Summary
Beskrevet her er en metode til at udnytte zebrafisk embryoner til at studere evne til funktionaliserede nanopartikler til at målrette menneskelige kræftceller in vivo. Denne metode gør det muligt at evaluere og vælge optimale nanopartikler til fremtidige forsøg med store dyr og i kliniske forsøg.
Abstract
Udvikling af nanopartikler, der er i stand til at opdage, målrette og ødelægge kræftceller, er af stor interesse inden for nanomedicin. In vivo dyremodeller er nødvendige for at bygge bro over nanoteknologien til dens biomedicinske anvendelse. Musen repræsenterer den traditionelle dyremodel til prækliniske test; mus er dog relativt dyre at holde og har lange eksperimentelle cyklusser på grund af det begrænsede afkom fra hver mor. Zebrafisken har vist sig som et kraftfuldt modelsystem til udviklings- og biomedicinsk forskning, herunder kræftforskning. Især på grund af sin optiske gennemsigtighed og hurtige udvikling, zebrafisk embryoner er velegnet til real-time in vivo overvågning af adfærd kræftceller og deres interaktioner med deres mikromiljø. Denne metode blev udviklet til sekventielt at indføre humane kræftceller og funktionaliserede nanopartikler i gennemsigtige Casper zebrafisk embryoner og overvåge in vivo anerkendelse og målretning af kræftceller ved nanopartikler i realtid. Denne optimerede protokol viser, at fluorescerende mærket nanopartikler, som er funktionaliseret med folat grupper, kan specifikt genkende og målrette metastatisk human livmoderhalskræft kræftceller mærket med en anden fluorrom. Anerkendelse og målretning proces kan forekomme så tidligt som 30 min postinjektion af nanopartikler testet. Hele eksperimentet kræver kun avl af et par par voksne fisk og tager mindre end 4 dage at fuldføre. Desuden zebrafisk embryoner mangler en funktionel adaptive immunsystem, så engraftment af en bred vifte af menneskelige kræftceller. Derfor nytten af den protokol, der er beskrevet her, gør det muligt at teste nanopartikler på forskellige typer af humane kræftceller, hvilket letter udvælgelsen af optimale nanopartikler i hver specifik kræftsammenhæng til fremtidige test i pattedyr og klinikken.
Introduction
Udviklingen af nanopartikler, der er i stand til at opdage, målrette og ødelægge kræftceller er af stor interesse for både fysikere og biomedicinske forskere. Fremkomsten af nanomedicin førte til udviklingen af flere nanopartikler, såsom dem, der er konjugeret med målretning ligands og / eller kemoterapeutiske lægemidler1,,2,3. Nanopartiklernes ekstra egenskaber muliggør deres interaktion med det biologiske system, sensing og overvågning af biologiske hændelser med høj effektivitet og nøjagtighed sammen med terapeutiske anvendelser. Guld og jernoxid nanopartikler anvendes primært i computertomografi og magnetisk resonans imaging applikationer, henholdsvis. Mens enzymatiske aktiviteter af guld og jernoxid nanopartikler tillader påvisning af kræftceller gennem koloriumanalyser, fluorescerende nanopartikler er velegnet til in vivo billeddannelse applikationer4. Blandt dem, ultrabright fluorescerende nanopartikler er særligt gavnlige, på grund af deres evne til at opdage kræft tidligt med færre partikler og reduceret toksicitet5.
På trods af disse fordele kræver nanopartikler forsøg ved hjælp af in vivo-dyremodeller til udvælgelse af egnede nanomaterialer og optimering af synteseprocessen. Derudover, ligesom narkotika, nanopartikler stole på dyremodeller for prækliniske test for at bestemme deres effektivitet og toksicitet. Den mest udbredte prækliniske model er musen, som er et pattedyr, hvis vedligeholdelse kommer til en relativt høj pris. Til kræftundersøgelser anvendes enten gensplejsede mus eller xenografted mus typisk6,7. Længden af disse eksperimenter spænder ofte fra uger til måneder. Især for kræft metastase undersøgelser, kræftceller injiceres direkte i kredsløbssygdomme af mus på steder såsom hale vener og milt8,9,10. Disse modeller kun repræsenterer de afsluttende stadier af metastase, når tumorceller ekstravasate og kolonisere fjerne organer. Desuden, på grund af synlighed spørgsmål, Det er især udfordrende at overvåge tumor celle migration og nanopartikel målretning af tumorceller i mus.
