Summary
Beskrivs här är en metod för att utnyttja zebrafisk embryon för att studera förmågan hos funktionaliserade nanopartiklar att rikta mänskliga cancerceller in vivo. Denna metod möjliggör utvärdering och urval av optimala nanopartiklar för framtida tester på stora djur och i kliniska prövningar.
Abstract
Att utveckla nanopartiklar som kan upptäcka, rikta in sig på och förstöra cancerceller är av stort intresse inom nanomedicinens område. In vivo djurmodeller krävs för att överbrygga nanotekniken till dess biomedicinska tillämpning. Musen representerar den traditionella djurmodellen för preklinisk testning; mus är dock relativt dyra att behålla och har långa experimentella cykler på grund av den begränsade avkomman från varje mor. Zebrafisken har vuxit fram som ett kraftfullt modellsystem för utvecklings- och biomedicinsk forskning, inklusive cancerforskning. Särskilt på grund av sin optiska öppenhet och snabba utveckling, zebrafisk embryon är väl lämpade för realtid in vivo övervakning av beteendet hos cancerceller och deras interaktioner med deras mikromiljö. Denna metod har utvecklats för att sekventiellt införa mänskliga cancerceller och funktionaliserade nanopartiklar i transparenta Casper zebrafish embryon och övervaka in vivo erkännande och inriktning av cancercellerna av nanopartiklar i realtid. Detta optimerade protokoll visar att fluorescerande märkta nanopartiklar, som är funktionaliserade med folatgrupper, specifikt kan känna igen och rikta metastaserande mänskliga livmoderhalscancer epitelceller märkt med en annan fluorokrom. Igenkännings- och målprocessen kan ske så tidigt som 30 min postinjection av de testade nanopartiklarna. Hela försöket kräver endast avel av några par vuxna fiskar och tar mindre än 4 dagar att slutföra. Dessutom zebrafisk embryon saknar en funktionell adaptiv immunsystemet, vilket möjliggör engraftment av ett brett spektrum av mänskliga cancerceller. Därför möjliggör nyttan av det protokoll som beskrivs här testning av nanopartiklar på olika typer av mänskliga cancerceller, vilket underlättar valet av optimala nanopartiklar i varje specifikt cancersammanhang för framtida tester hos däggdjur och kliniken.
Introduction
Utvecklingen av nanopartiklar som kan upptäcka, rikta och förstöra cancerceller är av stort intresse för både fysiker och biomedicinska forskare. Framväxten av nanomedicin ledde till utvecklingen av flera nanopartiklar, såsom de konjugerade med inriktning ligander och / eller kemoterapeutiska läkemedel1,2,3. Nanopartiklarnas tillsatta egenskaper möjliggör deras interaktion med det biologiska systemet, och avkänning och övervakning av biologiska händelser med hög effektivitet och noggrannhet tillsammans med terapeutiska tillämpningar. Nanopartiklar av guld och järnoxid används främst i datortomografi respektive magnetisk resonanstomografi. Medan den enzymatiska verksamheten av nanopartiklar av guld och järnoxid möjliggör detektering av cancerceller genom kolorometrisk analys, är fluorescerande nanopartiklar väl lämpade för in vivo-bildframställningsapplikationer4. Bland dem är ultrabright fluorescerande nanopartiklar särskilt fördelaktigt, på grund av deras förmåga att upptäcka cancer tidigt med färre partiklar och minskad toxicitet5.
Trots dessa fördelar kräver nanopartiklar experiment med hjälp av in vivo-djurmodeller för val av lämpliga nanomaterial och optimering av syntesprocessen. Dessutom, precis som droger, nanopartiklar lita på djurmodeller för prekliniska tester för att avgöra deras effekt och toxicitet. Den mest använda prekliniska modellen är musen, som är ett däggdjur vars underhåll kommer till en relativt hög kostnad. För cancerstudier används antingen genetiskt modifierade möss eller xenografted möss vanligtvis6,7. Längden på dessa experiment sträcker sig ofta från veckor till månader. I synnerhet för cancer metastasering studier, cancerceller direkt injiceras i cirkulationssystemet av mössen på platser som svans vener och mjälte8,9,10. Dessa modeller representerar bara slutet stadier av metastasering när tumörceller extravasera och kolonisera avlägsna organ. Dessutom, på grund av synlighet frågor, Det är särskilt utmanande att övervaka tumörcell migration och nanopartikel inriktning av tumörceller hos möss.
