Summary
Beskrevet her er en metode for å utnytte sebrafisk embryoer for å studere evnen til funksjonaliserte nanopartikler for å målrette menneskelige kreftceller in vivo. Denne metoden gjør det mulig å evaluering og valg av optimale nanopartikler for fremtidig testing hos store dyr og i kliniske studier.
Abstract
Utvikling av nanopartikler som er i stand til å oppdage, målrette og ødelegge kreftceller, er av stor interesse innen nanomedisin. In vivo dyremodeller er nødvendig for å bygge bro over nanoteknologien til sin biomedisinske applikasjon. Musen representerer den tradisjonelle dyremodellen for preklinisk testing; Imidlertid er mus relativt dyre å beholde og har lange eksperimentelle sykluser på grunn av begrenset avkom fra hver mor. Sebrafisken har dukket opp som et kraftig modellsystem for utviklings- og biomedisinsk forskning, inkludert kreftforskning. Spesielt på grunn av sin optiske gjennomsiktighet og raske utvikling, er sebrafiskembryoer godt egnet for sanntids in vivo overvåking av oppførselen til kreftceller og deres interaksjoner med deres mikromiljø. Denne metoden ble utviklet for å sekvensielt introdusere humane kreftceller og funksjonaliserte nanopartikler i gjennomsiktige Casper sebrafisk embryoer og overvåke in vivo anerkjennelse og målretting av kreftcellene ved nanopartikler i sanntid. Denne optimaliserte protokollen viser at fluorescerende merkede nanopartikler, som er funksjonalisert med folatgrupper, spesifikt kan gjenkjenne og målrette metastatiske humane livmorhalsepitelkreftceller merket med en annen fluorokrom. Anerkjennelse og målretting prosessen kan oppstå så tidlig som 30 min etterinjeksjon av nanopartikler testet. Hele eksperimentet krever bare avl av noen få par voksen fisk og tar mindre enn 4 dager å fullføre. Videre mangler sebrafiskembryoer et funksjonelt adaptivt immunsystem, slik at engraftment av et bredt spekter av menneskelige kreftceller. Derfor gjør nytten av protokollen som er beskrevet her, testing av nanopartikler på ulike typer humane kreftceller, noe som letter valg av optimale nanopartikler i hver bestemt kreftkontekst for fremtidig testing hos pattedyr og klinikken.
Introduction
Utviklingen av nanopartikler som er i stand til å oppdage, målrette og ødelegge kreftceller er av stor interesse for både fysikere og biomedisinske forskere. Fremveksten av nanomedisin førte til utvikling av flere nanopartikler, for eksempel de som konjugert med målretting av ligander og / eller kjemoterapeutiske legemidler1,2,3. De ekstra egenskapene til nanopartikler muliggjør deres interaksjon med det biologiske systemet, sensing og overvåking av biologiske hendelser med høy effektivitet og nøyaktighet sammen med terapeutiske applikasjoner. Gull og jernoksid nanopartikler brukes hovedsakelig i computertomografi og magnetisk resonans imaging applikasjoner, henholdsvis. Mens de enzymatiske aktivitetene til gull- og jernoksidnanopartikler tillater påvisning av kreftceller gjennom kolorimetriske analyser, er fluorescerende nanopartikler godt egnet for in vivobildeapplikasjoner4. Blant dem er ultrahøye fluorescerende nanopartikler spesielt gunstige, på grunn av deres evne til å oppdage kreft tidlig med færre partikler og redusert toksisitet5.
Til tross for disse fordelene krever nanopartikler eksperimentering ved hjelp av in vivo dyremodeller for valg av egnede nanomaterialer og optimalisering av synteseprosessen. I tillegg, akkurat som narkotika, nanopartikler stole på dyremodeller for preklinisk testing for å bestemme deres effekt og toksisitet. Den mest brukte prekliniske modellen er musen, som er et pattedyr hvis vedlikehold kommer til en relativt høy pris. For kreftstudier brukes vanligvis enten genmodifiserte mus eller xenografted mus6,7. Lengden på disse eksperimentene strekker seg ofte fra uker til måneder. Spesielt for kreftmetastasestudier injiseres kreftceller direkte i musenes sirkulasjonssystem på steder som haleårer og milt8,,9,,10. Disse modellene representerer bare sluttfasen av metastase når tumorceller ekstravasate og kolonisere fjerne organer. Videre, på grunn av synlighetsproblemer, er det spesielt utfordrende å overvåke tumorcellemigrasjon og nanopartikkelmålretting av tumorceller hos mus.
