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Cancer Research

वीवो में ज़ेब्राफ़िश में कार्यात्मक फ्लोरोसेंट सिलिका नैनोकणों के साथ Xenografted मानव कैंसर कोशिकाओं का लक्ष्यीकरण

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/61187
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2,3,4, 1
1Departments of Pharmacology and Medicine, Section of Hematology and Medical Oncology, The Cancer Research Center, Boston University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Tufts University, 3Department of Mechanical Engineering, Tufts University, 4Department of Physics, Tufts University
* These authors contributed equally

Summary

यहां वर्णित वीवो में मानव कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए कार्यात्मक नैनोकणों की क्षमता का अध्ययन करने के लिए जेब्राफिश भ्रूण का उपयोग करने के लिए एक विधि है । यह विधि बड़े जानवरों और नैदानिक परीक्षणों में भविष्य के परीक्षण के लिए इष्टतम नैनोकणों के मूल्यांकन और चयन के लिए अनुमति देती है।

Abstract

नैनोमेडिसिन के क्षेत्र में कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने, लक्षित करने और नष्ट करने में सक्षम नैनोकणों का विकास करना बहुत रुचि रखता है। वीवो पशु मॉडल में नैनो को इसके बायोमेडिकल एप्लीकेशन में पाटने के लिए आवश्यक हैं। माउस प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए पारंपरिक पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है; हालांकि, चूहों को रखने के लिए अपेक्षाकृत महंगा है और प्रत्येक मां से सीमित संतान के कारण लंबे समय तक प्रयोगात्मक चक्र हैं। जेब्राफिश कैंसर रिसर्च सहित विकासात्मक और बायोमेडिकल रिसर्च के लिए एक शक्तिशाली मॉडल सिस्टम के रूप में उभरा है। विशेष रूप से, इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता और तेजी से विकास के कारण, जेब्राफिश भ्रूण कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार और उनके माइक्रोएनवायरमेंट के साथ उनकी बातचीत की वीवो निगरानी में वास्तविक समय के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। इस विधि को क्रमिक रूप से मानव कैंसर कोशिकाओं को पेश करने और पारदर्शी कैस्पर जेब्राफिश भ्रूण में कार्यात्मक नैनोकणों को पेश करने और वास्तविक समय में नैनोकणों द्वारा कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने और वीवो मान्यता में निगरानी करने के लिए विकसित किया गया था। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल से पता चलता है कि फ्लोरोसेंटली लेबल नैनोकण, जो फोलेट समूहों के साथ कार्यात्मक हैं, विशेष रूप से मेटास्टैटिक मानव सर्वाइकल एपिथेलियल कैंसर कोशिकाओं को एक अलग फ्लोरोक्रोम के साथ लेबल कर सकते हैं। मान्यता और लक्ष्यीकरण प्रक्रिया नैनोकणों के परीक्षण के 30 मिनट के बाद के रूप में जल्दी हो सकती है। पूरे प्रयोग के लिए केवल वयस्क मछली के कुछ जोड़े के प्रजनन की आवश्यकता होती है और इसे पूरा करने में 4 दिन से भी कम समय लगता है। इसके अलावा, ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में एक कार्यात्मक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी होती है, जिससे मानव कैंसर कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की एनग्रफ्टमेंट की अनुमति होती है। इसलिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल की उपयोगिता विभिन्न प्रकार की मानव कैंसर कोशिकाओं पर नैनोकणों के परीक्षण को सक्षम बनाती है, जिससे स्तनधारियों और क्लिनिक में भविष्य के परीक्षण के लिए प्रत्येक विशिष्ट कैंसर संदर्भ में इष्टतम नैनोकणों के चयन की सुविधा मिलती है ।

Introduction

नैनोकणों का विकास जो कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने, लक्षित करने और नष्ट करने में सक्षम हैं, भौतिकविदों और जैव चिकित्सा शोधकर्ताओं दोनों के लिए बहुत रुचि रखते हैं। नैनोमेडिसिन के उद्भव से कई नैनोकणों का विकास हुआ, जैसे कि लिगांड और/या कीमोथेमोटिक दवाओं को लक्षित करने के साथ संयुग्मित1,,2,,3। नैनोकणों के जोड़े गए गुण जैविक प्रणाली के साथ उनकी बातचीत को सक्षम करते हैं, चिकित्सीय अनुप्रयोगों के साथ उच्च दक्षता और सटीकता के साथ जैविक घटनाओं को संवेदन और निगरानी करते हैं। सोने और आयरन ऑक्साइड नैनोकणों का उपयोग मुख्य रूप से क्रमशः गणना टोमोग्राफी और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग अनुप्रयोगों में किया जाता है। जबकि सोने और आयरन ऑक्साइड नैनोकणों की एंजाइमेटिक गतिविधियां कोलोरिमेट्रिक परख के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति देती हैं, फ्लोरोसेंट नैनोकण वीवो इमेजिंग अनुप्रयोगों 4 में अच्छीतरहसे अनुकूल हैं। उनमें से, अल्ट्राब्राइट फ्लोरोसेंट नैनोकण विशेष रूप से फायदेमंद होते हैं, उनके कम कणों और कम विषाक्तता5के साथ जल्दी कैंसर का पता लगाने की क्षमता के कारण।

इन फायदों के बावजूद, नैनोकणों को उपयुक्त नैनोमैटेरियल्स के चयन और संश्लेषण प्रक्रिया के अनुकूलन के लिए वीवो पशु मॉडल में उपयोग करके प्रयोग की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, दवाओं की तरह, नैनोकण अपनी प्रभावकारिता और विषाक्तता निर्धारित करने के लिए प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए पशु मॉडल पर भरोसा करते हैं। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया preclinical मॉडल माउस है, जो एक स्तनपायी जिसका रखरखाव एक अपेक्षाकृत उच्च लागत पर आता है । कैंसर के अध्ययन के लिए, या तो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों या ज़ेनोबेड़ा चूहों का उपयोग आमतौर पर6, 7,कियाजाताहै। इन प्रयोगों की लंबाई अक्सर हफ्तों से महीनों तक फैली होती है। विशेष रूप से, कैंसर मेटास्टेसिस अध्ययन के लिए, कैंसर कोशिकाओं को सीधे पूंछ नसों और,तिल्ली8,9,10जैसे स्थानों पर चूहों की संचार प्रणाली में इंजेक्ट किया जाता है।, ये मॉडल केवल मेटास्टेसिस के अंतिम चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं जब ट्यूमर कोशिकाएं दूर के अंगों को असाधारण और उपनिवेश करती हैं। इसके अलावा, दृश्यता के मुद्दों के कारण, चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं के ट्यूमर सेल माइग्रेशन और नैनोपार्टिकल को लक्षित करने की निगरानी करना विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है।

