Summary
Her introduserer og beskriver vi allment tilgjengelige metoder som bruker noen allsidige nematodemodeller, inkludert hyperaktivert iionkanalindusert nekrose og proteinaggregatindusert nevrotoksisitet, for å overvåke og dissekere cellulære og molekylære understøttelse av aldersrelaterte nevrodegenerative sykdommer.
Abstract
Bekjempelse av menneskelige nevrodegenerative patologier og håndtering av deres gjennomgripende sosioøkonomiske innvirkning blir en global prioritet. Til tross for deres skadelige effekter på menneskets livskvalitet og helsevesenet, forblir de fleste menneskelige nevrodegenerative lidelser fortsatt uhelbredelige og ikke-forebyggelige. Derfor blir utviklingen av nye terapeutiske intervensjoner mot slike sykdommer en presserende haster. Aldersrelatert forverring av nevronale kretser og funksjon er evolusjonært bevart i organismer så forskjellige som den ydmyke ormen Caenorhabditis elegans og mennesker, noe som betyr likheter i de underliggende cellulære og molekylære mekanismer. C. elegans er en svært formbar genetisk modell, som tilbyr et godt preget nervesystem, kroppsåpenhet og et variert repertoar av genetiske og bildeteknikker for å vurdere nevronal aktivitet og kvalitetskontroll under aldring. Her introduserer og beskriver vi metoder som bruker noen allsidige nematodemodeller, inkludert hyperaktivert ionkanalindusert nekrose (f.eks. deg-3(d) og mec-4(d)) og proteinaggregat (f.eks. α-syunclein og polyglutmat)-indusert nevrotoksisitet, for å overvåke og dissekere cellulære og molekylære understøtter av aldersrelatert nevronal sammenbrudd. En kombinasjon av disse dyrenevrodeeration modeller, sammen med genetiske og farmakologiske skjermer for celle død modulatorer vil føre til en enestående forståelse av aldersrelatert sammenbrudd av nevronal funksjon og vil gi kritisk innsikt med bred relevans for menneskers helse og livskvalitet.
Introduction
I løpet av de siste to tiårene har C. elegans blitt mye brukt som modellorganisme for å undersøke molekylære mekanismer for nekrotisk celledød. C. elegans tilbyr et eksepsjonelt godt karakterisert og kartlagt nervesystem, gjennomsiktig kroppsstruktur og et variert repertoar av genetiske og bildemetoder for å overvåke in vivo cellulær funksjon og overlevelse gjennom aldring. Dermed har flere C. elegans genetiske modeller av nevrodegenerasjon allerede blitt utviklet for å vurdere nevronal levedyktighet. Spesielt, godt beskrevet og brukt nematode modeller inkluderer hyperaktiv ion kanal-indusert nekrose1,2,3 og celledød utløst av økt protein aggregering4,5,6,7,8,9,10 og heteslag11,12, blant andre.,
Kortsiktig eksponering for sub-dødelige temperaturer overdro motstand mot nekrotisk celledød, utløst av et påfølgende varmestress både i nematoder og pattedyrnevroner11. Interessant, daglig preconditioning av nematoder ved en mild forhøyet temperatur beskytter mot neurodegenerasjon, som er påført av ulike stimuli, som ionisk ubalanse (f.eks mec-4 (u231) og / eller deg-3 (u662)) og protein aggregering (f.eks α-synuclein og polyQ40)11,13.
Her beskriver vi allsidige metoder ved hjelp av C. elegans for å overvåke og evaluere aldersavhengig nevrodegenerasjon i veletablerte modeller av menneskelige sykdommer, som ekssiertoksisitetsutløst celledød, Parkinsons og Huntingtons sykdom. Videre understreker vi den nevrobeskyttende rollen som varmeforutsigelse i flere modeller av nevrodegenerasjon. En kombinasjon av disse teknikkene sammen med genetiske og/eller farmakologiske skjermer vil resultere i identifisering og karakterisering av nye celledødsmodulatorer, med potensiell terapeutisk interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nekrotiske celledødsindusert av hyperaktive iionkanaler
MERK: Gain-of-function mutasjoner i genfamilien av degeneriner, inkludert mec-4 og deg-3 blant andre, resulterer i generering av hyperaktive ionkanaler utløser nekrotisk celledød av seks berøringsreseptornevroner som kreves for mekanosensasjon i ormer3. Nekrose indusert av avvikende stimulering av degeneriner viser flere mekanistiske og morfologiske likheter med ekssantoxicity hos pattedyr. Vedlikehold av energimetabolisme og kalsium homeostase har en avgjørende rolle på nevronal overlevelse under nekrose11. Følgende stammer kan brukes til å overvåke nekrotisk celledød utløst av hyperaktive iionkanaler, mec-4 (u231) X og deg-3(u662)V.
