Summary

部位特異的DNA切断のための並列高スループット単一分子運動アッセイ

Published: May 06, 2020
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Summary

単一分子レベルでのDNAの部位特異的切断を測定するための高度に平行な方法が記載されている。このプロトコルは、制限エンドヌクレアーゼNdeIを用いた手法を示す。この方法は、部位特異的なDNA切断をもたらす任意のプロセスを研究するために容易に改変することができる。

Abstract

部位特異的DNA切断(SSDC)は、多くの細胞プロセスにおける重要なステップであり、遺伝子編集にとって極めて重要です。本研究は、多くの単DNA分子で同時にSSDCを測定することができる運動アッセイを記述する。ビーズ・テザード基板DNAは、それぞれ標的配列の単一コピーを含み、マイクロ流体流路に調製される。外部磁石は、常磁性ビーズに弱い力を与えます。広視野、低倍率の目的を使用して暗視野イメージング下のマイクロビーズを視覚化することによって、最大1,000個の個々のDNAの完全性を監視することができます。制限エンドヌクレアーゼの注入は、NdeI、切断反応を開始する。ビデオ顕微鏡は、関連するビーズが目的の焦点面を上下に移動するフレームを観察することによって、各DNA切断の正確な瞬間を記録するために使用される。フレームごとのビーズカウントは反応を定量化し、指数適合によって反応速度が決定されます。この方法は単一の実験で単一分子SSDC反応に関する定量的および統計的に有意なデータの収集を可能にする。

Introduction

部位特異的DNA切断(SSDC)は、多くのゲノム取引における重要なステップである。例えば、細菌制限修飾(RM)11およびCRISPR2システムは、特定の配列で外来DNAを認識および切断することによって、ファージおよびプラスミドによる攻撃から細胞を保護する。II型RMでは、制限エンドヌクレアーゼ(R)は、タンパク質-核酸相互作用を介して短い4–8塩基対(bp)配列を認識するCRISPR関連エンドヌクレアーゼは、Cas9などの、エンドヌクレアーゼ4に結合したcrRNAを有する標的部位のハイブリダイゼーションを介して部位に結合する。部位特異的二本鎖破断(DSB)の作成も、多くのDNA組換えイベント5の第一歩である。例えば、V(D)J組換えによって作成された抗原結合領域の多様性は、特異的標的部位6の認識および切断を必要とする。いくつかのトランスポソンは、特定のDNA配列を標的とすることが知られている、7.当然のことながら、Cas9のようなこれらのプロセスに関与する多くの部位特異的ヌクレアーゼは、遺伝子編集技術8の重要な構成要素である。また、新規部位特異的エンドヌクレアーゼ(すなわち、ジンクフィンガーヌクレアーゼ9およびTALENS10)もゲノムを編集するように設計されている。

核酸の部位特異的切断の運動を測定するために多くの方法が採用されている。これらには、ゲル分析、蛍光11、12、,12およびシーケンシングベースの方法13が含まれる。DNAの単一分子のDSBが鎖分離後のビーズの動きによって検出されることを可能にするマイクロビーズのテザリングで大きな進歩が達成されました。これらの方法では、異なるタイプの力が、ビード後切断のストランド分離および運動を確実にするために使用される。あるケースでは、光トラップがEcoRV14によるDNAの切断を測定するために使用されてきた。これらの実験では、ターゲット検索は調査の目的であり、サイト固有の結合がレート制限ステップになるように条件が最適化されています。光トラップの欠点の1つは、一度に1つのDNAしか観察できないということです。さらに、ストランド分離のテストには、周期的に大きな引き上げ力を適用する必要があります。

別の技術は、連続的な方法でビードを引っ張るために流れと弱い磁力の組み合わせを使用します15.このようにして、NdeIによる拡散制限された切断が測定される。この方法を用いると、同時に数百個のDNAを同時に測定することができ、1回の実験で統計的有意性を得ることができます。磁気ピンセットを用いた実験も行われている。そのような研究の1つにおいて、挿入オリゴヌクレオチド16にDSBを含めることによってレトロウイルスインテグラーゼを研究した。統合に成功すると、結合されたDNAにDSBが組み込まれ、付着したビーズが失われた。ATP依存性III型制限エンドヌクレアーゼEcoPIの同様の研究では、1回の実験17で数十のDNAが観察された。磁気ピンセットは、反応中に緊張を制御し、監視することができるという利点を有する。

