Summary
Ici, nous introduisons et décrivons des méthodologies largement accessibles utilisant certains modèles de nématodes polyvalents, y compris la nécrose induite par le canal ione hyperactivé et la neurotoxicité induite par l’agrégat de protéines, pour surveiller et disséquer les fondements cellulaires et moléculaires des maladies neurodégénératives associées à l’âge.
Abstract
Lutter contre les pathologies neurodégénératives humaines et gérer leur impact socio-économique omniprésent devient une priorité mondiale. Malgré leurs effets néfastes sur la qualité de la vie humaine et le système de santé, la majorité des troubles neurodégénératifs humains restent incurables et non évitables. Par conséquent, le développement de nouvelles interventions thérapeutiques contre de telles maladies devient une urgence urgente. La détérioration des circuits et de la fonction neuronales associé à l’âge est conservée évolutionnellement dans des organismes aussi divers que le ver faible Caenorhabditis elegans et les humains, ce qui signifie des similitudes dans les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. C. elegans est un modèle génétique hautement malléable, qui offre un système nerveux bien caractérisé, la transparence du corps et un répertoire diversifié de techniques génétiques et d’imagerie pour évaluer l’activité neuronale et le contrôle de la qualité pendant le vieillissement. Ici, nous introduisons et décrivons des méthodologies utilisant certains modèles de nématodes polyvalents, y compris la nécrose induite par le canal d’ion hyperactivé (p. ex., deg-3(d) et le mec-4(d)) et l’agrégat protéique (p. ex., la nécrose induite par la α-syuncleine et le poly-glutamate) pour surveiller et disséquer les fondements cellulaires et moléculaires de la rupture neuronale liée à l’âge. Une combinaison de ces modèles de neurodégénérescence animale, ainsi que des écrans génétiques et pharmacologiques pour les modulateurs de la mort cellulaire, permettra de comprendre sans précédent la dégradation de la fonction neuronale liée à l’âge et fournira des informations critiques ayant une grande pertinence pour la santé humaine et la qualité de vie.
Introduction
Au cours des deux dernières décennies, C. elegans a été largement utilisé comme un organisme modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de la mort des cellules nécrotiques. C. elegans offre un système nerveux exceptionnellement bien caractérisé et cartographié, une structure corporelle transparente et un répertoire diversifié de méthodes génétiques et d’imagerie pour surveiller la fonction cellulaire in vivo et la survie tout au long du vieillissement. Ainsi, plusieurs modèles génétiques de neurodégénérescence de C. elegans ont déjà été développés pour évaluer la viabilité neuronale. En particulier, les modèles de nématodes bien décrits et utilisés comprennent la nécrose induite par le canal d’ions hyperactif1,2,3 et la mort cellulaire déclenchée par l’agrégation accrue deprotéines 4,5,6,7,8,9,10 et coup de chaleur11,12, entre autres.
L’exposition à court terme aux températures sub létales a conféré une résistance contre la mort des cellules nécrotiques, déclenchée par un stress thermique subséquent à la fois dans les nématodes et les neurones mammifères11. Fait intéressant, le préconditionnement quotidien des nématodes à une température élevée douce protège contre la neurodégénérescence, qui est infligée par divers stimuli, tels que le déséquilibre ionique (p. ex., mec-4(u231) et/ou deg-3(u662)) et l’agrégation de protéines (p. ex., α-synucléine et polyQ40)11,13.
Ici, nous décrivons des méthodologies polyvalentes utilisant C. elegans pour surveiller et évaluer la neurodégénérescence dépendante de l’âge dans des modèles bien établis de maladies humaines, telles que la mort cellulaire déclenchée par l’excitotoxicité, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington. En outre, nous soulignons le rôle neuroprotecteur de la condition préalable à la chaleur dans plusieurs modèles de neurodégénérescence. Une combinaison de ces techniques ainsi que des écrans génétiques et/ou pharmacologiques se traduira par l’identification et la caractérisation de nouveaux modulateurs de la mort cellulaire, avec un intérêt thérapeutique potentiel.