Zebrafisk (Danio rerio) er blevet en kraftfuld hvirveldyr system til kræftforskning på grund af sin høje frugtbarhed, lave omkostninger, hurtig udvikling, optisk gennemsigtighed, og genetiske bevarelser11,12. En anden fordel ved zebrafisk over musen model er befrugtning af fiskeæg ex utero, som gør det muligt for embryoner, der skal overvåges i hele deres udvikling. Embryonale udvikling er hurtig i zebrafisk, og inden for 24 timer efterfertilisering (hpf), hvirveldyr organ plan har allerede dannet13. Ved 72 hkf udklækkes æg fra chorion, der skifter fra embryonalen til yngelstadiet. Zebrafiskens gennemsigtighed, især Casper-stammen 14,giver en enestående mulighed for at visualisere migrationen af kræftceller og deres anerkendelse og målretning af nanopartikler i et levende dyr. Endelig zebrafisk udvikle deres medfødte immunsystem med 48 hkf, med adaptive immunsystem halter bagefter og kun bliver funktionelle på 28 dage efterfertilisering15. Denne tidsforskel er ideel til transplantation af forskellige typer af humane kræftceller i zebrafisk embryoner uden at opleve immunafvisninger.
Beskrevet her er en metode, der udnytter zebrafiskens gennemsigtighed og hurtige udvikling til at demonstrere anerkendelse og målretning af humane kræftceller ved fluorescerende nanopartikler in vivo. I denne analyse, human livmoderhalskræft celler (HeLa celler) genetisk manipuleret til at udtrykke en rød fluorescerende protein blev injiceret i det vaskulære område i perivitelline hulrum af 48 hpf embryoner. Efter 20-24 timer havde HeLa-cellerne allerede spredt sig over embryonerne gennem fiskecirkulationssystemet. Embryoner med tilsyneladende metastase blev mikroindsprøjtet med ~ 0,5 nL af en nanopartikel opløsning direkte bag øjet, hvor den rige kapillær seng er placeret. Ved hjælp af denne teknik, ultrabright fluorescerende silica nanopartikler kan målrette HeLa celler så hurtigt som 20-30 min postinjektion. På grund af sin enkelhed og effektivitet repræsenterer zebrafisken en robust in vivo-model for at teste en række nanopartikler for deres evne til at målrette specifikke kræftceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Boston University School of Medicine under protokollen #: PROTO201800543.
1. Generation af Casper zebrafisk embryoner
- Vælg voksne Casper fisk, der er mindst 3 måneder gamle for naturlig avl for at generere gennemsigtige Casper zebrafisk embryoner.
- Fyld to-kammer parring tanke med fiskevand om aftenen, adskille de øverste tanke ved hjælp af skillevægge, placere en hanfisk i den ene side af kammeret og en eller to hunfisk i den anden side af kammeret, og lad fisken adskilt natten over af skillevægge.
- Træk skillessedler næste morgen kl 8:00, når lysene er tændt. Tilføj kunstig berigelse planter og vippe det øverste kammer lidt for at skabe et lavt område af vand. Lad fiskene yngle i 3-4 timer.
- Løft de øverste kamre i parringstanke, der indeholder fisken, og vend dem tilbage til deres oprindelige tanke.
- Opsaml æg placeret i de nederste kamre ved at hælde vandet gennem et net. Overfør æg til en steril petriskål med en massetæthed på højst 200 æg pr. skål. Fjern eventuelle døde eller ubefrugtede æg og fyld skålen 2/3 fuld med frisk fiskevand.
BEMÆRK: Befrugtede og sunde æg skal være gennemskinnelige og runde. Alle æg, der er uklare, hvide eller vansiret, skal fjernes. Fiskevandet fremstilles af akvarier i fiskefaciliteten. - Inkuber embryoner i rugemaskinen ved 28,5 °C natten over.