Sebrafisken (Danio rerio) har blitt et kraftig virveldyrsystem for kreftforskning på grunn av sin høye fecundity, lave kostnader, rask utvikling, optisk åpenhet og genetiskebevaringer 11,12. En annen fordel med sebrafisken over musemodellen er befruktningen av fiskeeggene ex utero, noe som gjør at embryoene kan overvåkes gjennom hele utviklingen. Embryonisk utvikling er rask i sebrafisk, og innen 24 timer etter befruktning (hpf), har virveldyrkroppsplanet allerede dannet13. Ved 72 hk klekket egg fra chorion, og går fra embryonale til yngelstadiet. Gjennomsiktigheten av sebrafisk, Casper belastning spesielt14,gir en unik mulighet til å visualisere migrering av kreftceller og deres anerkjennelse og målretting av nanopartikler i et levende dyr. Til slutt utvikler sebrafisk sitt medfødte immunsystem med 48 hkf, med det adaptive immunsystemet som henger etter og bare blir funksjonell ved 28 dager etter befruktning15. Denne gangen gapet er ideelt for transplantasjon av ulike typer menneskelige kreftceller i sebrafisk embryoer uten å oppleve immunavstøt.
Beskrevet her er en metode som utnytter gjennomsiktighet og rask utvikling av sebrafisk for å demonstrere anerkjennelse og målretting av menneskelige kreftceller ved fluorescerende nanopartikler in vivo. I denne analysen ble humane livmorhalskreftceller (HeLa-celler) genetisk konstruert for å uttrykke et rødt fluorescerende protein injisert i det vaskulariserte området i perivitellinhulen til 48 hpf embryoer. Etter 20-24 timer hadde HeLa-cellene allerede spredt seg gjennom embryoene gjennom fiskesirkulasjonssystemet. Embryoer med tilsynelatende metastase ble mikroinjisert med ~ 0,5 nL av en nanopartikkelløsning rett bak øyet, hvor den rike kapillærsengen ligger. Ved hjelp av denne teknikken kan de ultrahøye fluorescerende silikananopartikler målrette HeLa-celler så raskt som 20-30 min postinjeksjon. På grunn av sin enkelhet og effektivitet representerer sebrafisken en robust in vivo-modell for å teste en rekke nanopartikler for deres evne til å målrette mot bestemte kreftceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Boston University School of Medicine under protokollen #: PROTO201800543.
1. Generasjon av Casper sebrafisk embryoer
- Velg voksen Casper fisk som er minst 3 måneder for naturlig avl for å generere gjennomsiktige Casper sebrafisk embryoer.
- Fyll to-kammer parring tanker med fiskevann om kvelden, skille de øvre tankene ved hjelp av skillevegger, plasser en mannlig fisk i den ene siden av kammeret og en eller to kvinnelige fisk inn i den andre siden av kammeret, og la fisken separere over natten av skillevegger.
- Trekk ut skilleveggen neste morgen klokken 08:00 når lysene er på. Tilsett kunstige berikelsesplanter og vipp toppkammeret litt for å skape et grunt vannområde. La fisken avle i 3-4 timer.
- Løft de øverste kamrene i parringstankene som inneholder fisken og returner dem til sine opprinnelige tanker.
- Samle egg som ligger i de nederste kamrene ved å helle vannet gjennom et nettingnett. Overfør egg til en steril petriskål med en tetthet som ikke er større enn 200 egg per tallerken. Fjern eventuelle døde eller ubefruktede egg og fyll parabolen 2/3 full med ferskt fiskevann.