Den zebrafisk (Danio rerio) har blivit ett kraftfullt ryggradsdjur system för cancerforskning på grund av dess höga fruktbarhet, låg kostnad, snabb utveckling, optisk öppenhet, och genetiska bevaranden11,12. En annan fördel med zebrafisken över musmodellen är befruktningen av fiskäggen ex utero, vilket gör att embryona kan övervakas under hela sin utveckling. Embryonal utveckling är snabb i zebrafisk, och inom 24 timmar postfertilization (hpf), ryggradsdjur kropp planet har redan bildat13. Med 72 hpf kläcks ägg från chorion, övergång från embryonala till yngel scenen. Transparensen i zebrafisken, Casper stammen i synnerhet 14, ger en unik möjlighet att visualisera migration av cancerceller och deras erkännande och inriktning av nanopartiklar i ett levande djur. Slutligen, zebrafisk utveckla sina medfödda immunförsvar med 48 hpf, med adaptiva immunsystemet släpar efter och bara blir funktionella på 28 dagar postfertilization15. Denna tidslucka är idealisk för transplantation av olika typer av mänskliga cancerceller till zebrafisk embryon utan att uppleva immun avstötningar.
Beskrivs här är en metod som drar nytta av transparens och snabb utveckling av zebrafisk att visa erkännande och inriktning av mänskliga cancerceller genom fluorescerande nanopartiklar in vivo. I denna analys, mänskliga livmoderhalscancer celler (HeLa celler) genetiskt konstruerad för att uttrycka en röd fluorescerande protein injicerades i det vaskulariserade området i perivitelline hålighet 48 hpf embryon. Efter 20-24 h hade HeLa-celler redan spridit sig över embryona genom fiskcirkulationssystemet. Embryon med skenbar metastasering var microinjected med ~ 0,5 nL av en nanopartikel lösning direkt bakom ögat, där den rika kapillär säng är belägen. Med hjälp av denna teknik kan de ultrabright fluorescerande kiseldioxidnanopartiklarna rikta in sig på HeLa-celler så snabbt som 20-30 min postinjektion. På grund av sin enkelhet och effektivitet representerar zebrafisken en robust in vivo-modell för att testa en mängd olika nanopartiklar för deras förmåga att rikta specifika cancerceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprocedurer godkändes av Institutionskommittén för djurvård och användning (IACUC) vid Boston University School of Medicine enligt protokollet #: PROTO201800543.
1. Generering av embryon från Caspers zebrafiskar
- Välj vuxna Casper fisk som är minst 3 månaders ålder för naturlig avel att generera transparent Casper zebrafish embryon.
- Fyll parningstankar med två kammare med fiskvatten på kvällen, separera de övre tankarna med hjälp av avdelare, placera en hanfisk i kammarens ena sida och en eller två honfiskar i andra sidan av kammaren och lämna fisken avskild över natten med avdelare.
- Dra ut avdelarna nästa morgon klockan 8:00 när lamporna är tända. Lägg till konstgjorda anrikningsanläggningar och luta den övre kammaren något för att skapa ett grunt vattenområde. Låt fisken häcka i 3-4 h.
- Lyft de översta kamrarna i de parningstankar som innehåller fisken och återför dem till sina ursprungliga tankar.
- Samla ägg som ligger i bottenkamrarna genom att hälla vattnet genom ett nätnät. Överför ägg till en steril petriskål vid en densitet som inte är större än 200 ägg per fat. Ta bort alla döda eller obefruktade ägg och fyll skålen 2 / 3 full med färsk fisk vatten.