- Bleg embryonerne næste morgen ved hjælp af standardprotokollen som beskrevet i Zebrafiskbogen16, og sæt embryonerne tilbage til kuvøsen (valgfrit trin).
- Tag de 24 hpf-embryoner ud af inkubatoren om eftermiddagen, og dechorionate embryonerne ved hjælp af pronase.
- Så meget fiskevand som muligt fjernes fra embryonerne i petriskålen, og der tilsættes et par dråber af pronaseopløsningen (1 mg/ml i fiskevand) til skålen. Svir forsigtigt petriskålen. Når chorions viser tegn på opløsning, pipette embryoner op og ned et par gange for at nedbryde chorions at frigive embryoner.
- Tilsæt frisk fiskevand straks i petriskålen for at afslutte processen, når et flertal af embryonerne er ude af chorions. Skyl embryonerne 3x mere ved hjælp af fiskevand for at fjerne de flydende chorions. Aflever embryonerne til kuvøsen.
2. Forberedelse af humane kræftceller til transplantation
- Inkubatortemperaturen indstilles til nøjagtig 35,5 °C. Anvåg inkubatoren for at sikre en ensartet og stabil temperatur ved hjælp af et termometer inde i inkubatoren.
- Autoklave 1 L fiskevand i en glasflaske. Lav en 3% agarose opløsning ved at tilføje 3 g elektroforese-grade agarose til 100 ml autoclaved fiskevand og microwaving indtil agarose er helt opløst.
- Hæld varm agaroseopløsning i en petriskål, indtil den er 3/4 fuld. Placer mikroinjektionsformen på agarose. Sørg for, at formen ikke er i kontakt med bunden af petriskålen og ingen bobler form nedenunder.
- Lad opløsningen størkne og forsigtigt fjerne formen fra pladen. Fyld pladen med autoklaveret fiskevand, og opbevar pladen ved 4 °C. Forvarm agarosepladen og fiskevandet i inkubatoren på 35,5 °C, før heLa-cellerne høstes.
- Træk 1,0 mm O.D. x 0,78 mm borosilikatglaskapiller på en pipettetræker ved hjælp af følgende indstillinger: tryk ved 500, varme ved 560, træk ved 100, hastighed ved 100 og tid/forsinkelse ved 200. Opbevar nåle på kit i en stor petriskål, der er blevet tørret med et ethanol håndklæde.
FORSIGTIG: Trak nåle er meget skarpe og skrøbelige. Vær forsigtig ved håndtering. - Der forbered en stockopløsning af tricainmethansulfonat (MS222, 4 mg/ml) ved at opløse MS222 i autoklaveret fiskevand. Vortex længe før brug. Fortyndet MS222 stamopløsning 1:100 i fiskevand (dvs. tilsæt 200 μL MS222 stamopløsning til 20 ml fiskevand til en endelig koncentration på 40 μg/ml) for at bedøve embryoner til følgende procedurer.
- Kultur hLabel HeLa celler ved at transducere dem med PLenti6.2_miRFP670 lentivirus ved hjælp af den beskrevne protokol17. Høst RFP + HeLa celler 30 min-1 h før transplantationen.
BEMÆRK: Humane HeLa-celler er blevet dyrket i en vævskulturinkubator op til 70% sammenløb i komplet vækstmedium (DMEM-medium med 10% FBS) ved 37 °C suppleret med 5% CO2.- Fjern HeLa celle medium ved aspiration i et væv kultur hætte. Skyl kort cellelaget med steril PBS for at fjerne alle spor af serum.
- Der tilsættes 3,0 ml steril Trypsin-EDTA-opløsning til en T-75-kolbe, og cellerne anbringes tilbage i 37 °C vævskulturskuvøsen i 3-5 min. for at lette enzymatisk fordøjelse. Kolben under mikroskopet, indtil ~80% af cellerne bliver suspenderet.
- Der tilsættes 6-8 ml komplet vækstmedium i kolben. Cellerne opsamls i et 15 ml sterilt rør ved forsigtigt at pipettere. Centrifuge ved 135 x g i 5 min.