MERK: Befruktede og sunne egg skal være gjennomskinnelig og rund. Eventuelle egg som er overskyet, hvit eller vansiret bør fjernes. Fiskevann hentes fra fisketanker i fiskeanlegget. - Inkuber embryoer i inkubatoren ved 28,5 °C over natten.
- Bleke embryoene neste morgen ved hjelp av standardprotokollen som beskrevet i The Zebrafish Book16, og sett embryoene tilbake til inkubatoren (valgfritt trinn).
- Ta de 24 hpf embryoene ut av inkubatoren om ettermiddagen og avsky embryoene ved hjelp av pronase.
- Fjern så mye fiskevann som mulig fra embryoene i petriskålen og tilsett noen dråper pronaseløsning (1 mg / ml i fiskevann) til parabolen. Virvle petriskålen forsiktig. Når oppgavene viser tegn på oppløsning, pipette embryoene opp og ned et par ganger for å bryte ned chorions for å frigjøre embryoene.
- Tilsett ferskt fiskevann umiddelbart i petriskålen for å avslutte prosessen når et flertall av embryoene er ute av chorions. Skyll embryoene 3x mer ved hjelp av fiskevann for å fjerne de flytende chorions. Returner embryoene til inkubatoren.
2. Fremstilling av humane kreftceller for transplantasjon
- Sett inkubatortemperaturen til nøyaktig 35,5 °C. Overvåk inkubatoren for å sikre en konsistent og stabil temperatur ved hjelp av et termometer inne i inkubatoren.
- Autoklav 1 L fiskevann i en glassflaske. Lag en 3% agarose løsning ved å legge til 3 g elektroforese-grade agarose til 100 ml autoklavet fiskevann og mikrobølge til agarose er helt oppløst.
- Hell varm agaroseløsning i en petriskål til den er 3/4 full. Plasser mikroinjeksjonsformen på agarose. Sørg for at formen ikke er i kontakt med bunnen av petriskålen og ingen bobler dannes under.
- La oppløsningen stivne og fjern forsiktig formen fra platen. Fyll platen med autoklavet fiskevann og oppbevar platen ved 4 °C. Førvarm agaroseplaten og fiskevannet i 35,5 °C inkubatoren før høsting av HeLa-celler.
- Trekk 1,0 mm O.D. x 0,78 mm borosilikatglasskapillærer på en pipetteavtrekker ved hjelp av følgende innstillinger: trykk ved 500, varme ved 560, trekk ved 100, hastighet ved 100 og tid/forsinkelse ved 200. Oppbevar nåler på kitt i en stor petriskål som har blitt tørket med et etanolhåndkle.
FORSIKTIG: Trukket nåler er svært skarpe og skjøre. Vær forsiktig når du håndterer. - Forbered en lagerløsning av trikainmetansulfonat (MS222, 4 mg/ml) ved å oppløse MS222 i autoklavet fiskevann. Vortex i god tid før bruk. Fortynn MS222 lageroppløsning 1:100 i fiskevann (f.eks. tilsett 200 μL MS222 lagerløsning til 20 ml fiskevann til en endelig konsentrasjon på 40 μg/ml) for å bedøve embryoer for følgende prosedyrer.
- Kultur hLabel HeLa celler ved å transdusere dem med PLenti6.2_miRFP670 lentivirus ved hjelp av protokollen beskrevet17. Harvest RFP + HeLa celler 30 min-1 h før transplantasjon.
MERK: Humane HeLa-celler har blitt dyrket i en vevskultur inkubator opptil 70% samløpet i komplett vekstmedium (DMEM medium med 10% FBS) ved 37 ° C supplert med 5% CO2.- Fjern HeLa cellemedium ved aspirasjon i en vevskultur hette. Skyll kort cellelaget med steril PBS for å fjerne alle spor av serumet.
- Tilsett 3,0 ml steril Trypsin-EDTA-løsning i en T-75 kolbe og legg cellene tilbake i 37 °C vevskulturinkubatoren i 3-5 min for å lette enzymatisk fordøyelse. Vær oppmerksom på kolben under mikroskopet til ~80% av cellene blir suspendert.
