TEK molekül düzeyinde DNA’nın bölgeye özgü dekoltesini ölçmek için son derece paralel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, kısıtlama enonuclease NdeI kullanarak tekniği göstermektedir. Yöntem kolayca siteye özgü DNA bölünmesi ile sonuçlanan herhangi bir süreci incelemek için değiştirilebilir.
Siteye özgü DNA bölünmesi (SSDC) birçok hücresel süreçte önemli bir adımdır ve gen düzenleme için çok önemlidir. Bu çalışma, aynı anda birçok tek DNA moleküllerinde SSDC ölçme yeteneğine sahip bir kinetik töz açıklar. Her biri hedef sıranın tek bir kopyasını içeren boncuk-bağlı substrat DNA’ları mikroakışkan akış kanalında hazırlanır. Harici mıknatıs paramanyetik boncuklar için zayıf bir kuvvet uygular. 1.000’e kadar ayrı DNA’nın bütünlüğü, geniş alan, düşük büyütme hedefi kullanılarak karanlık alan görüntüleme siperinde mikroboncukların görselleştirilmesiyle izlenebilir. Bir kısıtlama endonükleaz enjekte, NdeI, dekolte reaksiyonu başlatır. Video mikroskobu, ilişkili boncuk hedefin odak düzleminin yukarı ve dışına hareket ettiği çerçeveyi gözlemleyerek her DNA bölünmesinin tam anını kaydetmek için kullanılır. Kare kare boncuk sayma reaksiyonu ölçer ve üstel uyum tepki hızını belirler. Bu yöntem, tek bir deneyde tek moleküllü SSDC reaksiyonları hakkında nicel ve istatistiksel olarak anlamlı verilerin toplanmasına olanak sağlar.
Siteye özgü DNA bölünmesi (SSDC) birçok genomik işlemin önemli bir adımıdır. Örneğin, bakteriyel kısıtlama-modifikasyon (RM)1 ve CRISPR2 sistemleri belirli dizilerde yabancı DNA’yı tanıyarak ve yarıklayarak hücreleri faj ve plazmidlerin saldırısına karşı korur. Tip II RM’de, restriksiyon endokleazları (REs) protein-nükleik asit etkileşimleri ile kısa 4-8 baz çifti (bp) dizilerinitanırlar 3. Cas9 gibi CRISPR ilişkili ensonükleazlar, ensonükleazlara bağlı crRNA’lar ile hedef alanın hibridizasyonu yoluyla sitelere bağlanır4. Siteye özgü çift iplikçikli molaların (DSB’ler) oluşturulması da birçok DNA rekombinasyon olayının ilk adımıdır5. Örneğin, V(D)J rekombinasyon tarafından oluşturulan antijen bağlama bölgelerinin çeşitliliği belirli hedef sitelerin tanınmasını ve bölünmesini gerektirir6. Bazı transpozonlar belirli DNA dizileri hedef bilinmektedir, yanı sıra7. Beklendiği gibi, cas9 gibi bu süreçlerde yer alan birçok siteye özgü nükleazlar, gen düzenleme teknolojileri8önemli bir bileşenidir. Buna ek olarak, yeni siteye özgü endokleazlar (örneğin, çinko parmak nükleazları9 ve TALENS10)da genomları döşeyecek şekilde tasarlanmıştır.
Birçok yöntem nükleik asitlerin siteye özgü dekolte kinetik ölçmek için kullanılmıştır. Bu jel analizi dahil, floresan11,12, ve sıralama tabanlı yöntemler13. Mikroboncukların tethering ile büyük bir ilerleme sağlandı, hangi DNA’nın tek moleküllerinde DSB’ler iplikçik ayrımı ndan sonra bir boncuk hareketi ile tespit edilmesine olanak sağlar. Bu yöntemlerde, boncuk sonrası dekoltenin iplikçik ayrıştırılması ve hareketini sağlamak için farklı kuvvet türleri kullanılır. Bir durumda, optik tuzaklar EcoRV14tarafından DNA bölünmesi ölçmek için kullanılmıştır. Bu deneylerde, hedef arama araştırmanın amacıdır ve siteye özgü bağlamanın oranı sınırlayan adım olması için koşullar optimize edilebistir. Optik tuzakların bir dezavantajı da aynı anda sadece tek bir DNA’nın gözlemlenebildiğidir. Buna ek olarak, iplikçik ayrımı için test etmek için periyodik büyük çekme kuvveti uygulanmalıdır.