जेब्राफिश(दानियो रेरियो)अपनी उच्च fecundity, कम लागत, तेजी से विकास, ऑप्टिकल पारदर्शिता, और आनुवंशिक संरक्षण11, 12,12के कारण कैंसर अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली कशेरुकी प्रणाली बन गया है । माउस मॉडल पर ज़ेब्राफ़िश का एक और लाभ मछली के अंडे पूर्व गर्भाशय का निषेचन है, जो भ्रूण को उनके पूरे विकास में निगरानी करने की अनुमति देता है। जेब्राफिश में भ्रूणीय विकास तेजी से होता है, और 24 घंटे के भीतर पोस्टफर्टिलाइजेशन (एचपीएफ), कशेरुकी शरीर विमान पहले ही13बना चुका है। 72 एचपीएफ तक, अंडे कोरियोन से रची जाती हैं, जो भ्रूण से फ्राई स्टेज में संक्रमण करते हैं। जेब्राफिश की पारदर्शिता, विशेष रूप से14में कैस्पर तनाव, कैंसर कोशिकाओं के प्रवास और उनकी मान्यता और एक जीवित जानवर में नैनोकणों द्वारा लक्षित करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। अंत में, ज़ेब्राफ़िश 48 एचपीएफ द्वारा अपनी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित करता है, जिसमें अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली पिछड़ जाती है और केवल 28 दिनों के बाद15पर कार्यात्मक हो जाती है। इस समय अंतर प्रतिरक्षा अस्वीकृति का अनुभव किए बिना जेब्राफिश भ्रूण में मानव कैंसर कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के प्रत्यारोपण के लिए आदर्श है।

यहां वर्णित एक तरीका है जो वीवो में फ्लोरोसेंट नैनोकणों द्वारा मानव कैंसर कोशिकाओं की मान्यता और लक्ष्यीकरण को प्रदर्शित करने के लिए जेब्राफिश की पारदर्शिता और तेजी से विकास का लाभ उठाता है। इस परख में, मानव गर्भाशय ग्रीवा कैंसर कोशिकाओं (HeLa कोशिकाओं) आनुवंशिक रूप से एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर ४८ hpf भ्रूण के पेरिविटेलिन गुहा में संवहनी क्षेत्र में इंजेक्शन थे । 20-24 घंटे के बाद, HeLa कोशिकाओं को पहले से ही मछली संचार प्रणाली के माध्यम से भ्रूण भर में फैल गया था । स्पष्ट मेटास्टेसिस वाले भ्रूण सीधे आंख के पीछे नैनोपार्टिकल समाधान के ~ 0.5 एन एल के साथ माइक्रोइंटेक्टेड थे, जहां समृद्ध केशिका बिस्तर स्थित है। इस तकनीक का उपयोग करके, अल्ट्राब्राइट फ्लोरोसेंट सिलिका नैनोकणों 20-30 मिनट के बाद के रूप में जल्दी के रूप में हेला कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं । अपनी सादगी और प्रभावशीलता के कारण, ज़ेब्राफिश विशिष्ट कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने की क्षमता के लिए विभिन्न नैनोकणों का परीक्षण करने के लिए वीवो मॉडल में एक मजबूत का प्रतिनिधित्व करता है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा प्रोटोकॉल के तहत बोस्टन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में अनुमोदित किया गया था #: PROTO201800543 ।

1. कैस्पर जेब्राफिश भ्रूण की पीढ़ी

  1. पारदर्शी कैस्पर जेब्राफिश भ्रूण उत्पन्न करने के लिए प्राकृतिक प्रजनन के लिए कम से कम 3 महीने की उम्र वाले वयस्क कैस्पर मछली चुनें।
  2. शाम को मछली के पानी के साथ दो चैंबर संभोग टैंक भरें, डिवाइडर का उपयोग करके ऊपरी टैंकों को अलग करें, एक नर मछली को चैंबर के एक तरफ रखें और एक या दो मादा मछली को चैंबर के दूसरी तरफ रखें, और मछलियों को डिवाइडर से रात भर अलग छोड़ दें ।
  3. अगली सुबह 8:00 बजे जब लाइटें ऑन होती हैं तो डिवाइडर को बाहर निकालें । कृत्रिम संवर्धन पौधों को जोड़ें और पानी का एक उथला क्षेत्र बनाने के लिए शीर्ष कक्ष को थोड़ा झुकाएं। मछली को 3-4 घंटे के लिए प्रजनन करने की अनुमति दें।
  4. मछली युक्त टैंकों के शीर्ष कक्षों को उठाएं और उन्हें अपने मूल टैंकों में वापस करें।
  5. जाल जाल के माध्यम से पानी डालकर नीचे कक्षों में स्थित अंडे ले लीजिए। प्रति डिश 200 अंडे से अधिक घनत्व पर एक बाँझ पेट्री डिश में अंडे स्थानांतरित करें। किसी भी मृत या निषेचित अंडे निकालें और ताजा मछली के पानी के साथ भरा पकवान 2/3 भरें ।
    नोट: निषेचित और स्वस्थ अंडे पारदर्शी और गोल होना चाहिए। बादल छाए हुए, सफेद या विकृत होने वाले किसी भी अंडे को हटा दिया जाना चाहिए। मछली की सुविधा में मछली के टैंकों से मछली का पानी प्राप्त किया जाता है।
  6. इनक्यूबेटर में रात 28.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड भ्रूण।
  7. अगली सुबह भ्रूण को ब्लीच करें, जैसा कि जेब्राफिश बुक16में वर्णित मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके, और भ्रूण को इनक्यूबेटर (वैकल्पिक चरण) में वापस डाल दिया।
  8. दोपहर में इनक्यूबेटर से बाहर 24 एचपीएफ भ्रूण ले लो और उच्चारण का उपयोग कर भ्रूण dechorionate ।
    1. पेट्री डिश में भ्रूण से जितना संभव हो उतना मछली का पानी निकालें और डिश में प्रोनेस सॉल्यूशन (1 मिलीग्राम/एमएल इन फिश वॉटर) की कुछ बूंदें डालें । धीरे-धीरे पेट्री डिश को चक्कराएं। एक बार chorions विघटन के लक्षण दिखाने के लिए, भ्रूण को छोड़ने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट ।
    2. एक बार भ्रूण के बहुमत chorions से बाहर कर रहे हैं प्रक्रिया को समाप्त करने के लिए पेट्री डिश में तुरंत ताजा मछली का पानी जोड़ें । फ्लोटिंग कोशन्स को हटाने के लिए मछली के पानी का उपयोग करके भ्रूण 3x अधिक कुल्लाएं। भ्रूण को इनक्यूबेटर में लौटाएं।