OBS: Befruktade och friska ägg bör vara genomskinliga och runda. Alla ägg som är grumliga, vita eller vanställda bör tas bort. Fiskvatten erhålls från fisktankar i fiskanläggningen. - Ruva embryon i inkubatorn vid 28,5 °C över natten.
- Blek embryona nästa morgon med hjälp av standardprotokollet enligt beskrivningen i Zebrafiskens bok16, och sätt tillbaka embryona till inkubatorn (valfritt steg).
- Ta ut de 24 hkf-embryona ur inkubatorn på eftermiddagen och demhorionate embryona med hjälp av pronase.
- Ta bort så mycket fiskvatten som möjligt från embryona i Petriskålen och tillsätt några droppar av pronaselösningen (1 mg/mL i fiskvatten) till skålen. Snurra försiktigt petriskålen. När chorions visar tecken på sönderfall, pipetter embryona upp och ner ett par gånger för att bryta ner chorions att släppa embryon.
- Tillsätt färsk fisk vatten omedelbart i Petriskålen för att avsluta processen när en majoritet av embryona är ute ur chorions. Skölj embryona 3x mer med hjälp av fiskvatten för att ta bort de flytande chorions. Återför embryona till ruvmaskinen.
2. Beredning av mänskliga cancerceller för transplantation
- Ställ in inkubatortemperaturen på exakt 35,5 °C. Övervaka inkubatorn för att säkerställa en jämn och stabil temperatur med hjälp av en termometer inuti inkubatorn.
- Autoklav 1 L fiskvatten i en glasflaska. Gör en 3% agaroslösning genom att tillsätta 3 g elektroforesgrad agaros till 100 mL autoklaverat fiskvatten och microwaving tills agarosen är helt upplöst.
- Häll varm agaroslösning i en petriskål tills den är 3/4 full. Placera mikroinjektionsformen på agaros. Se till att formen inte är i kontakt med botten av Petriskålen och inga bubblor bildas under.
- Låt lösningen stelna och försiktigt ta bort formen från plattan. Fyll plattan med autoklaverat fiskvatten och förvara plattan vid 4 °C. Förvam agarosplattan och fiskvattnet i inkubatorn 35,5 °C innan han eller hon skördar HeLa-celler.
- Dra 1,0 mm O.D. x 0,78 mm borosilikat glas kapillärer på en pipettdragare med hjälp av följande inställningar: tryck vid 500, värme vid 560, dra vid 100, hastighet vid 100, och tid/fördröjning vid 200. Förvara nålar på stylt i en stor petriskål som har torkats av med en etanolhandduk.
FÖRSIKTIGHET: Dragna nålar är mycket vassa och ömtåliga. Var försiktig vid hantering. - Bered en stamlösning av trikainmetansulfonat (MS222, 4 mg/mL) genom att lösa upp MS222 i autoklaverat fiskvatten. Vortex i god tid före användning. Späd MS222 stamlösning 1:100 i fiskvatten (dvs. tillsätt 200 μL ms222 stamlösning till 20 mL fiskvatten till en slutlig koncentration av 40 μg/mL) för att bedöva embryon för följande förfaranden.
- Kultur hLabel HeLa celler genom att omvandla dem med PLenti6.2_miRFP670 lentivirus med hjälp av protokollet som beskrivs17. Harvest RFP+ HeLa-celler 30 min-1 h före transplantationen.
OBS: Human HeLa celler har odlats i en vävnad kultur inkubator upp till 70% konfluency i fullständig tillväxt medium (DMEM medium med 10% FBS) vid 37 °C kompletteras med 5% CO2.- Ta bort HeLa-cellmediet genom aspiration i en vävnadskulturhuva. Skölj kortfattat cellskiktet med steril PBS för att avlägsna alla spår av serumet.
- Tillsätt 3,0 mL steril Trypsin-EDTA-lösning på en T-75-kolv och placera tillbaka cellerna i inkubatorn för vävnadskulturen 3-5 min för att underlätta enzymatisk matsmältning. Observera kolven under mikroskopet tills ~80% av cellerna blir upphängda.