- Tilsett 6-8 ml komplett vekstmedium i kolben. Samle cellene i et 15 ml sterilt rør ved å forsiktig pipettering. Sentrifuge ved 135 x g i 5 min.
- Aspirer de overnaturante og gjenopplivbare HeLa-cellene i 3 ml komplett vekstmedium. Gjenta vasketrinnet ovenfor 2x. Resuspend cellene i 1 ml av komplett vekst medium og telle cellene under mikroskopet ved hjelp av et hemocytometer.
- Spinn cellene ned igjen, fjern supernatant, og gjenbruk cellene i en 1,5 ml mikrocentrifuge rør med en konsentrasjon på 5 x 107 celler / ml. Hold cellene varme ved å holde røret i den ene hånden når de transporterer til fiskeanlegget.
MERK: Hold alltid cellene varme ved å oppbevare cellene inne i 35,5 °C inkubatoren før eller under injeksjon av embryoene.
3. Transplantasjon av humane kreftceller
- Rydd opp i arbeidsområdet ved hjelp av etanolhåndklær før transplantasjon (f.eks. saks, pinsett, plastpipetter, barberblad).
- Juster embryoer i sporene på agaroseplaten ved hjelp av en plastpipette. Legg embryoer på siden med fremre vendt fremover.
MERK: Pass på at fiskevannet dekker embryoene. Sett noen embryoer til side for å ikke injisere kreftceller og bruke som kontroller. - Slå på luftkilden og mikroinjektoren. Ta HeLa-celler ut av inkubatoren og pipette cellene opp og ned 20-30x ved hjelp av en P200-spiss. Legg 3 μL celleblanding umiddelbart inn i en nål ved hjelp av en gellastetips med en kuttet ende. Sett spissen forsiktig inn mot den skarpe nedre enden av nålen. Om nødvendig, rist nålen for å sikre at celleblandingen beveger seg nedover nålen for å fylle opp den skarpe enden.
- Sett kanylen inn i nåleholderen. Bruk et par pinsett til å forsiktig bryte åpne tuppen av nålen. Juster trykket og varigheten på mikroinjektoren for å skyve ut alle luftboblene inne i nålespissen. Reduser trykk- og injeksjonstiden til størrelsen på injeksjonsdråpene er ~1 nL.
- Plasser injeksjonsplaten under mikroskopet i en passende posisjon for å få eggeplommesiden av embryoer vendt mot nålen. Bedøv embryoene ved å tilsette fem dråper av den fortynnede MS222-oppløsningen (40 μg/ml).
- Plasser injektoren og la nålen berøre perivitellinhulen til hvert embryo.
- Injiser celleblandingen i embryoene i det vaskulariserte området under perivitellinhulen ved å trykke på fotpedalen.
- Bruk den ikke-dominerende hånden til å flytte injeksjonsplaten til neste embryo. Bruk den dominerende hånden til å strekke ut og trekke inn injektoren mens du trykker på fotpedalen samtidig for å fortsette injeksjonen. Pipette noen dråper sterilt fiskevann på embryoer som har blitt injisert. Når injeksjonen av alle embryoer på platen er fullført, vask embryoene av med sterilt fiskevann, legg dem på en steril petriskål og flytt dem umiddelbart til 35,5 °C inkubatoren.
- Etter 3 timer, undersøke injisert embryoer og fjerne de døde.
- Returner de levende embryoene til 35,5 °C inkubatoren og inkuber dem i 20-24 timer for å la HeLa-cellene spre seg fra injeksjonsstedet til andre deler av kroppen.
MERK: Embryoer oppbevares i 35,5 °C inkubator for å tillate overlevelse og migrering av humane kreftceller fordi cellene ikke gjør det bra ved 28,5 °C, temperaturen fisken embryoer er normalt inkubert.
4. Injeksjon av nanopartikler eller kjøretøy
- Bedøve transplanterte embryoer neste morgen med fem dråper fortynnet MS222-løsning. Ikke legg til for mye MS222, fordi dette vil drepe embryoene. Under et fluorescerende mikroskop, forsiktig plukke opp embryoer med hale metastase av RFP + HeLa celler og plassere dem i en ny Petri parabolen med sterilt fiskevann.