2. प्रत्यारोपण के लिए मानव कैंसर कोशिकाओं की तैयारी

  1. इनक्यूबेटर तापमान को ठीक 35.5 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। इनक्यूबेटर के अंदर थर्मामीटर का उपयोग करके एक सुसंगत और स्थिर तापमान सुनिश्चित करने के लिए इनक्यूबेटर की निगरानी करें।
  2. एक गिलास की बोतल में मछली के पानी के 1 एल autoclave । 3 ग्राम इलेक्ट्रोफोरेसिस-ग्रेड एग्राज को 100 मिलीलीटर ऑटोक्लेव मछली के पानी और माइक्रोवेविंग में जोड़कर 3% एगरेवर समाधान बनाएं जब तक कि एगर उठी पूरी तरह से भंग न हो जाए।
    1. एक पेट्री डिश में गर्म agarose समाधान डालो जब तक यह 3/4 भरा है । एगरेज पर माइक्रोइंजेक्शन मोल्ड रखें। सुनिश्चित करें कि मोल्ड पेट्री डिश के नीचे के संपर्क में नहीं है और नीचे कोई बुलबुले नहीं बनाते हैं।
    2. समाधान को जमना और ध्यान से प्लेट से मोल्ड को हटाने की अनुमति दें। प्लेट को ऑटोक्लेव मछली के पानी से भरें और प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। हेला कोशिकाओं को संचयन करने से पहले 35.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एगर उठे प्लेट और मछली के पानी को पूर्वाद्ध करना।
  3. निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके एक पिपेट पुलर पर 1.0 मिमी O.D. x 0.78 मिमी बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाएं खींचें: 500 पर दबाव, 560 पर गर्मी, 100 पर खींचें, 100 पर वेग, और 200 में समय/ एक बड़े पेट्री डिश में पुट्टी पर सुई स्टोर करें जिसे इथेनॉल तौलिया से मिटा दिया गया है।
    सावधानी: खींची गई सुई बहुत तेज और नाजुक होती है। हैंडलिंग करते समय सावधानी बरतें।
  4. MS222 को ऑटोक्लेव मछली के पानी में घोलकर ट्राइकेन मीथेनसुलफोनेट (MS222, 4 मिलीग्राम/एमएल) का स्टॉक समाधान तैयार करें । भंवर अच्छी तरह से उपयोग से पहले। मछली के पानी में पतला MS222 स्टॉक समाधान 1:100 (यानी, निम्नलिखित प्रक्रियाओं के लिए भ्रूण को एनेस्थेटाइज करने के लिए 40 माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए मछली के पानी के 20 एमएल में MS222 स्टॉक समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें।
  5. संस्कृति hLabel HeLa कोशिकाओं उन्हें PLenti6.2_miRFP670 लेंटीवायरस के साथ प्रेरित करके प्रोटोकॉल का उपयोग कर17वर्णित । हार्वेस्ट आरएफपी + हेला कोशिकाएं प्रत्यारोपण से पहले 30 मिनट-1 घंटे ।
    नोट: मानव HeLa कोशिकाओं को एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 70% तक पूर्ण विकास माध्यम (10% एफबीएस के साथ डीएमईएम माध्यम) में 5% सीओ2के साथ पूरक 37 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत किया गया है।
    1. एक ऊतक संस्कृति हुड में आकांक्षा द्वारा HeLa सेल माध्यम निकालें। सीरम के सभी निशान को हटाने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ सेल परत संक्षेप में कुल्ला।
    2. टी-75 फ्लास्क में बाँझ ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान का 3.0 एमएल जोड़ें और एंजाइमेटिक पाचन की सुविधा के लिए कोशिकाओं को 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में वापस रखें। माइक्रोस्कोप के नीचे फ्लास्क का निरीक्षण करें जब तक कि ~ 80% कोशिकाएं निलंबित न हो जाए।
    3. फ्लास्क में पूर्ण विकास माध्यम का 6-8 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को धीरे-धीरे पाइपिंग करके 15 एमएल बाँझ ट्यूब में ले जाएं। 5 मिनट के लिए 135 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    4. सुपरनेट और रिसिपेंड हेला कोशिकाओं को पूर्ण विकास माध्यम के 3 एमएल में एएसपिरेट करें। उपरोक्त वाशिंग स्टेप 2x दोहराएं। कोशिकाओं को पूर्ण विकास माध्यम के 1 एमएल में पुनर्साइपेंड करें और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की गणना करें।
    5. कोशिकाओं को फिर से स्पिन करें, सुपरनैंट को हटा दें, और कोशिकाओं को 5 x 107 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में फिर से खर्च करें। मछली की सुविधा के लिए परिवहन करते समय एक हाथ में ट्यूब पकड़ कर कोशिकाओं को गर्म रखें।
      नोट: भ्रूण को इंजेक्शन लगाने से पहले या उसके दौरान 35.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के अंदर कोशिकाओं को संग्रहीत करके कोशिकाओं को हमेशा गर्म रखें।