- Vedlikehold, synkronisering og utarbeidelse av muterte ormer for undersøkelse av nekrotisk celledød
- Dag 1: Velg L4 larver av mec-4(u231) eller deg-3(u662) mutant nematoder på Nematode Growth Media (NGM; Tabell 1) plater seeded med Escherichia coli (OP50) ved hjelp av en dissekere stereomikroskop.
- Plasser 10 L4 nematoder per seeded NGM plate og vokse dem ved standardtemperatur på 20 ° C.
- Dag 5: Vask platene med 1 ml M9 buffer (Tabell 1) og samle dyrene i et 1,5 ml rør.
- Sentrifuge på 10.000 x g for 30 s og fjern supernatant.
- Tilsett 0,5 ml blekemiddel (7 ml H2O, 1 ml 5 N NaOH og 2 ml blekemiddel).
MERK: Bleking løsning gradvis mister sin effektivitet; derfor bør det være forberedt daglig. - Vortex og overvåke med jevne mellomrom til ormene er oppløst.
MERK: Unngå bleking i perioder som er lengre enn 5 minutter fordi embryoenes levedyktighet vil bli påvirket. - Sentrifuge på 10.000 x g for 30 s og fjern supernatant.
- Vask to ganger pelleten (egg) med 1 ml M9-buffer.
- Etter vask, resuspend eggene i 200 μL av M9 buffer og inkubere dem i 25 min ved 34 °C i et vannbad.
- Oppretthold en egen gruppe kontrollprøver (egg) ved 20 °C.
- Pipette 100 μL kontroll eller varmesjokkbehandlede egg og legg dem på usette NGM-plater. Hver tallerken inneholder minst 100-200 egg.
- Inkubert eggene ved 20 °C til klekking.
- Montering av L1 larver for undersøkelse ved hjelp av differensial interferenskontrast (DIC; Nomarsky) mikroskopi
- Forbered 2% agarose pads.
- Bruk 1 ml M9-buffer til å vaske platene og samle L1 larver nematoder i 1,5 ml rør.
- Sentrifuge ved 10.000 x g for 30 s.
- Fjern supernatanten og behold pelleten (nematoder).
- Tilsett 100 μL 20 mM M9/levamisolebuffer for å bedøve nematodene.
MERK: Unngå natriumazid som bedøvelse. Natriumazid utløser mitokondrieskader og oksidativt stress som fører til slutt til induksjon av celledød - Pipetter 10 μL M9/levamisole buffer som inneholder L1 ormer og montere dem på 2% agarose pads (Tabell 1).
- Plasser forsiktig en dekslerslip på toppen av prøven.
MERK: Forsegle dekkslippen med neglelakk for å bevare fuktigheten gjennom hele prosessen med bildebehandling. - Vær oppmerksom på ormer ved hjelp av differensial interferenskontrast (DIC; Nomarsky) mikroskopi.
- Score neurodegeneration av de seks berøringsreseptornevronene ved å telle celler med det karakteristiske vacuolated utseendet per nematode.
2. Protein aggregert indusert nevrodegenerasjon
MERK: Følgende stammer kan brukes til å undersøke proteinaggregater-indusert nevrotoksisitet: (A) overuttrykk av human α-synuclein i dopaminerg nevroner, UA44: Er[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] og (B) overuttrykk av humant polyglutaminprotein (PolyQ) pan-neuronalt, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
- Vedlikehold, synkronisering og fremstilling av transgene nematoder for nevrodegenerasjonsanalyser
- Bruk et dissekeresteropkop for å overvåke C. elegans utvikling og vekst.
- Dag 1: Synkroniser populasjonen av transgene nematoder ved å plukke og overføre 15-20 L4 larver av hver stamme på nyseedede NGM-plater.
MERK: Bruk minst tre plater av hver stamme per tilstand. - Inkuber og la nematodene vokse ved standardtemperatur på 20 °C.
- Dag 2: Utfør daglig prekondisjonering i 30 minutter ved å overføre platene i en inkubator satt til 34 °C. Deretter returnerer de forhåndsuttalte nematodene tilbake ved standardtemperatur på 20 °C.
MERK: Ulike genetiske bakgrunner kan være følsomme for høy temperatur i lange perioder eksponering. - (A)Ved undersøkelse av overuttrykk av human α-synuclein i dopaminerge nevroner, UA44: Er[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: på dag 9, overvåk 7 dager gamle transgene nematoder for dopaminerge nevronal celledød.