- Tillsätt 6-8 mL komplett tillväxtmedium i kolven. Samla in cellerna i ett 15 mL sterilt rör genom att försiktigt pipettera. Centrifugera vid 135 x g i 5 min.
- Aspirera de supernatant och resuspend HeLa celler i 3 mL av fullständig tillväxt medium. Upprepa ovanstående tvättsteg 2x. Resuspend cellerna i 1 mL av komplett tillväxt medium och räkna cellerna under mikroskopet med hjälp av en hemocytometer.
- Snurra ner cellerna igen, ta bort supernatanten och resuspend cellerna i en 1,5 mL mikrocentrifugrör vid en koncentration av 5 x 107 celler/mL. Håll cellerna varma genom att hålla röret i ena handen när du transporterar till fiskanläggningen.
OBS: Håll alltid cellerna varma genom att förvara cellerna inuti 35,5 °C-inkubatorn före eller under insprutning av embryona.
3. Transplantation av cancerceller hos människor
- Städa upp arbetsområdet med hjälp av etanolhanddukar före transplantation (t.ex., sax, pincett, plastpipetter, rakblad).
- Rikta in embryon i agarosplattans spår med hjälp av en plastpipett. Lägg embryon på sidan med främre vänd framåt.
OBS: Se till att fiskvattnet täcker embryona. Ställ några embryon åt sidan för att inte injicera cancerceller och använda som kontroller. - Slå på luftkällan och mikroinjektorn. Ta HeLa celler ur inkubatorn och pipettera cellerna upp och ner 20-30x med hjälp av en P200 spets. Ladda 3 μL cellblandning omedelbart i en nål med hjälp av en gel lastningsspets med en avskuren ände. För försiktigt in spetsen mot den vassa nedre änden av nålen. Om det behövs, skaka nålen för att säkerställa cellblandningen flyttar ner nålen för att fylla upp den skarpa änden.
- Stick in nålen i nålhållaren. Använd ett par pincett för att försiktigt bryta upp nålspetsen. Justera trycket och tidslängden på mikroinjektorn för att trycka ut alla luftbubblor inuti nålspetsen. Minska tiden för tryck och injektionslängd tills storleken på injektionsdropparna är ~1 nL.
- Placera injektionsplattan under mikroskopet i lämpligt läge för att ha äggulan sidan av embryon vänd mot nålen. Söva embryona genom att tillsätta fem droppar av den utspädda MS222-lösningen (40 μg/mL).
- Placera injektorn och låt nålen röra vid varje embryos perivitellinhåla.
- Injicera cellblandningen i embryona vid det vaskulariserade området under perivitellinhålan genom att trycka på fotpedalen.
- Använd den icke-dominerade handen för att flytta injektionsplattan till nästa embryo. Använd den dominerande handen för att förlänga och dra tillbaka injektorn samtidigt som du trycker på fotpedalen samtidigt för att fortsätta injektionen. Pipa några droppar sterilt fiskvatten på embryon som har injicerats. När injektionen av alla embryon på plattan är avslutad, tvätta bort embryona med sterilt fiskvatten, lägg dem på en steril Petriskål och flytta dem omedelbart till inkubatorn med 35,5 °C.
- Efter 3 h, undersöka de injicerade embryona och ta bort de döda.
- Återför de levande embryona till inkubatorn på 35,5 °C och inkubera dem i 20–24 h så att HeLa-cellerna kan spridas från injektionsstället till andra delar av kroppen.
OBS: Embryon hålls i 35,5 °C inkubator för att möjliggöra överlevnad och migration av mänskliga cancerceller eftersom cellerna inte gör bra vid 28,5 °C, temperaturen fisk embryon normalt inkuberas.
4. Injektion av nanopartiklar eller fordon
- Bedöva de transplanterade embryona nästa morgon med fem droppar utspädd MS222-lösning. Lägg inte till för mycket MS222, eftersom detta kommer att döda embryona. Under ett fluorescerande mikroskop, försiktigt plocka upp embryon med svans metastasering av RFP + HeLa celler och placera dem i en ny Petriskål med sterilt fiskvatten.