- Inspirer supernatanten og resuspenderede HeLa-celler i 3 ml komplet vækstmedium. Gentag ovenstående vask trin 2x. Resuspend cellerne i 1 ml komplet vækstmedium og tælle cellerne under mikroskopet ved hjælp af et hæmocytometer.
- Drej cellerne ned igen, fjern supernatanten, og opslæm cellerne igen i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved en koncentration på 5 x 107 celler/ml. Hold cellerne varme ved at holde røret i den ene hånd, når de transporteres til fiskefaciliteten.
BEMÆRK: Hold altid cellerne varme ved at opbevare cellerne inde i 35,5 °C-inkubatoren før eller under indsprøjtning af embryonerne.
3. Transplantation af humane kræftceller
- Ryd op i arbejdsområdet ved hjælp af ethanolhåndklæder før transplantation (f.eks. saks, pincet, plastpipetter, barberblade).
- Juster embryoner i agarosepladens riller ved hjælp af en plastpipette. Læg embryoner på siden med den forreste vender fremad.
BEMÆRK: Sørg for, at fiskevandet dækker embryonerne. Sæt nogle embryoner til side for ikke at injicere kræftceller og bruge som kontrol. - Tænd for luftkilden og mikroinjektoren. Tag HeLa celler ud af inkubatoren og pipette cellerne op og ned 20-30x ved hjælp af en P200 spids. Belastning 3 μL celleblanding straks ind i en nål ved hjælp af en gel loading tip med en skåret ende. Sæt forsigtigt spidsen mod den skarpe nederste ende af nålen. Ryst om nødvendigt nålen for at sikre, at celleblandingen bevæger sig ned ad nålen for at fylde den skarpe ende.
- Sæt nålen ind i nåleholderen. Brug et par pincet til forsigtigt at bryde åbne spidsen af nålen. Juster trykket og varigheden af tid på mikroinjektoren for at skubbe alle luftboblerne ud inde i nålespidsen. Reducer tryk- og injektionsvarighedstiden, indtil størrelsen af injektionsdråberne er ~1 nL.
- Anvend injektionspladen under mikroskopet i en passende position til at få æggeblommesiden af embryoner, der vender mod nålen. Bedøve embryonerne ved at tilsætte fem dråber af den fortyndede MS222-opløsning (40 μg/ml).
- Anvend injektoren, og lad nålen røre ved perivitellinehulen i hvert embryon.
- Indsprøjt celleblandingen i embryonerne i det vaskulære område under perivitellinehulen ved at trykke på fodpedalen.
- Brug den ikke-dominerende hånd til at flytte injektionspladen til det næste embryo. Brug den dominerende hånd til at forlænge og trække injektoren tilbage, mens du trykker på fodpedalen samtidigt for at fortsætte injektionen. Pipette et par dråber sterilt fiskevand på embryoner, der er blevet injiceret. Når injektionen af alle embryoner på pladen er afsluttet, vaskes embryonerne af med sterilt fiskevand, de sættes på en steril petriskål, og de flyttes straks til inkubatoren på 35,5 °C.
- Efter 3 timer skal de injicerede embryoner undersøges, og de døde fjernes.
- De levende embryoner returneres til inkubatoren på 35,5 °C, og de inkuberes i 20-24 timer, så HeLa-cellerne kan sprede sig fra injektionsstedet til andre dele af kroppen.
BEMÆRK: Embryoner holdes i 35,5 °C inkubator for at muliggøre overlevelse og migration af humane kræftceller, fordi cellerne ikke gør godt ved 28,5 °C, temperaturen fisk embryoner er normalt inkuberet.
4. Injektion af nanopartikler eller køretøjer
- Bedøve de transplanterede embryoner næste morgen med fem dråber fortyndet MS222 opløsning. Må ikke tilføje for meget MS222, fordi dette vil dræbe embryoner. Under et fluorescerende mikroskop skal embryonerne forsigtigt afhentes med halemetastase af RFP+ HeLa-celler og placeres i en ny petriskål med sterilt fiskevand.