- Gjør injeksjonsnålene som tidligere beskrevet i avsnitt 2 ved hjelp av følgende innstillinger: trykk ved 500, varme ved 645, trekk ved 60, hastighet ved 50 og tid/forsinkelse ved 100.
- Følg prosedyrene i trinn 3.1-3.3 for å justere embryoer og lastekjøretøy (f.eks. H2O) eller nanopartikkeloppløsningen i nålen.
- Injiser 0,5 nL 1 mg/ml nanopartikkeloppløsning bak øyet og fortsett injeksjonen som beskrevet i trinn 3,5-3,6 (figur 1B). Denne plasseringen bak øynene er beriket med kapillærer, slik at nanopartiklene kan komme inn i sirkulasjonen.
- Etter en lignende prosedyre, injiser kjøretøyet (f.eks. H2O) som ble brukt til å suspendere nanopartikler i embryoer med HeLa-celler transplantert og de uten (det vil si kontroller) (figur 1A, C).
- Inkuber alle injiserte embryoer ved 35,5 °C.
5. Bildebehandling og sporing av nanopartikler og kreftceller
- Undersøk injiserte embryoer under et fluorescerende mikroskop ved 0, 30, 60, 90, 120, 180 og 210 min etterinjeksjon av nanopartikler for å overvåke fordelingen i omløp og graden av kreftcellemålretting. Målretting av kreftceller av nanopartikler kan observeres så tidlig som 30 min postinjeksjon avhengig av hvilken type nanopartikkel som testes.
- Pipette 2-3 embryoer i en petriskål og immobilisere dem ved å legge til fem dråper fortynnet MS222-oppløsning (40 μg/ml). Når embryoene slutter å svømme, fjern det meste av vannet for å la embryoene ligge på sidene.
- Bruk en pipette med en tynn, myk børste festet til enden for å justere embryoene slik at de ligger på sidene med fremre vendt fremover og bare ett øye synlig.
- Bilde embryoene i røde, blå og brightfield kanaler ved lav forstørrelse (2x) for å fange hele embryoet og gjenta ved høyere forstørrelse (6.4x) for å fange haleområdet. Fokuser embryoet under den røde kanalen for å unngå blødning av nanopartikler.
MERK: Embryoene må ikke bevege seg under bildebehandling. Enhver bevegelse vil føre til uklare bilder og manglende evne til å overlappe bilder fra forskjellige kanaler. - Tilsett ferskt fiskevann til embryoene umiddelbart etter bildebehandling og returner dem til inkubatoren. Gjenta trinn 5.2-5.4 for å bilde embryoene på forskjellige tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen skjematisk i figur 1 illustrerer de generelle prosedyrene for denne studien. Gjennomsiktig Casper mannlig og kvinnelig voksen fisk ble avlet for å generere embryoer (avsnitt 1). RFP+ HeLa-celler ble injisert i det vaskulariserte området under perivitellinhulen til sebrafiskembryoene ved 48 hkf, med uinjiserte embryoer som kontroller (avsnitt 3). For personer som opplever mikroinjeksjon, er overlevelsesraten av embryoer ofte høy, med minst 50% av embryoene transplantert med kreftceller som overlever i 35,5 ° C inkubator, en temperatur suboptimal for sebrafisk embryoer, men kreves for overlevelse og migrasjon av menneskelige kreftceller. HeLa-cellene er svært invasive og kan intravasere og spre seg til embryoenes haleregion så raskt som 8 h postinjeksjon. Ved 20-24 h ettertransplantasjon, ~ 50% av embryoer transplantert viste tegn på metastatisk spredning av HeLa celler. Disse embryoene med kreftcellehalemetastaser ble valgt for nedstrøms eksperimenter. Ved 72 hk ble disse embryoene deretter injisert bak øynene enten med blå fluorescerende nanopartikler (avsnitt 4 og figur 1B) eller utelukkende med kjøretøyet som kontroller (figur 1A). Alderstilpassede embryoer injisert med nanopartikler, men uten kreftcelletransplantasjon var den andre gruppen av kontroller (figur 1C). For mer detaljert informasjon om nanopartikkelsyntese, forberedelse og karakterisering, se Peerzade et al.18.