- Gör injektionsnålarna som tidigare beskrivits i avsnitt 2 med hjälp av följande inställningar: tryck vid 500, värme vid 645, dra vid 60, hastighet vid 50, och tid/fördröjning vid 100.
- Följ procedurerna i steg 3.1-3.3 för att rikta in embryon och lastfordon (t.ex., H2O) eller nanopartikellösningen i nålen.
- Injicera 0,5 nL på 1 mg/mL nanopartikellösning bakom ögat och fortsätt injektionen enligt beskrivningen i steg 3,5-3,6 (Figur 1B). Denna plats bakom ögonen är berikad med kapillärer, vilket gör att nanopartiklarna kan komma i omlopp.
- Efter ett liknande förfarande injicerar du fordonet (t.ex., H2O) som användes för att suspendera nanopartiklarna i embryon med HeLa-celler som transplanterats och de utan (dvs. kontroller) (figur 1A, C).
- Ruva alla injicerade embryon vid 35,5 °C.
5. Bilddiagnostik och spårning av nanopartiklar och cancerceller
- Undersök injicerade embryon under ett fluorescerande mikroskop vid 0, 30, 60, 90, 120, 180 och 210 min postinjektion av nanopartiklar för att övervaka deras fördelning i omlopp och graden av cancercellinriktning. Inriktningen av cancerceller genom nanopartiklar kan observeras så tidigt som 30 min postinjektion beroende på vilken typ av nanopartikel testas.
- Pipett 2-3 embryon i en petriskål och immobilisera dem genom att tillsätta fem droppar utspädd MS222-lösning (40 μg/mL). När embryona slutar simma, ta bort det mesta av vattnet så att embryona att ligga på sina sidor.
- Använd en pipett med en tunn, mjuk borste fäst vid dess ände för att rikta in embryona så att de ligger på sina sidor med den främre framåt och endast ett öga synligt.
- Avbilda embryona i röda, blå och ljusstjärtade kanaler vid låg förstoring (2x) för att fånga hela embryot och upprepa vid högre förstoring (6,4 x) för att fånga upp svansområdet. Fokusera embryot under den röda kanalen för att undvika blödning av nanopartiklar.
OBS: Embryona får inte röra sig under bildtagning. Varje rörelse kommer att leda till suddiga bilder och oförmåga att överlappa bilder från olika kanaler. - Tillsätt färsk fisk vatten till embryona omedelbart efter avbildning och returnera dem till inkubatorn. Upprepa steg 5.2-5.4 för att avbilda embryona vid olika tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet schematisk i figur 1 illustrerar de övergripande förfarandena för denna studie. Transparent Casper manliga och kvinnliga vuxna fisk var uppfödda för att generera embryon (avsnitt 1). RFP+ HeLa celler injicerades i det vascularized området under perivitelline håligheten av de zebrafish embryon vid 48 hpf, med uninjected embryon som kontroller (avsnitt 3). För individer som har erfarenhet av mikroinjektion är överlevnadsgraden för embryon ofta hög, med minst 50% av embryon som transplanterats med cancerceller som överlever i inkubatorn 35,5 °C, ett temperaturunderoptimalt för zebrafiskembryon men som krävs för överlevnad och migration av mänskliga cancerceller. HeLa celler är mycket invasiva och kan intravasera och sprida sig till svansen regionen av embryona så snabbt som 8 h postinjection. Genom 20-24 h post-transplantation, ~ 50% av embryon transplanterade visade tecken på ögonbevarande spridning av HeLa celler. Dessa embryon med cancer cell svans metastaser valdes ut för nedströms experiment. Vid 72 hpf injicerades därefter dessa embryon bakom ögonen antingen med blå fluorescerande nanopartiklar (avsnitt 4 och figur 1B) eller enbart med fordonet som kontroller (Bild 1A). Åldersmatchade embryon som injicerades med nanopartiklar men utan cancercelltransplantation var den andra gruppen av kontroller (figur 1C). För mer detaljerad information om nanopartikelsyntes, beredning, och karakterisering se Peerzade et al.18.