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Protocol
1. Mort de cellules nécrotiques induites par des canaux ions hyperactifs
NOTE : Les mutations de gain-de-fonction dans la famille de gènes des degenerines, y compris le mec-4 et le dég-3 entre autres, ont comme résultats dans la génération de canaux ioniques hyperactifs déclenchant la mort des cellules nécrotiques de six neurones récepteurs tactiles requis pour la mécanosensation chez les vers3. La nécrose induite par la stimulation aberrante des dégénérines présente plusieurs similitudes mécanistes et morphologiques à l’excitotoxicité chez les mammifères. Le maintien du métabolisme énergétique et de l’homéostasie du calcium a un rôle crucial sur la survie neuronale pendant la nécrose11. Les souches suivantes peuvent être utilisées pour surveiller la mort des cellules nécrotiques déclenchées par des canaux ioniques hyperactifs, mec-4(u231)X et deg-3(u662)V.
- Entretien, synchronisation et préparation des vers mutants pour l’examen de la mort des cellules nécrotiques
- Jour 1 : Choisissez des larves L4 de mec-4(u231) ou deg-3(u662) de nématodes mutants sur les médias de croissance de Nématode (NGM; Tableau 1) plaques ensemencées avec Escherichia coli (OP50) à l’aide d’un stéréomicroscope disséquant.
- Placer 10 nématodes L4 par plaque NGM ensemencée et les cultiver à la température standard de 20 °C.
- Jour 5 : Laver les plaques avec 1 ml de tampon M9 (tableau 1) et recueillir les animaux dans un tube de 1,5 mL.
- Centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s et retirer le supernatant.
- Ajouter 0,5 mL de solution de blanchiment (7 mL de H2O, 1 mL de 5 N NaOH et 2 mL d’eau de Javel).
REMARQUE : La solution de blanchiment perd peu à peu son efficacité; par conséquent, il doit être préparé tous les jours. - Vortex et surveiller périodiquement jusqu’à ce que les vers se soient dissous.
REMARQUE : Évitez le blanchiment pendant des périodes de plus de 5 min parce que la viabilité des embryons sera affectée. - Centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s et retirer le supernatant.
- Laver deux fois le granulé (oeufs) avec 1 mL de tampon M9.
- Après le lavage, resuspendez les œufs dans 200 μL de tampon M9 et incuber pendant 25 min à 34 °C dans un bain d’eau.
- Maintenir un groupe distinct d’échantillons témoins (oeufs) à 20 °C.
- Pipette 100 μL d’œufs témoins ou traités par choc thermique et placez-les sur des plaques NGM non ensemencées. Chaque assiette contient au moins 100-200 œufs.
- Incubé les œufs à 20 °C jusqu’à l’éclosion.
- Le montage des larves de L1 pour examen à l’aide d’un contraste différentiel d’interférence (DIC; Nomarsky) microscopie
- Préparer 2% de coussinets agarose.
- Utilisez 1 mL de tampon M9 pour laver les plaques et recueillir les nématodes des larves de L1 dans des tubes de 1,5 mL.
- Centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s.
- Retirer le supernatant et conserver le granulé (nématodes).
- Ajouter 100 μL de tampon M9/levamisole de 20 mM pour anesthésier les nématodes.
REMARQUE : Évitez l’azide de sodium comme anesthésique. L’azide de sodium déclenche des dommages mitochondriaux et un stress oxydatif conduisant éventuellement à l’induction de la mort cellulaire - Pipette 10 μL de tampon M9/levamisole contenant des vers L1 et les monter sur des coussinets d’agarose à 2 % (tableau 1).
- Placez délicatement un couvercle sur le dessus de l’échantillon.
REMARQUE : Sceller le couvercle avec du vernis à ongles pour préserver l’humidité tout au long du processus d’imagerie. - Observer les vers à l’aide d’un contraste d’interférence différentielle (DIC; Nomarsky) microscopie.