Ved 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 min etterinjeksjon av nanopartikler ble de injiserte embryoene overvåket ved avbildning for å bestemme samspillet mellom nanopartikler med RFP + HeLa-celler, ved hjelp av kjøretøyinjisert embryoer som kontroller. Spesielt ble sebrafiskhaleområdene der RFP + HeLa-cellene hadde spredt seg til, avbildet på rød, blå og brightfield-belysning ved hjelp av et fluorescerende mikroskop (avsnitt 5). Den detaljerte karakteriseringen av de ultramright nanopartiklenes evne til å målrette xenografted kreftceller i sebrafisk over tid er vist i figur 5 av Peerzade et al.18. De røde prikkene sett i halen av embryoene er metastatiske humane livmorhalskreftceller som var synlige i både kjøretøy- og nanopartikkelinjisert embryoer (figur 2A, D; Figur 3A, D). Som forventet ble det ikke påvist spesifikke blå lysstoffsignaler i embryoer med injeksjon kun for kjøretøy (figur 2B, E). I tillegg, når bildene tatt i de røde og blå kanalene ble slått sammen, ble det bare observert røde kreftceller i haleområdet uten blå signaler (figur 2C, F). Men i embryoer som ble injisert med ultrabright fluorescerende silika nanopartikler, var det blå prikker i halene, konsentrert nær og rundt kreftcellene ved 3,5 h (figur 3B, E). I de overlagte bildene tatt fra både røde og blå kanaler, røde HeLa-celler og blå nanopartikler colocalized, sett på som rosa prikker (Figur 3C, F). I de embryoene som ble injisert utelukkende med nanopartikler, men ikke transplantert med HeLa-celler, konsentiserte de blå fluorescerende partiklene ikke inn i bestemte celler eller områder, men fordeles relativt jevnt inn i embryoenes sirkulasjonssystem, og fremhevet blodkarene (figur 4B, E). Som forventet ble det ikke påvist spesifikke røde lysstoffsignaler i disse embryoene til tross for noen svake bakgrunnsfluoresrør (figur 4A, C, D, F).
Denne protokollen ble senere brukt til å teste ulike typer nanopartikler18,,19,,20. Colocalization av kreftceller med visse typer nanopartikler ble observert så tidlig som 30 min postinjeksjon avhengig av egenskapene til nanopartikkelen testet. Ved 120 min var det > 80% målretting av kreftceller av disse nanopartiklene i halen regionen av fisken. Men for andre nanopartikler ble det observert minimal målretting av kreftceller, i samsvar med deres mangel på kreftspesifikk ligand. De detaljerte resultatene og analysene er inkludert i Peerzade et al. (se figur 3 og figur 4, tilleggstall S12-S16 og tilleggstabell S6)18. Disse resultatene viste differensial målretting av nanopartikler til xenografted HeLa celler i sebrafisk. Dermed, ved hjelp av denne protokollen, bør man være i stand til effektivt å velge nanopartikler basert på deres evne til å gjenkjenne og målrette metastatiske humane kreftceller in vivo.