- Gør injektionsnålene som tidligere beskrevet i afsnit 2 ved hjælp af følgende indstillinger: tryk ved 500, varme ved 645, træk ved 60, hastighed ved 50 og tid/forsinkelse ved 100.
- Følg procedurerne i trin 3.1-3.3 for at justere embryoner og2laste køretøjet (f.eks.
- Der injiceres 0,5 nL 1 mg/ml nanopartikelopløsning bag øjet, og injektionen fortsættes som beskrevet i trin 3.5-3.6 (Figur 1B). Denne placering bag øjnene er beriget med kapillærer, så nanopartiklerne kan komme i omløb.
- Efter en lignende procedure injiceres det køretøjFigure 1A, C(f.eks.2
- Inkuber alle injicerede embryoner ved 35,5 °C.
5. Billeddannelse og sporing af nanopartikler og kræftceller
- Undersøg injicerede embryoner under et fluorescerende mikroskop ved 0, 30, 60, 90, 120, 180 og 210 min postinjektion af nanopartikler for at overvåge deres fordeling i omløb og graden af kræftcellemålretning. Målretning af kræftceller ved nanopartikler kan observeres så tidligt som 30 min postinjektion afhængigt af typen af nanopartikel testet.
- Rør 2-3 embryoner i en petriskål og immobilisere dem ved at tilføje fem dråber fortyndet MS222 opløsning (40 μg/ml). Når embryonerne holder op med at svømme, skal du fjerne det meste af vandet, så embryonerne kan ligge på deres sider.
- Brug en pipette med en tynd, blød børste fastgjort til enden for at justere embryonerne, så de ligger på deres sider med den forreste fremadvendte og kun det ene øje synligt.
- Image embryonerne i rød, blå og brightfield kanaler ved lav forstørrelse (2x) for at fange hele fosteret og gentag ved højere forstørrelse (6,4 x) for at fange haleområdet. Fokuser fosteret under den røde kanal for at undgå blødning af nanopartikler.
BEMÆRK: Embryonerne må ikke bevæge sig under billeddannelse. Enhver bevægelse vil føre til slørede billeder og manglende evne til at overlappe billeder fra forskellige kanaler. - Tilsæt frisk fiskevand til embryonerne umiddelbart efter billeddannelse og returnere dem til rugemaskinen. Gentag trin 5.2-5.4 for at afbilde embryonerne på forskellige tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolskemaet i figur 1 illustrerer de overordnede procedurer for denne undersøgelse. Gennemsigtige Casper mandlige og kvindelige voksne fisk blev avlet til at generere embryoner (afsnit 1). RFP+ HeLa-celler blev injiceret i det vaskulære område under zebrafiskembryonens perivitellinehulrum ved 48 hkf med ikke-injslede embryoner som kontrol (afsnit 3). For personer med erfaring i mikroinjektion er overlevelsesraten for embryoner ofte høj, og mindst 50 % af embryonerne transplanteres med kræftceller, der overlever i inkubatoren på 35,5 °C, et temperaturunderoptimale for zebrafiskembryoner, men som er nødvendige for at overleve og vandre i humane kræftceller. HeLa celler er meget invasive og kan intravasate og sprede sig til halen regionen af embryoner så hurtigt som 8 timer efter infektion. Ved 20-24 timer efter transplantation, ~ 50% af embryoner transplanteret viste tegn på metastatisk spredning af HeLa celler. Disse embryoner med kræftcellehalemetastaser blev udvalgt til downstream-forsøg. Ved 72 hkf blev disse embryoner efterfølgende injiceret bag øjnene enten med blå fluorescerende nanopartikler (afsnit 4 og figur 1B) eller udelukkende med køretøjet som betjeningsforanstaltninger (figur 1A). Aldersmatchede embryoner, der blev injiceret med nanopartikler, men uden transplantation af kræftceller, var den anden gruppe af kontroller (figur 1C). For mere detaljerede oplysninger om nanopartikel syntese, forberedelse og karakterisering se Peerzade et al.18.