- Score neurodégénérescence des six neurones récepteurs tactiles en comptant les cellules avec l’apparence vacuolated caractéristique par nématode.
2. Neurodégénérescence induite par l’agrégat protéique
REMARQUE : Les souches suivantes peuvent être utilisées pour étudier la neurotoxicité induite par les agrégats protéiques : (A) surexpression de l’α-synucléine humaine dans les neurones dopaminergiques, UA44: Est[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] et (B) surexpression de la protéine de polyglutamine humaine (PolyQ) pan-neuronally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
- Entretien, synchronisation et préparation de nématodes transgéniques pour l’essai de neurodégénérescence
- Utilisez un stéréomicroscope disséquant pour surveiller le développement et la croissance de C. elegans.
- Jour 1 : Synchronisez la population de nématodes transgéniques en cueillant et en transférant 15 à 20 larves de L4 de chaque souche sur des plaques de NGM fraîchement ensemencées op50.
REMARQUE : Utilisez au moins trois plaques de chaque souche par condition. - Incuber et laisser pousser les nématodes à la température standard de 20 °C.
- Jour 2 : Effectuer des conditions préalables quotidiennes pendant 30 minutes en transférant les plaques dans un incubateur réglé à 34 °C. Ensuite, renvoyez les nématodes préconditionnés à la température standard de 20 °C.
REMARQUE : Différents milieux génétiques peuvent être sensibles à la température élevée pendant de longues périodes d’exposition. - (A) Si l’étude de la surexpression de l’homme α-synucléine dans les neurones dopaminergiques, UA44: Est[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: le jour 9, surveiller 7 jours-vieux nématodes transgéniques pour la mort des cellules neuronales dopaminergiques.
- (B) Si l’étude de la surexpression de la protéine de polyglutamine humaine (PolyQ) pan-neuronalally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: le jour 5, mesurer les agrégats neuronaux PolyQ dans la région de la tête des animaux transgéniques 4 jours exprimant Q40::YFP.
- Montage des échantillons pour examen microscopique
- Préparer 2% de coussinets agarose (Tableau 1).
- Ajouter 10 μL de 20 mM M9/levamisole goutte tampon au centre de la garniture agarose.
- Choisissez les nématodes transgéniques respectifs et transférez-les dans une goutte de M9/levamisole.
REMARQUE : Placez 20 à 30 nématodes par goutte. - Placez délicatement un couvercle sur le dessus de l’échantillon.
REMARQUE : Sceller le couvercle avec du vernis à ongles pour préserver l’humidité tout au long du processus d’imagerie. - Procéder à l’examen microscopique des échantillons respectifs.
- Processus d’acquisition et analyse de données des nématodes transgéniques co-exprimant la GFP α-synucléine et cytosolique dans les neurones dopaminergiques
- Utilisez un microscope à épifluorescence combiné à une caméra (p. ex., EVOS FL Auto 2).
- Détecter et capturer des images z-stack de la région de la tête à grossissement 20x.
- Enregistrez et collectez les images de projection d’intensité maximale.
- Procédez à l’analyse des images acquises.
- Examiner les vers transgéniques pour la neurodégénérescence en marquant les caractéristiques cellulaires suivantes, (i) la perte de fluorescence des neurones exprimant GFP sous le promoteur de dat-1, (ii) neurones montrant le bêlement soma et/ou axonal, les excroissances ou la perte dendritique.
- Importer et analyser les données à l’aide d’un logiciel (p. ex., Excel).
3. Processus d’acquisition et analyse de données des nématodes transgéniques exprimant le PolyQ40 pan-neuronal fusionné avec YFP
- Utilisez un microscope à épifluorescence combiné à une caméra (p. ex., EVOS FL Auto 2).
- Détecter et capturer des images z-stack de la région de la tête à grossissement 20x.
- Enregistrez et collectez les images de projection d’intensité maximale.
- Procéder à l’analyse des images acquises à l’aide du logiciel Fidji.
- Images ouvertes avec fidji programme14.
- Sélectionnez Commande Split Channels via le menu déroulant Image et Couleur.