Vid 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 min postinjektion av nanopartiklar, de injicerade embryona övervakades genom avbildning för att bestämma interaktionen mellan nanopartiklar med RFP + HeLa celler, med hjälp av fordonet injicerade embryon som kontroller. Närmare bestämt var zebrafisk svans områden där RFP + HeLa celler hade spridit sig till avbildas vid rött, blått och brightfield belysning med hjälp av ett fluorescerande mikroskop (avsnitt 5). Den detaljerade karakteriseringen av de ultrabrighta nanopartiklarnas förmåga att rikta in xenografted cancerceller i zebrafisk över tid visas i figur 5 i Peerzade et al.18. De röda prickarna som ses i svansen på embryona är metastaserande mänskliga livmoderhalscancerceller som var synliga i både fordons- och nanopartikelinsprutade embryon (Figur 2A, D; Bild 3A, D). Som väntat upptäcktes inga specifika blå fluorescerande signaler hos embryon med injektionen endast för fordonet (Figur 2B, E). Dessutom, när bilderna som togs i de röda och blå kanalerna slogs samman, observerades endast röda cancerceller i svansregionen utan några blå signaler (Figur 2C, F). I embryon som injicerades med ultrabright fluorescerande kiseldioxid nanopartiklar fanns det dock blå prickar i svansarna, koncentrerade nära och runt cancercellerna vid 3,5 h (Figur 3B, E). I de överlagrad bilder som fångats från både röda och blå kanaler, röda HeLa celler och blå nanopartiklar colocalized, ses som rosa prickar (Figur 3C, F). I de embryon som injicerades enbart med nanopartiklar men inte transplanterats med HeLa-celler koncentrerade sig inte de blå fluorescerande partiklarna till några särskilda celler eller områden, utan fördelades relativt jämnt i embryonas cirkulationssystem, vilket framhävde blodkärlen (Figur 4B, E). Som väntat upptäcktes inga specifika röda fluorescerande signaler i dessa embryon trots vissa svaga bakgrundslysrörssignaler (Figur 4A, C, D, F).
Detta protokoll användes därefter för att testa olika typer av nanopartiklar18,19,20. Colocalization av cancerceller med vissa typer av nanopartiklar observerades så tidigt som 30 min postinjektion beroende på egenskaperna hos den testade nanopartikeln. Genom 120 min, det var >80% inriktning av cancerceller av dessa nanopartiklar i svansen regionen av fisken. För andra nanopartiklar observerades dock minimal inriktning av cancerceller, vilket var förenligt med deras brist på cancerspecifik ligand. De detaljerade resultaten och analyserna ingår i Peerzade m.fl. (se figur 3 och figur 4, tilläggssiffrorna S12-S16, och kompletterande tabell S6)18. Dessa resultat visade differentiell inriktning av nanopartiklar till xenografted HeLa celler i zebrafish. Således, med hjälp av detta protokoll, bör man kunna effektivt välja nanopartiklar baserat på deras förmåga att känna igen och rikta metastaserande mänskliga cancerceller in vivo.