3. मानव कैंसर कोशिकाओं का प्रत्यारोपण

  1. प्रत्यारोपण से पहले इथेनॉल तौलिए का उपयोग कर कार्य क्षेत्र को साफ करें (उदाहरण के लिए, कैंची, चिमटी, प्लास्टिक पिपेट, रेजर ब्लेड)।
  2. प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके एगर उठे प्लेट के खांचे के भीतर भ्रूण को संरेखित करें। आगे का सामना करना पड़ पूर्वकाल के साथ पक्ष पर भ्रूण रखना ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि मछली का पानी भ्रूण को कवर करता है । कैंसर की कोशिकाओं को इंजेक्ट न करने और नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए कुछ भ्रूण को अलग रखें।
  3. हवा के स्रोत और माइक्रोइंजेक्टर चालू करें। हेला कोशिकाओं को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और पी 200 टिप का उपयोग करके कोशिकाओं को 20-30x ऊपर और नीचे पिपेट करें। एक कट अंत के साथ एक जेल लोडिंग टिप का उपयोग करके तुरंत सुई में सेल मिश्रण के 3 माइक्रोन लोड करें। ध्यान से सुई के तेज नीचे अंत की ओर टिप डालें। यदि आवश्यक हो, तो यह सुनिश्चित करने के लिए सुई को हिलाएं कि सेल मिश्रण तेज अंत को भरने के लिए सुई को नीचे ले जाता है।
    1. सुई धारक में सुई डालें। सुई की नोक को ध्यान से तोड़ने के लिए चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करें। सुई टिप के अंदर हवा के बुलबुले के सभी बाहर धक्का करने के लिए माइक्रोइंजेक्टर पर दबाव और समय की अवधि को समायोजित करें। इंजेक्शन की बूंदों का आकार ~ 1 एनएल होने तक दबाव और इंजेक्शन अवधि के समय को कम करें।
    2. इंजेक्शन प्लेट को माइक्रोस्कोप के नीचे एक उपयुक्त स्थिति में रखें ताकि सुई का सामना करने वाले भ्रूण की जर्दी पक्ष हो। पतला MS222 समाधान (४० μg/mL) की पांच बूंदें जोड़कर भ्रूण को एनेस्थेटाइज करें ।
    3. इंजेक्टर की स्थिति और सुई प्रत्येक भ्रूण के पेरिविटेलिन गुहा को छूने के लिए अनुमति देते हैं।
  4. पैर पेडल दबाकर पेरिविटेललाइन गुहा के तहत संवहनी क्षेत्र में भ्रूण में कोशिका मिश्रण इंजेक्ट करें।
  5. इंजेक्शन प्लेट को अगले भ्रूण में ले जाने के लिए गैर-घरेलू हाथ का उपयोग करें। इंजेक्शन जारी रखने के लिए एक साथ पैर पेडल दबाने के दौरान इंजेक्टर का विस्तार और वापस लेने के लिए प्रमुख हाथ का उपयोग करें। पिपेट भ्रूण है कि इंजेक्शन दिया गया है पर बाँझ मछली के पानी की कुछ बूंदें । एक बार थाली पर सभी भ्रूण का इंजेक्शन पूरा हो जाने के बाद, भ्रूण को बाँझ मछली के पानी से धो लें, उन्हें बाँझ पेट्री डिश पर रखें और तुरंत उन्हें 35.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ले जाएं।
  6. 3 घंटे के बाद, इंजेक्शन भ्रूण की जांच करें और मृत लोगों को हटा दें।
  7. जीवित भ्रूण को 35.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस करें और उन्हें 20-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें ताकि हेला कोशिकाओं को इंजेक्शन साइट से शरीर के अन्य हिस्सों में फैलने की अनुमति मिल सके।
    नोट: भ्रूण को मानव कैंसर कोशिकाओं के अस्तित्व और प्रवास की अनुमति देने के लिए 35.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जाता है क्योंकि कोशिकाएं 28.5 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से नहीं करती हैं, तापमान मछली भ्रूण सामान्य रूप से इनक्यूबेटेड होते हैं।

4. नैनोकणों या वाहन का इंजेक्शन

  1. प्रत्यारोपित भ्रूण पतला MS222 समाधान की पांच बूंदों के साथ अगली सुबह एनेस्थेटाइज करें। बहुत ज्यादा MS222 जोड़ने के लिए मत करो, क्योंकि यह भ्रूण को मार डालेगा। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत, ध्यान से आरएफपी + हेला कोशिकाओं की पूंछ मेटास्टेसिस के साथ भ्रूण उठाओ और उन्हें बाँझ मछली के पानी के साथ एक नई पेट्री डिश में रखें।
  2. इंजेक्शन सुई के रूप में पहले निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग कर अनुभाग 2 में वर्णित करें: ५०० पर दबाव, ६४५ पर गर्मी, ६० पर खींच, ५० पर वेग, और समय/
  3. भ्रूण और लोड वाहन (जैसे, एच 2 ओ) या सुई में नैनोपार्टिकल समाधान को संरेखित करने के लिए चरण3.1-3.3में प्रक्रियाओं का पालन करें।
  4. आंख के पीछे 1 मिलीग्राम/एमएल नैनोपार्टिकल सॉल्यूशन का 0.5 एनएल इंजेक्ट करें और इंजेक्शन को जारी रखें जैसा कि स्टेप्स 3.5-3.6(चित्रा 1बी)में वर्णित है । आंखों के पीछे यह स्थान केशिकाओं से समृद्ध होता है, जिससे नैनोकणों को परिसंचरण में प्रवेश करने की अनुमति होती है।
  5. इसी तरह की प्रक्रिया के बाद, वाहन (जैसे, एच2ओ) को इंजेक्ट करें जिसका उपयोग नैनोकणों को भ्रूण में हेला कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित करने और बिना (यानी, नियंत्रण)(चित्र 1ए, सी)के साथ निलंबित करने के लिए किया गया था।
  6. 35.5 डिग्री सेल्सियस पर सभी इंजेक्शन भ्रूण इनक्यूबेट।