REMARQUE : Conservez l’image du canal vert. - Utilisez l’outil de sélection à main levée pour définir manuellement la région fluorescente d’intérêt (ROI, p. ex., tête).
- Ajoutez le roi respectif dans le gestionnaire de retour sur investissement via le menu déroulant Analyser et outils.
- Soustrayez l’arrière-plan à 50 % en sélectionnant Processus et Soustraire l’arrière-plan.
- Configurer et appliquer des valeurs de seuil via la commande de menu Image | Ajuster | Seuil. Conservez et définissez les mêmes valeurs de seuil tout au long de l’analyse d’image de l’ensemble de l’expérience.
- Sélectionnez le ROI respectif dans le Gestionnaire de retour sur investissement.
- Analyser le nombre d’agrégats de protéines à l’aide de la commande de menu Analyser et analyser les particules.
- Répétez les étapes 3.5-3.12 pour chaque image acquise.
- Copiez les valeurs d’affichage de la fenêtre Résultats séparé.
- Collez/importez et analysez les résultats à l’aide d’un package logiciel.
4. Analyse statistique du rapport
- Utilisez au moins 30 nématodes pour chaque condition expérimentale. Effectuer trois répliques biologiques.
- Utiliser un logiciel d’analyse statistique pour effectuer le test t-étudiant(comparaison entre deux groupes) ou ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour l’analyse statistique avec p < 0,05 comme significatif.
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Representative Results
Mort cellulaire nécrotique induite par des canaux ions hyperactifs
À l’aide des procédures présentées ici, les embryons mutants mec-4(u231) et deg-3u662) ont été incubés pendant 25 min à 34 °C ou conservés à la température normale de 20 °C. Lors de l’éclosion, le nombre de cadavres de cellules neuronales a été déterminé au stade larvaire L1 des deux groupes. La mort des cellules nécrotiques est diminuée chez les nématodes qui ont éclos à partir d’œufs sous-titrés par choc thermique (figure 1A-1B).
Neurodégénérescence induite par l’agrégat de protéines
Les nématodes transgéniques surexprimant (A) l’α-synucléine humaine et le GFP cytoplasmique dans les neurones dopaminergiques et (B) la protéine de polyglutamine humaine (PolyQ) fusionnée avec YFP pan-neuronalally, ont été exposés quotidiennement pendant 30 min à 34 °C. Le choc thermique favorise la neuroprotection contre la mort cellulaire induite par la synucléine dans les hermaphrodites adultes de 7 jours (figure 2A) et diminue les agrégats de protéines Q40::YFP dans la région de tête des adultes de 4 jours (figure 2B et figure 3).
Figure 1 : Nécrose induite par le canal d’ions hyperactif. (A) Image de microscopie de DIC représentative de la larve mec-4(u231) L1, avec des pointes de flèche indiquant des vacuoles nécrotiques caractéristiques. Au stade précoce des noyaux gonflés de neurodégénérescence sont affichés dans les cellules. Image a été acquise à l’aide d’un objectif d’objection 40x. Barre d’échelle, 20 μm. (B) Nombre de cadavres de cellules neuronales au stade larvaire L1 du développement, par 100 animaux portant les allèles neurotoxiques mec-4(u231) ou deg-3(u662). La mort des cellules nécrotiques est supprimée chez les larves de L1 éclos à partir d’œufs préconditionnés par rapport à leurs homologues non traités (n= 100 animaux par génotype et test; Les données représentent la moyenne ±S.E.M., ***P< 0,001 pour les données non traitées par rapport aux conditions préalables; t-test) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Le préconditionnement quotidien à 34 °C confère une neuroprotection contre l’α-synucléine et diminue les agrégats polyQ dans C. elegans. (Α) Survie des neurones dopaminergiques antérieurs (CEPs et ADE) dans les nématodes non traités et préconditionnés co-exprimant le GFP cytoplasmique avec l’α-synucléine humaine. Les nématodes préconditionnés affichent la neuroprotection améliorée comparée à la neuroprotection non traitée. Des restes de corps de cellules neuronales (astérisques) et de perles axonales (pointes de flèche) sont observés dans des nématodes non traités (panneau supérieur). Les deux soma (astérisques) et les processus neuronaux (pointes de flèche) sont préservés sur condition préalable. Images acquises à l’aide d’une lentille