Figur 1: Protokollskjematisk for å studere nanopartiklers evne til å målrette mot humane kreftceller. Gjennomsiktige Casper embryoer ble generert gjennom avl mannlige og kvinnelige voksen fisk. Befruktede embryoer ble samlet i en petriskål. Ved 48 hk ble RFP+ HeLa-celler injisert i sebrafiskembryoer i perivitellinhulen, slik at noen alderstilpassede embryoer ble uskadet som kontroller. Ved 72 hk ble embryoer med metastatiske RFP+ HeLa-celler valgt og delt inn i to grupper: (A) injisert med kjøretøy (H2O) som kontroll og (B) injisert med nanopartikler suspendert i H2O. Den tredje gruppen var alderstilpassede embryoer som ble injisert med nanopartikler alene (C). Alle tre gruppene ble avbildet under et fluorescerende mikroskop. Det viste området der bildene ble tatt (se figur 2-figur 4). Skala stenger for voksen fisk = 1 mm og for embryoer = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sebrafisk transplantert med metastatiske HeLa-celler uten nanopartikler. Bare røde fluorescerende HeLa-celler var synlige i individet (A, D) eller overlaid bilder av den røde kanalen og blå kanal (C, F). Det ble ikke påvist spesifikke blå lysstoffsignaler i embryoet med kjøretøyets injeksjonskontroll (B, E). Bilder i (A-C) viser fiskehaleområdet bokset som i figur 1A. Bilder i (D-F) er forstørrede visninger av de boksede områdene i (A-C). Skaler stenger i (A-C) = 200 μm og i (D-F) = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Colocalization av røde fluorescerende HeLa-celler og blå fluorescerende nanopartikler i sebrafisk. Sebrafiskhalene ble avbildet på både lav (A-C) og høy (D-F) forstørrelse i den røde og blå kanalen. Røde fluorescerende signaler avslørte metastatiske HeLa-celler (A, D), mens blå fluorescerende signaler viste nanopartiklene (B, E). De overlagte bildene fra både røde og blå kanaler (C, F) viser colocalization av HeLa celler og nanopartikler. Bildene ble tatt etter 3,5 timer fra injeksjon med ultrabright silika nanopartikler. Bilder i (A-C) viser fiskehaleområdet som bokset i figur 1B. Bilder i (D-F) er forstørrede visninger av de boksede områdene i (A-C). Skalere stenger i (A-C) = 100 μm og i (D-F) = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sebrafisk injisert med nanopartikler uten humane HeLa-celler. Blå fluorescerende nanopartikler ble distribuert til embryoenes sirkulasjonssystem i individet (B, E) og overlagte bilder av den røde og blå kanalen (C, F). Ingen spesifikk rød fluorescens var synlig ved enten lav eller høy forstørrelse (A, D) bortsett fra noen bakgrunnsfluorescens som er vanlig for sebrafiskembryoer. Bilder i (A-C) viser fiskehaleområdet som bokset i figur 1C. Bilder i (D-F) er forstørrede visninger av de boksede områdene i (A-C). Skaler stenger i (A-C) = 100 μm og i (D-F) = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som er beskrevet her benytter sebrafisk som et in vivo-system for å teste nanopartiklers evne til å gjenkjenne og målrette metastatiske humane kreftceller. Flere faktorer kan påvirke vellykket gjennomføring av eksperimentene. Først må embryoer være fullt utviklet ved 48 hkf. Den riktige utviklingsstadiet av embryoene gjør dem i stand til å tåle og overleve transplantasjon av menneskelige kreftceller. Embryoer yngre enn 48 hkf har en betydelig lavere overlevelse sammenlignet med eldre og mer utviklede embryoer. For det andre bør kreftceller holdes så sunne som mulig ved å sikre at de er: 1) i eksponentiellvekstfase 21, 2) nyhøstet 30 min-1 t umiddelbart før transplantasjon, og 3) holdt varm til enhver tid. For det tredje må nålen ikke være tilstoppet. Pipette HeLa cellene opp og ned minst 20x før du laster celleblandingen inn i nålen. For det fjerde må ulike typer nåler brukes til transplantasjon av humane kreftceller og injeksjon av nanopartikler. Nålen for menneskelig celletransplantasjon er relativt bred, med en vinkel for å unngå celletstopping, mens nålen for nanopartikkelinjeksjon er skarp og tynn. Femte, plasseringen av injeksjonen varierer. Plasseringen for transplantasjon av menneskelige celler er perivitellinhulen, men for nanopartikkelinjeksjon skal nålen settes inn bak øyet, hvor det er berikede kapillærer. Til slutt, ferdighetene til den enkelte som utfører transplantasjon teller. En erfaren person kan nøyaktig injisere HeLa celler i perivitelline hulrom, mens en uerfaren person ofte injiserer tumorceller i eggeplommeområdet der tumorceller knapt sprer seg inn i fiskekroppen. På samme måte er embryoenes overlevelsesrate mye høyere når de håndteres av en erfaren person, med minst 50% av embryoene transplantert med kreftceller som overlever.