5. नैनोकणों और कैंसर कोशिकाओं की इमेजिंग और ट्रैकिंग

  1. 0, 30, 60, 90, 120, 180, और 210 मिनट नैनोकणों के बाद परिसंचरण में उनके वितरण और कैंसर सेल लक्ष्यीकरण की डिग्री की निगरानी करने के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत इंजेक्शन भ्रूण की जांच करें। नैनोकणों द्वारा कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए नैनोपार्टिकल परीक्षण के प्रकार के आधार पर 30 मिनट पोस्टइंटिनेक्शन के रूप में देखा जा सकता है।
  2. एक पेट्री डिश में पिपेट 2-3 भ्रूण और पतला MS222 समाधान (४० μg/mL) की पांच बूंदें जोड़कर उन्हें स्थिर । एक बार भ्रूण तैराकी बंद करो, पानी के अधिकांश निकालने के लिए भ्रूण अपने पक्ष पर झूठ बोलने की अनुमति है ।
  3. भ्रूण को संरेखित करने के लिए इसके अंत से जुड़े पतले, नरम ब्रश के साथ एक पिपेट का उपयोग करें ताकि वे आगे का सामना कर रहे पूर्वकाल के साथ अपने पक्ष पर झूठ बोलें और केवल एक आंख दिखाई दे।
  4. पूरे भ्रूण को पकड़ने और पूंछ क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए उच्च आवर्धन (6.4x) पर दोहराने के लिए कम आवर्धन (2x) पर लाल, नीले और ब्राइटफील्ड चैनलों में भ्रूण की छवि। नैनोकणों के रक्तस्राव से बचने के लिए लाल चैनल के नीचे भ्रूण पर ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: भ्रूण इमेजिंग के दौरान कदम नहीं होना चाहिए । किसी भी आंदोलन धुंधली छवियों और विभिन्न चैनलों से छवियों को ओवरलैप करने में असमर्थता का कारण बनेगा।
  5. इमेजिंग के तुरंत बाद भ्रूण में ताजा मछली का पानी डालें और उन्हें इनक्यूबेटर में वापस कर दें। विभिन्न समय बिंदुओं पर भ्रूण छवि के लिए कदम 5.2-5.4 दोहराएं ।

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Representative Results

चित्रा 1 में प्रोटोकॉल योजनाबद्ध इस अध्ययन के लिए समग्र प्रक्रियाओं को दिखाता है। पारदर्शी Casper पुरुष और महिला वयस्क मछली भ्रूण (धारा 1) उत्पन्न करने के लिए पैदा किए गए थे । आरएफपी + हेला कोशिकाओं को 48 एचपीएफ में जेब्राफिश भ्रूण के पेरिविटेललाइन गुहा के तहत संवहनी क्षेत्र में इंजेक्ट किया गया था, जिसमें नियंत्रण (धारा 3) के रूप में यूनिंजेक्टेड भ्रूण थे। माइक्रोइंजेक्शन में अनुभवी व्यक्तियों के लिए, भ्रूण की जीवित रहने की दर अक्सर अधिक होती है, जिसमें कम से कम 50% भ्रूण कैंसर कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित होते हैं, जो 35.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जीवित रहते हैं, जो जेब्राफिश भ्रूण के लिए एक तापमान उप-क्षतक है लेकिन मानव कैंसर कोशिकाओं के जीवित रहने और प्रवास के लिए आवश्यक है। HeLa कोशिकाओं अत्यधिक आक्रामक हैं और 8 घंटे के बाद के रूप में जल्दी के रूप में भ्रूण के पूंछ क्षेत्र में फैल सकता है। 20-24 घंटे के बाद प्रत्यारोपण, प्रत्यारोपित भ्रूण के ~ ५०% HeLa कोशिकाओं के मेटास्टैटिक प्रसार के लक्षण दिखाया । कैंसर सेल टेल मेटास्टेस वाले उन भ्रूणों को डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए चुना गया था । ७२ एचपीएफ में, इन भ्रूणों को बाद में आंखों के पीछे या तो नीले फ्लोरोसेंट नैनोकणों (धारा 4 और चित्रा 1बी)या पूरी तरह से नियंत्रण के रूप में वाहन के साथ इंजेक्शन दियागया (चित्रा 1ए)। आयु मिलान भ्रूण नैनोकणों के साथ इंजेक्शन लेकिन कैंसर सेल प्रत्यारोपण के बिना नियंत्रण के दूसरे समूह(चित्रा 1सी)थे । नैनोपार्टिकल संश्लेषण, तैयारी और लक्षण वर्णन के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी के लिए पीयरजादे एट अल18देखें।