- (B)Ved undersøkelse av overuttrykk av humant polyglutaminprotein (PolyQ) pan-neuronalt, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: på dag 5, måle nevronale PolyQ aggregater i hodet regionen av 4-dagers gamle transgene dyr som uttrykker Q40::YFP.
- Montering av prøvene for mikroskopisk undersøkelse
- Forbered 2% agarose pads (Tabell 1).
- Tilsett 10 μL 20 mM M9/levamisole buffer fall i midten av agarose pad.
- Velg de respektive transgene nematodene og overfør dem i en M9/levamisole fall.
MERK: Plasser 20-30 nematoder per dråpe. - Plasser forsiktig en dekslerslip på toppen av prøven.
MERK: Forsegle dekkslippen med neglelakk for å bevare fuktigheten gjennom hele prosessen med bildebehandling. - Fortsett til mikroskopisk undersøkelse av de respektive prøvene.
- Anskaffelsesprosess og dataanalyse av transgene nematoder som uttrykker α-synuclein og cytosolisk GFP hos dopaminerge nevroner
- Bruk et epifluorescensmikroskop kombinert med et kamera (f.eks. EVOS FL Auto 2).
- Oppdag og ta bilder av hodet regionen på 20x forstørrelse.
- Lagre og samle inn projeksjonsbildene med maksimal intensitet.
- Fortsett til analysen av de oppkjøpte bildene.
- Undersøk de transgene ormene for nevrodegene ved å score følgende cellulære egenskaper, (i) tap av fluorescens fra nevroner som uttrykker GFP under promoter av dat-1, (ii) nevroner som viser soma og / eller axonal blebbing, utvekster eller dendrittisk tap.
- Importer og analyser dataene ved hjelp av en programvarepakke (f.eks. Excel).
3. Anskaffelsesprosess og dataanalyse av transgene nematoder som uttrykker pan-neuronally PolyQ40 smeltet sammen med YFP
- Bruk et epifluorescensmikroskop kombinert med et kamera (f.eks. EVOS FL Auto 2).
- Oppdag og ta bilder av hodet regionen på 20x forstørrelse.
- Lagre og samle inn projeksjonsbildene med maksimal intensitet.
- Fortsett til analysen av de oppkjøpte bildene ved hjelp av Fiji-programvare.
- Åpne bilder med Fiji program14.
- Velg Kommandoen Del kanaler via rullegardinmenyen Bilde og Farge.
MERK: Behold det grønne kanalbildet. - Bruk verktøyet for frihåndsvalg til å angi det fluorescerende interesseområdet manuelt (ROI; f.eks. hode).
- Legg til den respektive avkastningen i ROI Manager via rullegardinmenyen Analyser og verktøy.
- Trekk bakgrunnen til 50 % ved å velge Prosess og Trekk fra bakgrunn.
- Konfigurere og bruke terskelverdier via menykommandobildet | Juster | Terskel. Behold og angi de samme terskelverdiene gjennom bildeanalyse av hele eksperimentet.
- Velg den respektive avkastningen fra ROI Manager.
- Analyser antall proteinaggregater ved hjelp av menykommandoen Analyser og analyser partikler.
- Gjenta trinn 3.5-3.12 for hvert anskaffede bilde.
- Kopier visningsverdiene fra det separate resultatvinduet.
- Lim inn/ importer og analyser resultatene ved hjelp av en programvarepakke.
4. Rapport statistisk analyse
- Bruk minst 30 nematoder for hver eksperimentelle tilstand. Utfør tre biologiske replikeringer.
- Bruk statistisk analyseprogramvare til enten å utføre student t-test (sammenligning mellom to grupper) eller ANOVA (sammenligning mellom flere grupper) for statistisk analyse med p < 0,05 som signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nekrotisk celledød-indusert av hyperaktive ionkanaler
Ved hjelp av prosedyrene som presenteres her, ble mec-4(u231) og deg-3u662) muterte embryoer enten inkubert i 25 min ved 34 °C eller oppbevares ved standardtemperatur på 20 °C. Ved klekking ble antall nevronale cellelik bestemt på L1 larvalstadiet i begge gruppene. Nekrotisk celledød reduseres i nematoder som klekkes fra varmesjokkpreparerte egg (Figur 1A-1B).