Selv om sebrafisk embryoer er vanligvis inkubert ved 28,5 °C, humane kreftceller krever høyere temperaturer for å overleveog migrere 22,,23. For å tillate overlevelsen av både fiskeembryoer og humane kreftceller, inkuberes embryoene med humane kreftceller ved 35,5 °C i stedet. Selv om det kan være lettere å levere kreftceller inn i eggeplommeseken, spredte de seg knapt inn i sirkulasjonssystemet. Derfor er det viktig å injisere kreftcellene i det vaskulariserte området under perivitellinhulen for å sikre intravasasjon og spredning av kreftceller. I tillegg må man være forsiktig med å ikke legge til for mye eller for konsentrert MS222 når man bedøver embryoene under injeksjon og avbildning. For å hjelpe til med bildebehandling og visualisering av nanopartikler ble Casper sebrafisk valgt i stedet for AB-fisk. Casper-fisken er en dobbel mutant for Nacre og Roy som mangler melanocytter og iridophores, noe som resulterer i økt åpenhet sammenlignet med AB fisk14. Gjennomsiktigheten av Casper sebrafisk gjør det mulig å overvåke spredningen av nanopartikler i omløp og målretting av nanopartikler til kreftceller. Utfordringen med denne protokollen er den relativt høye dødeligheten av embryoene hvis en uerfaren person utfører transplantasjon av menneskelige kreftceller. Interessant, injeksjon av nanopartikler litt bak øynene er relativt godt tolerert. Dette skyldes sannsynligvis bruk av tynnere nåler sammenlignet med nålene som brukes til tumorcelletransplantasjon. For å unngå å skade humane kreftceller, må man bruke nåler med brede åpninger, men disse kan føre til skade på embryoene hvis de håndteres upassende.
Denne protokollen benytter Casper sebrafisk for å visualisere målretting av metastatiske kreftceller med funksjonaliserte nanopartikler in vivo. En stor fordel med denne analysen er at det gjør det mulig for forskerne å utføre sanntidsbilder i løpet av sebrafiskutvikling for å overvåke samspillet mellom kreftceller med nanopartikler. Faktisk, på grunn av sin høye fecundity og rask utvikling, gjør sebrafisken forskeren å oppnå resultater i bare noendager 18,19,20,24. Videre tillater denne analysen også eliminering av giftige nanopartikler fra videre forskning hvis de fleste embryoer dør etter injeksjon av en bestemt type nanopartikkel. Selv om sebrafisken ikke er et pattedyr, letter det valg av et stort antall nanopartikler på en rask og økonomisk måte, og gir nyttig informasjon for nedstrømsstudier på store dyr og klinisk testing. Samlet sett gjør sebrafisken en innvirkning i nanomedisin og nanoteknologi ved å hjelpe til med å velge egnede nanoprobeer for tidlig påvisning og potensiell ødeleggelse av kreftceller gjennom kreftspesifikk målretting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
I.S. erklærer interesse for NanoScience Solutions, LLC (mottaker av STTR NIH R41AI142890 stipend). Alle andre forfattere erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ms. Kaylee Smith, Ms. Lauren Kwok, og Mr. Alexander Floru for korrekturlesing av manuskriptet. H.F. anerkjenner støtte fra NIH (CA134743 og CA215059), American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) og St. Baldrick's Foundation. F.J.F.L. anerkjenner et fellesskap fra Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S anerkjenner NSF-støtte (stipend CBET 1605405) og NIH R41AI142890.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
- Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer. Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).
- Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).
- Chinen, A. B., et al. Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence. Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).
- Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer. Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).
- Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes. Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).
- Sharkey, F. E., Fogh, J. Considerations in the use of nude mice for cancer research. Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Liu, S., Leach, S. D. Zebrafish models for cancer. Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
- Anderson, N. M., et al. The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis. Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).
- Peerzade, S., et al. Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish. Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).
- Peng, B., et al. Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).
- Peng, B., et al. Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Data in Brief. 22, 383-391 (2019).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Rao, P. N., Engelberg, J. Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle. Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).