नैनोकणों के 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 मिनट के पोस्टिनजेक्शन पर, इंजेक्शन भ्रूण को नियंत्रण के रूप में वाहन इंजेक्शन भ्रूण का उपयोग करके आरएफपी + हेला कोशिकाओं के साथ नैनोकणों की बातचीत निर्धारित करने के लिए इमेजिंग द्वारा निगरानी की गई थी। विशेष रूप से, जेब्राफिश पूंछ क्षेत्र जहां आरएफपी + हेला कोशिकाओं में फैल गया था, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (सेक्शन 5) का उपयोग करके लाल, नीले और ब्राइटफील्ड रोशनी पर चित्रित किया गया था। समय के साथ जेब्राफिश में ज़ेनोबेड़ा कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए अल्ट्राब्राइट नैनोकणों की क्षमता का विस्तृत लक्षण वर्णन पीयरजादे एट अल अल18के चित्र 5 में दिखाया गया है। भ्रूण की पूंछ में देखे गए लाल बिंदु मेटास्टैटिक मानव ग्रीवा कैंसर कोशिकाएं हैं जो वाहन और नैनोपार्टिकल-इंजेक्शन भ्रूण दोनों में दिखाई दे रही थीं(चित्रा 2ए, डी; चित्रा 3ए, डी)। जैसा कि अपेक्षित था, वाहन-केवल इंजेक्शन(चित्रा 2बी, ई)के साथ भ्रूण में कोई विशिष्ट नीले फ्लोरोसेंट संकेतों का पता नहीं चला। इसके अतिरिक्त, जब लाल और नीले चैनलों में कैप्चर की गई छवियों को मर्ज किया गया, तो बिना किसी नीले संकेतों के पूंछ क्षेत्र में केवल लाल कैंसर कोशिकाओं को देखा गया(चित्रा 2सी, एफ)। हालांकि, अल्ट्राब्राइट फ्लोरोसेंट सिलिका नैनोकणों के साथ इंजेक्शन वाले भ्रूण में, पूंछ में नीले बिंदु थे, जो कैंसर कोशिकाओं के पास और उसके आसपास 3.5 घंटे(चित्रा 3बी, ई)पर केंद्रित थे। लाल और नीले दोनों चैनलों से कैप्चर की गई मढ़ा छवियों में, लाल हेला कोशिकाओं और नीले नैनोकणों को कोलोलाइज्ड किया गया, गुलाबी डॉट्स(चित्रा 3सी, एफ)के रूप में देखा जाता है। उन भ्रूणों में जो पूरी तरह से नैनोकणों के साथ इंजेक्शन दिए गए थे, लेकिन हेला कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित नहीं किए गए थे, नीले फ्लोरोसेंट कणों ने किसी विशेष कोशिकाओं या क्षेत्रों में ध्यान केंद्रित नहीं किया, लेकिन भ्रूण की संचार प्रणाली में अपेक्षाकृत समान रूप से वितरित किया, रक्त वाहिकाओं(चित्रा 4बी, ई)पर प्रकाश डाला । जैसा कि उम्मीद थी, कुछ कमजोर पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट संकेतों(चित्रा 4ए, सी, डी, एफ)के बावजूद इन भ्रूणों में कोई विशिष्ट लाल फ्लोरोसेंट संकेत नहीं पाए गए।