Protein aggregert indusert nevrodegenerasjon
Transgene nematoder overexpressing (A) human α-synuclein og cytoplasmatisk GFP i dopaminerge nevroner og (B) humant polyglutaminprotein (PolyQ) smeltet sammen med YFP pan-neuronally, ble eksponert daglig i 30 min ved 34 °C. Varmesjokkforutsettelse fremmer nevrobeskyttelse mot α-synuclein-indusert celledød hos 7-dagers voksne hermafroditter (Figur 2A) og reduserer Q40::YFP proteinaggregater i hodet regionen av 4-dagers gamle voksne (Figur 2B og figur 3).
Figur 1: Hyperaktiv ionkanalindusert nekrose. (A)Representativt DIC-mikroskopibilde av mec-4(u231) L1 larve, med pilspisser som indikerer karakteristiske nekrotiske vakuoler. I begynnelsen av nevrodegenerasjonen vises hovne kjerner i celler. Bildet ble kjøpt ved hjelp av en 40x innvendingslinse. Vektlinje, 20 μm. (B)Antall nevronale cellelik på L1 larval stadium av utvikling, per 100 dyr bærer nevrotoksisk mec-4 (u231) eller deg-3 (u662) alleler. Nekrotisk celledød undertrykkes i L1 larver klekket fra preparerte egg sammenlignet med ubehandlede kolleger (n = 100 dyr per genotype og analyse; Data representerer gjennomsnitt ±S.E.M., ***P< 0,001 for ubehandlet kontra betinget; t-test) Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Daglig forutsetning ved 34 °C gir nevrobeskyttelse mot α-synuclein og reduserer polyQ-aggregater i C. elegans. (Α) Overlevelse av fremre dopaminerge nevroner (CEPer og AdEer) i ubehandlede og preparerte nematoder som uttrykker cytoplasmatisk GFP sammen med den menneskelige α-synuclein. Preparerte nematoder viser forbedret nevrobeskyttelse sammenlignet med ubehandlet. Rester av nevronale cellelegemer (stjerner) og axonal beading (pilspisser) er sett i ubehandlede nematoder (topppanel). Både soma (stjerner) og nevronale prosesser (pilspisser) er bevart ved forutsetning. Bilder ervervet ved hjelp av en 20x innvendingslinse og skildrer maksimal intensitet z-projeksjon. Oppkjøp detaljer: Bright, 0.15. Vektlinje, 20 μm. Ormer ble scoret for nevronal overlevelse av de fremre dopaminerge nevronene på den syvende dagen i voksen alder. (B) Neuronal polyQ aggregater oppdaget på den fjerde dagen av voksen alder i hodet regionen ubehandlet og predisjonerte transgene nematoder. Forutsetninger transgene ormer presenterer mindre nevronale Q40::YFP aggregater sammenlignet med ubehandlede. Representative bilder av hodeområdet vises med pilspisser som indikerer polyQ proteinaggregater i nevronale celler. Bilder ervervet ved hjelp av en 20x innvendingslinse og skildrer maksimal intensitet z-projeksjon. Oppkjøp detaljer: Bright, 0.0175. Vektlinje, 20 μm. 30-35 dyr ble kvantifisert per tilstand i hvert av tre uavhengige eksperimenter. Data representerer gjennomsnitt ±S.E.M., ***P < 0,05, ikke-testet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bildeanalyse ved hjelp av Fiji-programvare. 1. Åpne et ervervet bilde med Fiji-programvare; 2. Velg "Split kanal" kommando via "Image" og "Color" rullegardinmenyen for å konvertere bildet; 3, 4. Hold "grønn kanal" bilde og ved hjelp av "freehand selection" verktøyet, pakke fluorescerende område av interesse (ROI; f.eks hodet). Legg til den respektive avkastningen i "ROI Manager" via "Analyser" og "Verktøy" rullegardinmenyen; 5, 6. Trekk bakgrunnen til 50 % ved å velge "Prosess" og "Trekk fra bakgrunn"; 7, 8. Sett opp og bruk terskelverdier via menykommandoen "Bilde", "Juster" og "Terskel"; 9. Velg den respektive avkastningen fra "ROI Manager"; 10-12. Analyser antall proteinaggregater ved hjelp av menykommandoen "Analyser" og "Analyser partikler". Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagent | Oppskrift | |
| 2% agarose pads | 1. Vei 0,5 g agarose i et sylindrisk glassbeger. | |
| 2. Tilsett 25 ml M9-buffer. | ||
| 3. Varm i en mikrobølgeovn til den er nær koking. Ta ut, rør med en pipettespiss og kok igjen. Gjenta til agarose er oppløst. | ||
| 4. Plasser et tomt mikroskoplysbilde på benken. | ||
| 5. Sett en dråpe (~ 50 μL) med frisk 2% agarose løsning i midten av lysbildet. | ||