Ved 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 min postinjektion af nanopartikler blev de injicerede embryoner overvåget ved billeddannelse for at bestemme samspillet mellem nanopartikler med RFP+ HeLa-celler ved hjælp af de køretøjsindsprøjtede embryoner som kontrol. Specifikt zebrafisk hale områder, hvor RFP + HeLa celler havde spredt sig til blev afbildet på rød, blå og brightfield belysning ved hjælp af en fluorescerende mikroskop (afsnit 5). Den detaljerede karakterisering af ultrabright nanopartiklers evne til at målrette xenografted kræftceller i zebrafisk over tid er vist i figur 5 i Peerzade et al.18. De røde prikker, der ses i halen af embryonerne, er metastatiske humane livmoderhalskræftceller, som var synlige i både køretøjs- og nanopartikelinje injicerede embryoner (figur 2A, D; Figur 3A, D). Som forventet blev der ikke påvist specifikke blå fluorescerende signaler i embryoner med kun køretøjsindsprøjtning (figur 2B, E). Desuden, når billederne taget i de røde og blå kanaler blev fusioneret, kun røde kræftceller i halen regionen uden nogen blå signaler blev observeret (Figur 2C, F). I embryoner, der blev injiceret med ultrarrelyserende silicananopartikler, var der imidlertid blå prikker i halerne, koncentreret nær og omkring kræftcellerne ved 3,5 time (Figur 3B, E). I de overlejrede billeder taget fra både røde og blå kanaler, røde HeLa celler og blå nanopartikler colocalized, ses som lyserøde prikker (Figur 3C, F). I de embryoner, der udelukkende blev injiceret med nanopartikler, men ikke transplanteret med HeLa-celler, koncentrerede de blå fluorescerende partikler sig ikke i bestemte celler eller områder, men blev relativt jævnt fordelt ind i embryonernes kredsløbssystem, hvilket fremhævede blodkar (Figur 4B, E). Som forventet blev der ikke påvist specifikke røde lysstofrør i disse embryoner på trods af nogle svage baggrundslysstofrøringssignaler (Figur 4A, C, D, F).
Denne protokol blev efterfølgende anvendt til at teste forskellige typer nanopartikler18,19,20. Colocalization af kræftceller med visse typer af nanopartikler blev observeret så tidligt som 30 min postinjektion afhængigt af egenskaberne af nanopartikel testet. Ved 120 min, var der > 80% målretning af kræftceller ved disse nanopartikler i halen regionen af fisken. Men for andre nanopartikler, minimal målretning af kræftceller blev observeret, i overensstemmelse med deres mangel på kræft-specifikke ligand. De detaljerede resultater og analyser er medtaget i Peerzade et al. (se figur 3 og figur 4, supplerende tal S12-S16 og supplerende tabel S6)18. Disse resultater viste differentieret målretning af nanopartikler til xenografted HeLa celler i zebrafisk. Således, ved hjælp af denne protokol, man bør være i stand til effektivt at vælge nanopartikler baseret på deres evne til at genkende og målrette metastatiske humane kræftceller in vivo.