Figur 1: Protokoll som är schematiskt för att studera nanopartiklarnas förmåga att rikta in sig på cancerceller hos människor. Transparent Casper embryon genererades genom avel manliga och kvinnliga vuxna fisk. Befruktade embryon samlades i en petriskål. Vid 48 hpf injicerades RFP + HeLa celler i zebrafish embryon vid perivitellin hålighet, lämnar några åldersmatchade embryon oinjected som kontroller. Vid 72 hpf valdes embryon med metastaserande RFP+ HeLa-celler och delades upp i tvågrupper:( A ) som injicerades med fordonet (H2O) som kontroll och (B) som injicerats med nanopartiklar som är upphängda i H2O. Den tredje gruppen var åldersmatchade embryon som injicerades med enbart nanopartiklar (C). Alla tre grupperna avbildades under ett fluorescerande mikroskop. Det rutade området som visas är där bilder togs (se bild 2-Bild 4). Skalstång för vuxna fiskar = 1 mm och för embryon = 500 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Zebrafisk som transplanterats med metastaserande HeLa-celler utan nanopartiklar. Endast röda fluorescerande HeLa-celler var synliga i den enskilde (A, D) eller överlagrad bilder av den röda kanalen och blå kanal (C, F). Inga specifika blå fluorescerande signaler upptäcktes i embryot med fordonets injektionskontroll (B, E). Bilder i (A-C) visar fiskstjärtregionen som är inrutad som i figur 1A. Bilder i (D-F) är förstorade vyer av de rutade områdena i (A-C). Skala barer i (A-C) = 200 μm och i (D-F) = 100 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Colocalization av röda fluorescerande HeLa-celler och blå fluorescerande nanopartiklar i zebrafisk. Zebrafiskstjärtarna avbildades vid både låg (A-C) och hög (D-F) förstoring i den röda och blåa kanalen. Röda fluorescerande signaler avslöjade metastaserande HeLa-celler (A, D), medan blå fluorescerande signaler visade nanopartiklarna (B, E). De överlagrad bilder från både röda och blå kanaler (C, F) visar colocalization av HeLa celler och nanopartiklar. Bilderna togs efter 3,5 h från injektion med ultrabright kiseldioxid nanopartiklar. Bilder i (A-C) visar fiskstjärtregionen som inrutad i figur 1B. Bilder i (D-F) är förstorade vyer av de rutade områdena i (A-C). Skalstång i (A-C) = 100 μm och i (D-F) = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Zebrafisk som injiceras med nanopartiklar utan mänskliga HeLa-celler. Blå fluorescerande nanopartiklar distribuerades i cirkulationssystemet av embryona i den enskilde (B, E) och överlagrad bilder av den röda och blå kanal (C, F). Ingen specifik röd fluorescens var synlig vid antingen låg eller hög förstoring (A, D) utom vissa bakgrund fluorescens gemensamma för zebrafish embryon. Bilder i (A-C) visar fiskstjärtregionen som inrutad i figur 1C. Bilder i (D-F) är förstorade vyer av de rutade områdena i (A-C). Skala barer i (A-C) = 100 μm och i (D-F) = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivs här använder zebrafisken som ett in vivo-system för att testa nanopartiklarnas förmåga att känna igen och rikta metastaserande mänskliga cancerceller. Flera faktorer kan påverka det framgångsrika utförandet av experimenten. För det första måste embryon vara fullt utvecklade vid 48 hpf. Embryonas korrekta utvecklingsstadium gör det möjligt för dem att uthärda och överleva transplantationen av mänskliga cancerceller. Embryon yngre än 48 hpf har en betydligt lägre överlevnad jämfört med äldre och mer utvecklade embryon. Andra, cancerceller bör hållas så friska som möjligt genom att säkerställa att de är: 1) i den exponentiellatillväxtfasen 21, 2) nyskördade 30 min-1 h omedelbart före transplantation, och 3) hålls varm hela tiden. För det tredje får nålen inte täppas till. Pipettera HeLa-cellerna upp och ner minst 20x innan cellblandningen laddas i nålen. För det fjärde måste olika typer av nålar användas för transplantation av mänskliga cancerceller och injektion av nanopartiklar. Nålen för mänsklig celltransplantation är relativt bred, med en vinkel för att undvika cell igensättning, medan nålen för nanopartikel injektion är skarp och tunn. Femte, platsen för injektionen skiljer sig. Platsen för transplantation av mänskliga celler är perivitellinhålan, men för nanopartikelinjektion ska nålen sättas in bakom ögat, där det finns anrika kapillärer. Slutligen, skickligheten hos den enskilde som utför transplantation frågor. En erfaren individ kan exakt injicera HeLa celler i perivitellin hålighet utrymme, medan en oerfaren person ofta injicerar tumörceller i äggulan område där tumörceller knappt sprids in i fiskkroppen. På samma sätt är embryonas överlevnadsgrad mycket högre när de hanteras av en erfaren individ, med minst 50% av embryon som transplanterats med cancerceller som överlever.