बाद में इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रकार के नैनोकणों18 , 19,,20का परीक्षण करने के लिए किया गया था .19 नैनोपार्टिकल के गुणों के आधार पर 30 मिनट के बाद के रूप में 30 मिनट के बाद के रूप में नैनोकणों के साथ कैंसर कोशिकाओं के कोलोकैलाइजेशन को देखा गया। 120 मिनट तक, मछली के पूंछ क्षेत्र में इन नैनोकणों द्वारा कैंसर कोशिकाओं को लक्षित किया गया था । हालांकि, अन्य नैनोकणों के लिए, कैंसर कोशिकाओं का न्यूनतम लक्ष्यीकरण देखा गया, जो कैंसर-विशिष्ट लिगांड की कमी के अनुरूप था। विस्तृत परिणाम और विश्लेषण पीयरजादे एट अल में शामिल हैं ( चित्रा 3 और चित्रा 4, अनुपूरक आंकड़े S12-S16, और अनुपूरक तालिका S6 देखें)18। इन परिणामों ने जेब्राफिश में जेनोबेड़ा हेला कोशिकाओं के लिए नैनोकणों के अंतर लक्ष्यीकरण का प्रदर्शन किया । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, किसी को वीवो में मेटास्टैटिक मानव कैंसर कोशिकाओं को पहचानने और लक्षित करने की क्षमता के आधार पर नैनोकणों का कुशलतापूर्वक चयन करने में सक्षम होना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: मानव कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए नैनोकणों की क्षमता का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल योजनाबद्ध। पारदर्शी कैस्पर भ्रूण प्रजनन पुरुष और महिला वयस्क मछली के माध्यम से उत्पन्न किए गए थे। एक पेट्री डिश में निषेचित भ्रूण एकत्र किए गए थे। ४८ एचपीएफ में, आरएफपी + हेला कोशिकाओं को पेरिविटेललाइन गुहा में जेब्राफिश भ्रूण में इंजेक्ट किया गया था, जिससे कुछ उम्र के मिलान वाले भ्रूण नियंत्रण के रूप में यूनिंजेक्टेड हो गए थे । 72 एचपीएफ में, मेटास्टैटिक आरएफपी + हेला कोशिकाओं वाले भ्रूण का चयन किया गया था और दो समूहों में विभाजित किया गया था:(ए)वाहन के साथ इंजेक्शन (एच2ओ) नियंत्रण के रूप में और(बी)एच2ओ में निलंबित नैनोकणों के साथ इंजेक्शन । तीसरा समूह आयु मिलान भ्रूण था जिसे अकेले नैनोकणों(सी)के साथ इंजेक्ट किया गया था । तीनों समूहों को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे चित्रित किया गया था। बॉक्स्ड क्षेत्र दिखाया गया है जहां छवियों पर कब्जा कर लिया गया था (चित्रा 2-चित्रा 4देखें) । वयस्क मछली के लिए स्केल बार = 1 मिमी और भ्रूण के लिए = 500 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: जेब्राफिश नैनोकणों के बिना मेटास्टैटिक वाघेला कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित। लाल चैनल और ब्लू चैनल(सी, एफ)की व्यक्तिगत(ए, डी)या मढ़ा छवियों में केवल लाल फ्लोरोसेंट हेला कोशिकाएं दिखाई देती थीं। वाहन इंजेक्शन नियंत्रण(बी, ई)के साथ भ्रूण में कोई विशिष्ट नीले फ्लोरोसेंट संकेतों का पता नहीं चला । (ए-सी)में छवियां चित्र 1एमें के रूप में बॉक्स्ड मछली पूंछ क्षेत्र दिखाते हैं । (डी-एफ)में छवियां(ए-सी)में बॉक्स्ड क्षेत्रों के बढ़े हुए दृश्य हैं। स्केल बार्स इन(ए-सी)= 200 माइक्रोन और(डी-एफ)= 100 माइक्रोन में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: जेब्राफिश में लाल फ्लोरोसेंट हेला कोशिकाओं और नीले फ्लोरोसेंट नैनोकणों का कोलोकैलाइजेशन। जेब्राफिश पूंछ को लाल और नीले चैनल में कम(ए-सी)और उच्च(डी-एफ)आवर्धन दोनों पर चित्रित किया गया था। लाल फ्लोरोसेंट संकेतों से मेटास्टैटिक हेला कोशिकाओं(ए, डी)का पता चला, जबकि नीले फ्लोरोसेंट संकेतों ने नैनोकणों(बी, ई)को दिखाया। लाल और नीले दोनों चैनलों(सी, एफ)से मढ़ा छवियों HeLa कोशिकाओं और नैनोकणों के colocalization दिखा । छवियों को अल्ट्राब्राइट सिलिका नैनोकणों के साथ इंजेक्शन से ३.५ घंटे के बाद लिया गया । (ए-सी)में छवियां मछली की पूंछ क्षेत्र को चित्रा 1Bमें बॉक्स्ड के रूप में दिखाती हैं । (डी-एफ)में छवियां(ए-सी)में बॉक्स्ड क्षेत्रों के बढ़े हुए दृश्य हैं। स्केल बार्स में(ए-सी)= 100 माइक्रोन और(डी-एफ)= 50 माइक्रोन में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: ज़ेब्राफ़िश मानव हेला कोशिकाओं के बिना नैनोकणों के साथ इंजेक्शन। ब्लू फ्लोरोसेंट नैनोकणों को व्यक्तिगत(बी, ई)में भ्रूण की संचार प्रणाली में वितरित किया गया था और लाल और नीले चैनल(सी, एफ)की मढ़ा छवियां थीं। जेब्राफिश भ्रूण के लिए आम कुछ पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को छोड़कर कम या उच्च आवर्धन(ए, डी)पर कोई विशिष्ट लाल फ्लोरेसेंस दिखाई नहीं दे रहा था। (ए-सी)में छवियां मछली की पूंछ क्षेत्र को चित्रा 1Cमें बॉक्स्ड के रूप में दिखाती हैं । (डी-एफ)में छवियां(ए-सी)में बॉक्स्ड क्षेत्रों के बढ़े हुए दृश्य हैं। स्केल बार्स इन(ए-सी)= 100 माइक्रोन और(डी-एफ)= 50 माइक्रोन में। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल मेटास्टैटिक मानव कैंसर कोशिकाओं को पहचानने और लक्षित करने के लिए नैनोकणों की क्षमता का परीक्षण करने के लिए वीवो प्रणाली में जेब्राफिश का उपयोग करता है। कई कारक प्रयोगों के सफल निष्पादन को प्रभावित कर सकते हैं। सबसे पहले, भ्रूण को पूरी तरह से 48 एचपीएफ पर विकसित करने की आवश्यकता है। भ्रूण का सही विकासात्मक चरण उन्हें मानव कैंसर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण को सहने और जीवित रहने में सक्षम बनाता है। ४८ hpf से छोटे भ्रूण पुराने और अधिक विकसित भ्रूण की तुलना में एक काफी कम जीवित रहने की दर है । दूसरा, कैंसर कोशिकाओं को यह सुनिश्चित करके यथासंभव स्वस्थ रखा जाना चाहिए कि वे हैं: 1) घातीय विकास चरण में21,2) प्रत्यारोपण से तुरंत पहले 30 मिनट-1 घंटे की ताजा कटाई की, और 3) हर समय गर्म रखा । तीसरा, सुई भरा नहीं होना चाहिए। सुई में सेल मिश्रण लोड करने से पहले कम से कम 20x ऊपर और नीचे HeLa कोशिकाओं को पिपेट करें। चौथा, मानव कैंसर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण और नैनोकणों के इंजेक्शन के लिए विभिन्न प्रकार की सुइयों का उपयोग किया जाना चाहिए । मानव कोशिका प्रत्यारोपण के लिए सुई अपेक्षाकृत व्यापक है, सेल क्लोजिंग से बचने के लिए एक कोण के साथ, जबकि नैनोपार्टिकल इंजेक्शन के लिए सुई तेज और पतली है । पांचवां, इंजेक्शन का स्थान अलग-अलग है। मानव कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए स्थान पेरिविटेललाइन गुहा है, लेकिन नैनोपार्टिकल इंजेक्शन के लिए, सुई को आंख के पीछे डाला जाना चाहिए, जहां समृद्ध केशिकाएं हैं। अंत में, प्रत्यारोपण करने वाले व्यक्ति का कौशल मायने रखता है। एक अनुभवी व्यक्ति सही पेरिविटेललाइन गुहा अंतरिक्ष में HeLa कोशिकाओं सुई कर सकते हैं, जबकि एक अनुभवहीन व्यक्ति अक्सर जर्दी क्षेत्र में ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्ट जहां ट्यूमर कोशिकाओं को मुश्किल से मछली शरीर में फैल गया । इसी तरह, भ्रूण के जीवित रहने की दर बहुत अधिक है जब एक अनुभवी व्यक्ति द्वारा संभाला, कैंसर की कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित भ्रूण के कम से ५०% के साथ जीवित है ।