Figur 1: Protokolskema for undersøgelse af nanopartiklers evne til at målrette humane kræftceller. Gennemsigtige Casper embryoner blev genereret gennem avl mandlige og kvindelige voksne fisk. Befrugtede embryoner blev indsamlet i en petriskål. Ved 48 hk blev RFP+ HeLa-celler injiceret i zebrafiskembryoner i perivitellinehulen, hvilket efterlod nogle aldersmatchede embryoner uopfordret som kontroller. Ved 72 hkf blev embryoner med metastatisk RFP+ HeLa-celler udvalgt og opdelt i to grupper: (A) injiceres med køretøj (H2O) som kontrol og(B)injiceres med nanopartikler suspenderet i H2O. Den tredje gruppe var aldersmatchede embryoner, der blev injiceret med nanopartikler alene (C). Alle tre grupper blev afbildet under et fluorescerende mikroskop. Det viste boxed område er, hvor billederne blev taget (se figur 2-Figur 4). Skalastænger for voksne fisk = 1 mm og for embryoner = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Zebrafisk transplanteret med metastatiske HeLa-celler uden nanopartikler. Kun røde fluorescerende HeLa-celler var synlige i individet (A, D) eller overlejrede billeder af den røde kanal og blå kanal (C, F). Der blev ikke påvist specifikke blå fluorescerende signaler i embryonet med kontrol af køretøjets indsprøjtning (B, E). Billeder i (A-C) viser fiskehaleregionen, der er bokset som i figur 1A. Billeder i (D-F) er forstørrede visninger af de boxed områder i (A-C). Skalastænger i (A-C) = 200 μm og i (D-F) = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kolokalkning af røde lysstofrørs HeLa-celler og blå fluorescerende nanopartikler i zebrafisk. Zebrafiskhalerne blev afbildet ved både lav (A-C) og høj (D-F)forstørrelse i den røde og blå kanal. Røde fluorescerende signaler afslørede metastatiske HeLa-celler (A, D), mens blå fluorescerende signaler viste nanopartiklerne (B, E). De overlejrede billeder fra både røde og blå kanaler (C, F) viser tokalkning af HeLa-celler og nanopartikler. Billederne blev taget efter 3,5 timer fra injektion med ultrabright silica nanopartikler. Billeder i (A-C) viser fiskehaleregionen som indskrænt i figur 1B. Billeder i (D-F) er forstørrede visninger af de boxed områder i (A-C). Skalastænger i (A-C) = 100 μm og i (D-F) = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Zebrafisk injiceres med nanopartikler uden humane HeLa-celler. Blå fluorescerende nanopartikler blev fordelt ind i omløbssystemet af embryoner i den enkelte (B, E) og overlejret billeder af den røde og blå kanal (C, F). Ingen specifik rød fluorescens var synlig ved enten lav eller høj forstørrelse (A, D) undtagen nogle baggrundsfluorescens fælles for zebrafisk embryoner. Billeder i (A-C) viser fiskehaleregionen som indskrænker i figur 1C. Billeder i (D-F) er forstørrede visninger af de boxed områder i (A-C). Skalastænger i (A-C) = 100 μm og i (D-F) = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet her, udnytter zebrafisken som et in vivo-system til at teste nanopartiklernes evne til at genkende og målrette metastatiske humane kræftceller. Flere faktorer kan påvirke en vellykket udførelse af forsøgene. For det første skal embryonerne udvikles fuldt ud ved 48 hk. Den korrekte udviklingsfase af embryonerne gør det muligt for dem at udholde og overleve transplantation af menneskelige kræftceller. Embryoner under 48 hk har en signifikant lavere overlevelsesrate sammenlignet med ældre og mere udviklede embryoner. For det andet bør kræftceller holdes så sunde som muligt ved at sikre, at de er: 1) i den eksponentielle vækstfase21,2) friskhøstet 30 min-1 h umiddelbart før transplantation, og 3) holdes varm på alle tidspunkter. For det tredje må nålen ikke være tilstoppet. Pipette HeLa cellerne op og ned mindst 20x før du lægger celleblandingen i nålen. For det fjerde skal der anvendes forskellige typer nåle til transplantation af humane kræftceller og injektion af nanopartikler. Nålen til human celletransplantation er relativt bred, med en vinkel for at undgå celle tilstopning, mens nålen til nanopartikel injektion er skarp og tynd. For det femte er injektionens placering forskellig. Placeringen for transplantation af humane celler er perivitelline hulrum, men for nanopartikel injektion, bør nålen indsættes bag øjet, hvor der er beriget kapillærer. Endelig er dygtighed af den person, der udfører transplantation spørgsmål. En erfaren person kan præcist injicere HeLa celler i perivitelline hulrum plads, mens en uerfaren person ofte injicerer tumorceller i æggeblomme område, hvor tumorceller næppe spredes i fiskekroppen. På samme måde er embryonernes overlevelsesrate meget højere, når de håndteres af en erfaren person, hvor mindst 50 % af embryonerne transplanteres med kræftceller, der overlever.