ここでは、DAの大規模テザリングの最近の改善を利用したSSDCキネティクスを測定するための非常に平行な単一分子法を紹介します。この方法は、DNA複製18、DNA19の輪郭長、および、R15による切断を測定するために用いられる以前15の方法の改良および延長である。19この技術では、認識配列の単一のコピーを含む線状DNAは、一方の端にビオチン、他方でジゴキシゲニンで調製される。ビオチンは、常磁性マイクロビーズに共有結合するストレプトアビジンに結合する。DNAビーズ複合体は、抗ジゴキシゲニンFAB断片で機能化されたマイクロ流体チャネルに注入される。次いでDNAは、二ゴキシゲニンを吸着したFAB断片に結合して表面付着点にテザーを付ける。永久磁石で弱い磁力を加えた場合、ビードが表面に非特異的に貼り付けられるのを防ぎます。サンプルは、流路に迅速に注入することができる(<30 s)切断反応を活性化する。データ収集中にフローがオフになります。各DNAが切断されると、ビーズが目的の焦点計画を上下に移動するフレームを記録することによって切断の正確な時間を決定することができ、したがってビデオレコードから消える。残りのビーズのフレームごとのカウントは、反応の進行状況を定量化するために使用することができます。

以下に示す完全なプロトコルと、NdeIを使用して収集されたデータの例を示します。この手法を適用する方法の一例として、タンパク質濃度の範囲に対する切断速度は、必須の金属補因子であるマグネシウムの2つの異なる濃度で測定される。このプロトコルの適用はNdeIを使用するが、この方法はDNA基質設計を変えることによって任意の部位特異的ヌクレアーゼとの使用のために適合させることができる。

Protocol

1. フローセルの作成 カバーリップを洗う エタノール(EtOH)で瓶と超音波処理にカバースリップを置き、1 M KOH(それぞれ30分間)を使用します。EtOHのKOH沈殿を避けるために、洗浄の間にddH2Oで十分に洗いす。 EtOH と KOH 洗浄ステップ 1x の両方を、合計 4 回の洗浄回数 (2 回の EtOH と 2 つの KOH) に対して繰り返します。汚れた瓶の中にddH2Oでクリーニングされたカ…

Representative Results

この技術を用いて、2つの異なる濃度のマグネシウム(2 mMおよび4 mM)で、さまざまなタンパク質濃度(0.25~4.00 U/mL)について、NdeIのSSDC速度を測定した。これらの条件のそれぞれは、実験ごとに数百から1,000のテザリングされたDNAで、少なくとも2回複製された。 図2 は実験計画を説明する。 図 3 は、データ収集と分析の詳細の例を示しています。 <strong c…

Discussion

このプロトコルは、実験中にストランド分離が観察される限り、任意のSSDCシステムの運動を測定するために使用することができる。切断の検出は、につながれたビーズの剥離を観察することによって影響を受け、したがって、ストランド分離の瞬間をマークします。すべての前のステップは、切断の検出前に発生します。したがって、合計通過時間のみが記録されます。

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立科学財団がMCB-1715317を助成金によって支援されました。

Materials

5 minute Epoxy Devcon 14250
anti-digoxigenin FAB fragments Roche Diagnostics 11214667001
camera and software Jenoptik GRYPHAX SUBRA
data analysis software Vernier Inc. LP
double sided tape Grace Biolabs SA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline Corning 21-031-CV
ethanol 95% VWR 89370-082
forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC Integrated DNA Technologies n/a
image analysis software National Institutes of Health ImageJ
inverted microscope Nikon TE2000
knife printer Silhouette
M13mp18 DNA New England Biolabs N4040S
MyOne streptavidin beads Thermo Fisher Scientific 65601
NdeI enzyme New England Biolabs R0111S
PCR cleanup kit Qiagen 28104
pluronic F-127 Anatrace P305
polyethylene tubing PE-20 BD Intramedic 427406
polyethylene tubing PE-60 BD Intramedic 427416
Q5 Mastermix New England Biolabs M0492S
rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID National Imports NSN0814
rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID National Imports NSN0615
reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC Integrated DNA Technologies n/a
syringe pump Kent Scientific Genie Plus
β-Casein from bovine Milk Sigma-Aldrich C6905

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Cite This Article
Matozel, E. K., Dale, N., Price, A. C. Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage. J. Vis. Exp. (159), e61236, doi:10.3791/61236 (2020).

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