हालांकि जेब्राफिश भ्रूण आमतौर पर 28.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड होते हैं, लेकिन मानव कैंसर कोशिकाओं को जीवित रहने और22, 23,23को माइग्रेट करने के लिए उच्च तापमान की आवश्यकता होती है। दोनों मछली भ्रूण और मानव कैंसर कोशिकाओं के अस्तित्व की अनुमति के लिए, मानव कैंसर की कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित भ्रूण के बजाय ३५.५ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड हैं । हालांकि यह जर्दी थैली में कैंसर की कोशिकाओं को देने के लिए आसान हो सकता है, वे मुश्किल से संचार प्रणाली में फैल गया । इसलिए, कैंसर कोशिकाओं के इंट्रावेशन और प्रसार को सुनिश्चित करने के लिए पेरिविटेललाइन गुहा के तहत संवहनी क्षेत्र में कैंसर कोशिकाओं को इंजेक्ट करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, किसी को ध्यान रखना चाहिए कि इंजेक्शन और इमेजिंग के दौरान भ्रूण को एनेस्थेटाइज करते समय बहुत अधिक या बहुत अधिक केंद्रित MS222 न जोड़ें। नैनोकणों की इमेजिंग और विज़ुअलाइज़ेशन में सहायता करने के लिए, एबी मछली के बजाय कैस्पर जेब्राफिश को चुना गया था। कैस्पर मछली Nacre और रॉय के लिए एक डबल उत्परिवर्ती है जिसमें मेलानोसाइट्स और इरिडोफोरस का अभाव है, जिसके परिणामस्वरूप एबीमछली 14की तुलना में पारदर्शिता बढ़ी है। कैस्पर जेब्राफिश की पारदर्शिता संचलन में नैनोकणों के प्रसार और कैंसर कोशिकाओं के लिए नैनोकणों को लक्षित करने में सक्षम बनाती है। इस प्रोटोकॉल की चुनौती भ्रूण की अपेक्षाकृत उच्च मृत्यु दर है अगर एक अनुभवहीन व्यक्ति मानव कैंसर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण करता है । दिलचस्प बात यह है कि आंखों के थोड़ा पीछे नैनोकणों का इंजेक्शन अपेक्षाकृत अच्छी तरह से सहन किया जाता है। यह ट्यूमर सेल प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल सुई की तुलना में पतली सुइयों के उपयोग के कारण होने की संभावना है। हानिकारक मानव कैंसर की कोशिकाओं से बचने के लिए, एक व्यापक उद्घाटन के साथ सुई का उपयोग करना चाहिए, लेकिन इन भ्रूण के नुकसान के लिए नेतृत्व अगर अनुपयुक्त संभाला कर सकते हैं ।

यह प्रोटोकॉल वीवो में कार्यात्मक नैनोकणों के साथ मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं के लक्ष्यीकरण की कल्पना करने के लिए कैस्पर जेब्राफिश का उपयोग करता है। इस परख का एक बड़ा लाभ यह है कि यह शोधकर्ताओं को नैनोकणों के साथ कैंसर कोशिकाओं की बातचीत की निगरानी करने के लिए जेब्राफिश विकास के पाठ्यक्रम पर वास्तविक समय इमेजिंग करने की अनुमति देता है । वास्तव में, इसकी उच्च मल-विकास और तेजी से विकास के कारण, जेब्राफिश शोधकर्ता को,,18, 19,1920,24दिनों में परिणाम प्राप्त करने की अनुमति देती है।, इसके अलावा, यह परख आगे के शोध से विषाक्त नैनोकणों के उन्मूलन की भी अनुमति देता है यदि अधिकांश भ्रूण एक विशेष प्रकार के नैनोकण के इंजेक्शन के बाद मर जाते हैं। हालांकि जेब्राफिश स्तनपायी नहीं है, यह बड़ी संख्या में नैनोकणों के चयन को तेजी से और किफायती तरीके से प्रदान करता है, जो बड़े जानवरों और नैदानिक परीक्षण में डाउनस्ट्रीम अध्ययन के लिए उपयोगी जानकारी प्रदान करता है। एक साथ लिया, ज़ेब्राफिश कैंसर विशिष्ट लक्ष्यीकरण के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं का जल्दी पता लगाने और संभावित विनाश के लिए उपयुक्त नैनोप्रोब्स का चयन करने में मदद करके नैनोमेडिसिन और नैनो में प्रभाव डाल रहा है ।

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Disclosures

I.S. नैनोसाइंस सॉल्यूशंस, एलएलसी (एसटीटीआर एनआईएच R41AI142890 अनुदान के प्राप्तकर्ता) में रुचि की घोषणा करता है। अन्य सभी लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग के लिए सुश्री कायली स्मिथ, सुश्री लॉरेन क्वोक और श्री अलेक्जेंडर फ्लोरू का शुक्रिया अदा करते हैं । एचएफ एनआईएच (CA134743 और CA215059), अमेरिकन कैंसर सोसायटी (आरएसजी-17-204 01-TBG), और सेंट बाल्ड्रिक फाउंडेशन से अनुदान समर्थन स्वीकार करते हैं । F.J.F.L. बोस्टन विश्वविद्यालय नवाचार केंद्र से एक फैलोशिप स्वीकार-BUnano पार-कैंसर के लिए नैनो में अनुशासनात्मक प्रशिक्षण (XTNC) । आई एस एनएसएफ समर्थन (अनुदान CBET 1605405) और NIH R41AI142890 स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose KSE scientific BMK-A1705
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1.0 mm O.D. x 0,78 mm
Computer and monitor ThinkCentre X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Corning 10-013-CV sold by Fisher
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F0926
Fish incubator VWR 35960-056
Hemocytometer Fishersci brand 02-671-51B
Magnetic stand World Precision Instruments M10
Microloader tip Eppendorf E5242956003 sold by Fisher
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MMPI-3
Needle Puller Sutter instruments P-97
Olympus MVX-10 fluorescent microscope Olympus MVX-10
P200 tip Fishersci brand 07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) Corning 21-030-CV sold by Fisher
Petri dish Corning SB93102 sold by Fisher
Plastic pipette Fishersci brand 50-998-100
pLenti6.2_miRFP670 Addgene 13726
Pneumatic pico pump World Precision Instruments SYSPV820
Pronase Roche-Sigma-Fisher 50-100-3275 Roche product made by Sigma- sold by Fisher
Razor blade Fishersci brand 12-640
SZ51 dissection microscope Olympus SZ51
Tricaine methanesulfonate Western Chemicals NC0872873 sold by Fisher
Trypsin-EDTA Corning MT25053CI sold by Fisher
Tweezer Fishersci brand 12-000-122

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References

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कैंसर रिसर्च अंक 159 जेब्राफिश कैस्पर,प्रत्यारोपण वीवो टारगेटिंग नैनोकणों कैंसर में
वीवो में ज़ेब्राफ़िश में कार्यात्मक फ्लोरोसेंट सिलिका नैनोकणों के साथ Xenografted मानव कैंसर कोशिकाओं का लक्ष्यीकरण
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Qin, X., Laroche, F. F. J.,… More

Qin, X., Laroche, F. F. J., Peerzade, S. A. M. A., Lam, A., Sokolov, I., Feng, H. In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish. J. Vis. Exp. (159), e61187, doi:10.3791/61187 (2020).

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