d’objection 20x et représentent l’intensité maximale z-projection. Détails de l’acquisition : Bright, 0,15. Barre d’échelle, 20 μm. Des vers ont été marqués pour la survie neuronale des neurones dopaminergiques antérieurs le septième jour de l’âge adulte. (B) Agrégats polyQ neuronaux détectés le quatrième jour de l’âge adulte dans la région de tête des nématodes transgéniques non traités et préconditionnés. Les vers transgéniques préconditionnés présentent moins d’agrégats neuronaux Q40::YFP par rapport aux agrégats non traités. Des images représentatives de la région de la tête sont montrées avec des pointes de flèche indiquant des agrégats de protéines polyQ dans les cellules neuronales. Images acquises à l’aide d’une lentille d’objection 20x et représentent l’intensité maximale z-projection. Détails de l’acquisition: Bright, 0.0175. Barre d’échelle, 20 μm. 30-35 animaux ont été quantifiés par condition dans chacune des trois expériences indépendantes. Les données représentent la moyenne ±S.E.M., ***P < 0,05, t-test non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse d’images à l’aide du logiciel Fidji. 1. Ouvrir une image acquise avec le logiciel Fidji; 2. Sélectionnez la commande « Canal fractionné » via le menu déroulant « Image » et « Couleur » pour convertir l’image ; 3, 4. Conservez l’image de « canal vert » et, à l’aide de l’outil de « sélection à main levée », enragez la région fluorescente d’intérêt (ROI, p. ex., tête). Ajoutez le roi respectif dans le menu déroulant « Gestionnaire de roi » via « Analyser » et « Outils » ; 5, 6. Soustrayez l’arrière-plan à 50 % en sélectionnant « Processus » et « Soustraire l’arrière-plan » ; 7, 8. Configurer et appliquer des valeurs de seuil via la commande de menu « Image », « Ajuster » et « Seuil » ; 9. Sélectionnez le roi respectif du « Gestionnaire du ROI » ; 10-12. Analyser le nombre d’agrégats protéiques à l’aide de la commande de menu « Analyser » et « Analyser les particules ». Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Réactif | Recette | |
| 2% de coussinets agarose | 1. Peser 0,5 g d’agarose dans un bécher en verre cylindrique. | |
| 2. Ajouter 25 mL de tampon M9. | ||
| 3. Chauffer au micro-ondes jusqu’à ce qu’il soit près de l’ébullition. Sortir, remuer avec une pointe de pipette et faire bouillir à nouveau. Répéter jusqu’à ce que l’agarose soit dissoute. | ||
| 4. Placez une lame de microscope vide sur le banc. | ||
| 5. Déposer une goutte (~ 50 μL) de solution agarose fraîche de 2% au milieu de la glissière. | ||
| 6. Prenez une deuxième lame de microscope et placez-la sur la goutte d’agarose. Appuyez doucement vers le bas pour aplatir la goutte. | ||
| 7. Laissez l’agarose durcir pendant 30 secondes et retirez doucement la lame du microscope supérieur. | ||
| 8. Procéder immédiatement à la préparation de l’échantillon, puisque les coussinets d’agarose commenceront à sécher dans un délai d’environ 5 minutes. | ||
| Conseil : Laissez la lame du microscope supérieur comme couvercle pour préserver l’humidité plus longtemps (~ 1 heure). Ainsi, plusieurs coussinets d’agarose peuvent être préparés et utilisés rapidement pendant les expériences. | ||
| Tampon M9 | 1. Dissoudre 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl dans 1 L d’eau distillée et d’autoclave. | |
| 2. Laisser refroidir et ajouter 1 mL de 1 M MgSO4 (stérile). | ||
| 3. Stocker le tampon M9 à 4 °C. | ||
| Plaques d’agar de milieu de croissance de nématode (NGM) | 1. Mélanger 3 g de NaCl, 2,5 g de bactopeptone, 0,2 g de streptomycine, 17 g d’agar et ajouter 900 mL d’eau distillée. Autoclave. | |
| 2. Laisser refroidir à 55-60 °C. | ||
| 3. Ajouter 1 mL de solution de stock de cholestérol, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de solution de stock de nystatine, 25 mL de tampon stérile de phosphate de 1 M, pH 6.0, et l’eau stérile distillée jusqu’à 1 L. | ||
| 4. Pipette 10 mL de milieu par plat Petri et laisser se solidifier. | ||
| 5. Conserver les plaques à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées. | ||
Tableau 1 : Recettes recommandées pour les réactifs utilisés. Toutes les recettes de réactifs utilisées dans le protocole présenté sont décrites ici.