Även om zebrafisk embryon brukar inkuberas vid 28,5 °C, mänskliga cancerceller kräver högre temperaturer för att överleva och migrera22,23. För att möjliggöra överlevnaden av både fiskembryon och mänskliga cancerceller inkuberas de embryon som transplanteras med mänskliga cancerceller vid 35,5 °C i stället. Även om det kan vara lättare att leverera cancerceller i gulesäcken, de knappt sprids i cirkulationssystemet. Därför är det avgörande att injicera cancercellerna i det vaskulariserade området under perivitellinhålan för att säkerställa intravasation och spridning av cancerceller. Dessutom måste man se till att inte lägga till för mycket eller för koncentrerad MS222 när man bedövar embryona under injektion och bildbehandling. Som stöd i bildbehandling och visualisering av nanopartiklar valdes Casper-zebrafisken istället för AB-fisk. Den Casper fisken är en dubbel mutant för Nacre och Roy som saknar melanocyter och iridophores, vilket resulterar i ökad öppenhet jämfört med AB fisk14. Transparensen i Casper-zebrafisken möjliggör övervakning av spridningen av nanopartiklar i omlopp och inriktningen av nanopartiklarna till cancerceller. Utmaningen med detta protokoll är den relativt höga dödligheten hos embryona om en oerfaren individ utför transplantation av mänskliga cancerceller. Intressant nog tolereras injektionen av nanopartiklar något bakom ögonen relativt väl. Detta beror sannolikt på användningen av tunnare nålar jämfört med de nålar som används för tumörcellstransplantation. För att undvika att skada mänskliga cancerceller måste man använda nålar med breda öppningar, men dessa kan leda till skador på embryona om de hanteras på ett olämpligt sätt.
Detta protokoll utnyttjar Casper zebrafish att visualisera inriktning av metastaserande cancerceller med funktionaliserade nanopartiklar in vivo. En stor fördel med denna analys är att det gör det möjligt för forskarna att utföra realtidsavbildning under loppet av zebrafisk utveckling för att övervaka samspelet mellan cancerceller med nanopartiklar. Faktum är att på grund av sin höga fruktbarhet och snabba utveckling, zebrafisken gör det möjligt för forskaren att få resultat på bara afew dagar18,19,20,24. Dessutom möjliggör denna analys också eliminering av giftiga nanopartiklar från ytterligare forskning om de flesta embryon dör efter injektion av en viss typ av nanopartikel. Även om zebrafisken inte är ett däggdjur, underlättar det valet av ett stort antal nanopartiklar på ett snabbt och ekonomiskt sätt, vilket ger användbar information för studier nedströms på stora djur och kliniska tester. Sammantaget gör zebrafisken en inverkan på nanomedicin och nanoteknik genom att hjälpa till att välja ut lämpliga nanosonder för tidig upptäckt och potentiell förstörelse av cancerceller genom cancerspecifik inriktning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
I.S. förklarar intresse för NanoScience Solutions, LLC (mottagare av STTR NIH R41AI142890 bidrag). Alla andra författare deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar Ms Kaylee Smith, Ms Lauren Kwok, och Mr Alexander Floru för korrekturläsning av manuskriptet. H.F. erkänner bidragsstöd från NIH (CA134743 och CA215059), American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) och St Baldrick's Foundation. F.J.F.L. erkänner ett stipendium från Boston University Innovation Center-BUnano tvärvetenskaplig utbildning i nanoteknik för cancer (XTNC). I.S erkänner NSF-stöd (grant CBET 1605405) och NIH R41AI142890.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
- Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer. Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).
- Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).
- Chinen, A. B., et al. Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence. Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).
- Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer. Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).
- Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes. Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).
- Sharkey, F. E., Fogh, J. Considerations in the use of nude mice for cancer research. Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Liu, S., Leach, S. D. Zebrafish models for cancer. Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
- Anderson, N. M., et al. The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis. Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).
- Peerzade, S., et al. Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish. Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).
- Peng, B., et al. Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).
- Peng, B., et al. Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Data in Brief. 22, 383-391 (2019).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Rao, P. N., Engelberg, J. Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle. Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).