| 6. Ta et andre mikroskop lysbilde og plassere den på toppen av agarose slipp. Trykk forsiktig ned for å flate dråpen. | ||
| 7. La agarose herdes i 30 sekunder og fjern forsiktig det øverste mikroskopet. | ||
| 8. Fortsett umiddelbart med prøveforberedelsen, siden agarose pads vil begynne å tørke innen ca. 5 minutter. | ||
| Tips: La det øverste mikroskopet gli som et deksel for å bevare fuktigheten lenger (~ 1 time). Dermed kan flere agarose pads tilberedes og brukes raskt under forsøkene. | ||
| M9 buffer | 1. Oppløs 3 g KH2PO4,6 g Na2HPO4,5 g NaCl i 1 L destillert vann og autoklav. | |
| 2. La avkjøles og tilsett 1 ml 1 M MgSO4 (steril). | ||
| 3. Oppbevar M9-bufferen ved 4 °C. | ||
| Nematode vekst medium (NGM) agar plater | 1. Bland 3 g NaCl, 2,5 g bactopeptone, 0,2 g streptomycin, 17 g agar og tilsett 900 ml destillert vann. Autoklav. | |
| 2. La avkjøles til 55-60 °C. | ||
| 3. Tilsett 1 ml kolesterollageroppløsning, 1 ml steril 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4,1 ml nystatinlagerløsning, 25 ml steril 1 M fosfatbuffer, pH 6.0 og destillert sterilt vann opp til 1 L. | ||
| 4. Pipette 10 ml medium per petriskål og la det stivne. | ||
| 5. Oppbevar platene ved 4 °C til de er i bruk. | ||
Tabell 1: Anbefalte oppskrifter for reagenser som brukes. Alle reagenser oppskrifter som brukes i den presenterte protokollen er skissert her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her introduserer og beskriver vi allment tilgjengelige metoder for vekst, synkronisering og mikroskopisk undersøkelse av noen allsidige C. elegans-modeller som undersøker aldersavhengig nevrodegenerasjon. Spesielt vurderer og dissekere cellulære og molekylære understøtter av aldersrelatert nevronal sammenbrudd ved hjelp av hyperaktivert i hovedsako-indusert nekrose og proteinaggregatindusert nevrotoksisitet1,,,2,3, 4,,5,7,9,10,11.4
Selv om de beskrevne prosedyrene for in vivo celle dødsvurdering er enkle og lett kan utføres i ethvert laboratorium, er det noen kritiske skritt som bør tas i betraktning. Kaloribegrensning og sult er kjent for å indusere flere stressveier, for eksempel autofagi, som kan forstyrre nevrodegenerasjon eller proteinaggregater akkumulering13,,15,16. Dermed bør godt matet og ikke-sultede nematoder brukes. Varmesjokk preconditioning confers neuroprotection mot flere nevrodegenerative stimuli og brukes som en etablert celle død modulator11,13. Noen mutanter er imidlertid utsatt for høy temperatureksponering i lange perioder. Dermed bør riktig utviklingsstadium, alder og varighet av varmesjokkforutring bestemmes eksperimentelt hver gang, når dyr med forskjellig genetisk bakgrunn, som kan være følsomme for høye temperaturer, brukes. En gradvis økning av nematode intestinal autofluorescens observeres under aldring. Dermed bør nevronale cellelegemer og prosesser nær tarmområdet unngås under bildeprosessen av AM101-belastning. Fokus på nevronale celler, som ligger i hodet og / eller halen regionen for å omgå tarmen-avledet autofluorescens. Bruk M9-buffer i stedet for vann for å generere M9/levamisome buffer og 2 % agarose pads. M9 buffer sikrer et gunstig osmotisk miljø som beskytter nematodene fra å tørke ut gjennom den mikroskopiske visualiseringen og analysen.
De beskrevne metodene understreker at kombinasjonen av nematoder modeller av nevrodegenerasjon, sammen med genetiske og farmakologiske skjermer for celledød modulatorer kan føre til en enestående forståelse av aldersrelatert svekkelse av nevronale kretser og øke utviklingen av nye terapeutiske intervensjoner mot nevrodegenerative lidelser fremme menneskers helse og livskvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Chaniotakis M. og Kounakis K. for videoopptak og redigering. K.P. er finansiert av et stipend fra Hellenic Foundation for Research and Innovation (HFRI) og General Sekretariatet for forskning og teknologi (GSRT). N.T. er finansiert av tilskudd fra Det europeiske forskningsrådet (ERC – GA695190 – MANNA), Eu-kommisjonens rammeprogrammer og det greske kunnskapsdepartementet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