Selv om zebrafisk embryoner er normalt inkuberet ved 28,5 °C, menneskelige kræftceller kræver højere temperaturer for at overleve og migrere22,23. For at sikre overlevelse af både fiskeembryoner og humane kræftceller inkuberes embryoner, der transplanteres med humane kræftceller, i stedet ved 35,5 °C. Selv om det kan være lettere at levere kræftceller i æggeblomme sæk, de knap spredes i kredsløbet. Derfor er det afgørende at injicere kræftceller i det vaskulære område under den perivitelline hulrum for at sikre intravasation og spredning af kræftceller. Derudover skal man passe på ikke at tilføje for meget eller for koncentreret MS222, når bedøvelse embryonerne under injektion og billeddannelse. For at hjælpe med billeddannelse og visualisering af nanopartikler blev Casper zebrafisk valgt i stedet for AB fisk. Den Casper fisk er en dobbelt mutant for Nacre og Roy, der mangler melanocytter og iridophores, hvilket resulterer i øget gennemsigtighed i forhold til AB fisk14. Gennemsigtigheden af Casper zebrafisk gør det muligt at overvåge spredningen af nanopartikler i omløb og målretningen af nanopartiklerne mod kræftceller. Udfordringen ved denne protokol er den relativt høje dødelighed af embryoner, hvis en uerfaren person udfører transplantation af humane kræftceller. Interessant, injektion af nanopartikler lidt bag øjnene er relativt veltolereret. Dette skyldes sandsynligvis brugen af tyndere nåle i forhold til de nåle, der anvendes til tumorcelletransplantation. For at undgå at beskadige humane kræftceller, skal man bruge nåle med brede åbninger, men disse kan føre til skader på embryoner, hvis håndteres uhensigtsmæssigt.
Denne protokol udnytter Casper zebrafisk til at visualisere målretning af metastatiske kræftceller med funktionaliserede nanopartikler in vivo. En stor fordel ved denne analyse er, at det gør det muligt for forskerne at udføre real-time imaging i løbet af zebrafisk udvikling til at overvåge samspillet mellem kræftceller med nanopartikler. Faktisk, på grund af sin høje frugtbarhed og hurtig udvikling, zebrafisk giver forskeren mulighed for at opnå resultater på bare afewdage 18,,19,20,24. Desuden giver denne analyse også mulighed for at fjerne giftige nanopartikler fra yderligere forskning, hvis de fleste embryoner dør efter injektion af en bestemt type nanopartikel. Selv om zebrafisken ikke er et pattedyr, letter den udvælgelsen af et stort antal nanopartikler på en hurtig og økonomisk måde, hvilket giver nyttige oplysninger til downstream-undersøgelser i store dyr og kliniske forsøg. Samlet set gør zebrafisken en forskel inden for nanomedicin og nanoteknologi ved at hjælpe med at udvælge egnede nanoprober til tidlig påvisning og potentiel ødelæggelse af kræftceller gennem kræftspecifik målretning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
I.S. erklærer interesse i NanoScience Solutions, LLC (modtager af STTR NIH R41AI142890 tilskud). Alle andre forfattere erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ms Kaylee Smith, Ms Lauren Kwok, og Mr. Alexander Floru for korrekturlæsning af manuskriptet. H.F. anerkender tilskud fra NIH (CA134743 og CA215059), American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) og St. Baldrick's Foundation. F.J.F.L. anerkender et stipendium fra Boston University Innovation Center-BUnano cross-disciplinæruddannelse i nanoteknologi for kræft (XTNC). I.S anerkender NSF-støtte (tilskud CBET 1605405) og NIH R41AI142890.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
- Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer. Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).
- Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).
- Chinen, A. B., et al. Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence. Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).
- Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer. Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).
- Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes. Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).
- Sharkey, F. E., Fogh, J. Considerations in the use of nude mice for cancer research. Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Liu, S., Leach, S. D. Zebrafish models for cancer. Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
- Anderson, N. M., et al. The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis. Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).
- Peerzade, S., et al. Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish. Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).
- Peng, B., et al. Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).
- Peng, B., et al. Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Data in Brief. 22, 383-391 (2019).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Rao, P. N., Engelberg, J. Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle. Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).