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Discussion
Ici, nous introduisons et décrivons des méthodologies largement accessibles pour la croissance, la synchronisation et l’examen microscopique de certains modèles polyvalents de C. elegans étudiant la neurodégénérescence âge-dépendante. En particulier, nous évaluons et disséquons les fondements cellulaires et moléculaires de la dégradation neuronale liée à l’âge en utilisant la nécrose induite par le canal d’ions hyperactivé et la neurotoxicité induite par l’agrégat de protéines1,2,3,4,5,7,9,10,11.
Bien que les procédures décrites pour l’évaluation de la mort en cellule in vivo soient simples et puissent être facilement exécutées dans n’importe quel laboratoire, il y a quelques étapes critiques qui devraient être prises en considération. La restriction calorique et la famine sont connues pour induire de multiples voies de stress, telles que l’autophagie, qui pourraient interférer avec la neurodégénérescence ou l’accumulation d’agrégats de protéines13,15,16. Ainsi, des nématodes bien nourris et non affamés devraient être utilisés. Le choc thermique préconditionne la neuroprotection contre plusieurs stimuli neurodégénératifs et est utilisé comme modulateur de mort cellulaireétabli 11,13. Cependant, certains mutants sont sensibles à une exposition à haute température pendant de longues périodes. Ainsi, le stade de développement approprié, l’âge et la durée des conditions préalables aux chocs thermiques devraient être déterminés expérimentalement chaque fois, lorsque des animaux de différents milieux génétiques, qui pourraient être sensibles aux températures élevées, sont utilisés. Une augmentation progressive de l’autofluorescence intestinale nématode est observée pendant le vieillissement. Ainsi, les corps et les processus des cellules neuronales proches de la région intestinale doivent être évités pendant le processus d’imagerie de la souche AM101. Concentrez-vous sur les cellules neuronales, qui sont situées dans la région de la tête et/ou de la queue pour contourner l’autofluorescence dérivée de l’intestin. Utilisez le tampon M9 au lieu de l’eau pour générer un tampon M9/levamisome et des coussinets agarose de 2 %. La mémoire tampon M9 assure un environnement osmotique favorable protégeant les nématodes de l’assèchement tout au long de la visualisation et de l’analyse microscopiques.
Les méthodologies décrites soulignent que la combinaison de modèles nématodes de neurodégénérescence, ainsi que des écrans génétiques et pharmacologiques pour les modulateurs de la mort cellulaire pourrait conduire à une compréhension sans précédent de l’affaiblissement associé à l’âge des circuits neuronaux et stimuler le développement de nouvelles interventions thérapeutiques contre les troubles neurodégénératifs favorisant la santé humaine et la qualité de vie.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions Chaniotakis M. et Kounakis K. pour l’enregistrement vidéo et le montage. K.P. est financé par une subvention de la Fondation hellénique pour la recherche et l’innovation (HFRI) et du Secrétariat général de la recherche et de la technologie (GSRT). N.T. est financé par des subventions du Conseil européen de la recherche (ERC – GA695190 – MANNA), des programmes-cadres de la Commission européenne et du ministère grec de l’Éducation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
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