで4°Cでプレートを保管します。 | ||
表1:試薬用の推奨レシピ 提示されたプロトコルで使用されるすべての試薬のレシピは、ここに概説されています。
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Discussion
ここでは、年齢依存性神経変性を調査するいくつかの汎用性の高いC.エレガンスモデルの成長、同期および顕微鏡検査のための広くアクセス可能な方法論を紹介し、説明する。特に、過活性化イオンチャネル誘導性壊死およびタンパク質凝集誘発神経毒性,,1、2、3、4、5、7、9、10、112,3を用いて、1年齢関連神経破壊の細胞および分子基盤,94,5を評価10,11し、解剖する。7
in vivo細胞死評価の手順は簡単で、どの実験室でも簡単に行うことができますが、考慮すべき重要なステップがいくつかあります。カロリー制限および飢餓は、オートファジーのような複数のストレス経路を誘発することが知られており、神経変性またはタンパク質凝集体蓄積13、15、16,16を妨げる可能性がある。13,したがって、十分に供給され、飢えのない線虫を使用する必要があります。ヒートショックプレコンディショニングは、いくつかの神経変性刺激に対する神経保護を与え、確立された細胞死変調器11,13,13として使用される。しかし、一部の変異体は長期間にわたり高温暴露の影響を受けやすい。したがって、適切な発達段階、熱ショック予備調整の年齢および持続時間は、高温に敏感である可能性のある異なる遺伝的背景を有する動物が使用される場合に、毎回実験的に決定されるべきである。経年期には、線虫腸の自己蛍光が徐々に増加することが観察される。したがって、腸領域に近いニューロン細胞の体およびプロセスは、AM101株のイメージングプロセス中に避けるべきである。頭や尾部に位置する神経細胞に焦点を当て、腸由来の自己蛍光をバイパスします。水の代わりにM9バッファーを使用してM9/レバミソームバッファーと2%アガロースパッドを生成します。M9バッファーは、微視的な可視化および分析を通して線虫が乾燥するのを防ぐ良好な浸透環境を保障する。
記載された方法論は、神経変性の線虫モデルと細胞死モジュレーターの遺伝的および薬理学的スクリーンの組み合わせが、神経回路の年齢関連障害の前例のない理解につながり、人間の健康と生活の質を促進する神経変性疾患に対する新しい治療介入の開発を後押しする可能性があることを強調している。
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Disclosures
著者らは競合する利益を宣言しない。
Acknowledgments
チャニオタキス・Mとクナキス・Kのビデオ録画と編集に感謝します。K.P.は、ギリシャ研究イノベーション財団(HFRI)と研究技術総事務局(GSRT)からの助成金を受けています。N.T.は欧州研究評議会(ERC – GA695190 – MANNA)、欧州委員会枠組みプログラム、ギリシャ教育省からの助成金によって資金提供されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
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