Başka bir teknik sürekli bir şekilde boncuk çekmek için akış ve zayıf manyetik kuvvetlerin bir arada kullanır15. Bu şekilde NdeI ile difüzyon sınırlı dekolte ölçülür. Kullanılan yöntem aynı anda birkaç yüz DA’nın eşzamanlı olarak ölçülmesine olanak sağlayarak, tek bir deneyde istatistiksel anlamlıya ulaşılmasını sağlar. Manyetik cımbız üzerine deneyler de kullanılmıştır. Bu tür bir çalışmada, bir retroviral integrase ekleme oligonükleotid bir DSB dahil edilerek çalışıldı16. Başarılı entegrasyon, DSB’nin bağlı DNA’ya dahil edilmesi ve ekli boncuk kaybıile sonuçlandı. ATP’ye bağlı tip III restriksiyon endokleaz EcoPI benzer bir çalışmada, tek bir deneyde onlarca DNA gözlenmiştir17. Manyetik cımbız, reaksiyon sırasında gerilimin yanı sıra DNA döngünün de kontrol edilebildiği ve izlenebileceği avantajını elinde tutar.
Burada sunulan SSDC kinetik ölçmek için son derece paralel tek molekülyöntemi, hangi BÜYÜK ÖLÇEKLI TEthering büyük ölçekli tethering son gelişmeler yararlanır. Bu yöntem, DNA replikasyonu18,DNA19kontur uzunluğu ve REs15ile dekolte ölçmek için kullanılan önceki yöntemlerin bir iyileşme ve uzantısıdır. Bu teknikte, tanıma dizisinin tek bir kopyasını içeren lineer DNA’lar bir uçta biotin, diğer ucunda digoksijenin ile hazırlanır. Biotin streptavidin bağlar, kovalent bir paramanyetik mikrop bağlı. DNA-boncuk kompleksleri anti-digoksigenin FAB parçaları ile işlevselleştirilmiş bir mikroakışkan kanal içine enjekte edilir. DNA daha sonra digoksigenin adsorbe FAB parçalarına bağlanması yoluyla yüzey eki noktalarına bağlanır. Kalıcı bir mıknatısla uygulanan zayıf manyetik kuvvetler, boncuk ların özellikle yüzeye yapışmamasını önlüyor. Numuneler dekolte reaksiyonu etkinleştirmek için akış kanalına hızla (<30 s) enjekte edilebilir. Veri toplama sırasında akış kapatılır. Her DNA'nın ayrılmasıyla, dekoltenin tam zamanı, reklamın hedefin odak planının yukarı ve dışına doğru hareket ettiği çerçevenin kaydedilmesi yle belirlenebilir ve böylece video kaydından kaybolur. Kalan boncukların kare kare sayısı reaksiyon ilerlemesini ölçmek için kullanılabilir.
Aşağıda sunulan tam protokol yanı sıra NdeI kullanılarak toplanan örnek veriler. Tekniğin nasıl uygulanabildiğini örnek olarak, bir dizi protein konsantrasyonu için bölünme oranları, önemli bir metal kofaktör olan iki farklı magnezyum konsantrasyonu ile ölçülür. Protokolün bu uygulaması NdeI’yi kullansa da, yöntem DNA substrat tasarımını değiştirerek herhangi bir yere özgü nükleaz ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.
Protokol, deney sırasında iplikçik ayrımının gözlenmiş olması koşuluyla, herhangi bir SSDC sisteminin kinetiklerini ölçmek için kullanılabilir. Dekolte tespiti, bağlı boncuk kopması gözlemleyerek etkilenir ve bu nedenle iplikçik ayırma anında işaretler. Tüm önceki adımlar dekolte tespitinden önce meydana gelir; böylece, sadece toplam transit süresi kaydedilir.
Akış hücre örtüsü temiz cama antikor proteininin spesifik olmayan adsorpsiyonu ile işlevselhale geti…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı hibe MCB-1715317 tarafından desteklenmiştir.
5 minute Epoxy | Devcon | 14250 | |
anti-digoxigenin FAB fragments | Roche Diagnostics | 11214667001 | |
camera and software | Jenoptik | GRYPHAX SUBRA | |
data analysis software | Vernier Inc. | LP | |
double sided tape | Grace Biolabs | SA-S-1L | |
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
ethanol 95% | VWR | 89370-082 | |
forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ | |
inverted microscope | Nikon | TE2000 | |
knife printer | Silhouette | ||
M13mp18 DNA | New England Biolabs | N4040S | |
MyOne streptavidin beads | Thermo Fisher Scientific | 65601 | |
NdeI enzyme | New England Biolabs | R0111S | |
PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | |
pluronic F-127 | Anatrace | P305 | |
polyethylene tubing PE-20 | BD Intramedic | 427406 | |
polyethylene tubing PE-60 | BD Intramedic | 427416 | |
Q5 Mastermix | New England Biolabs | M0492S | |
rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID | National Imports | NSN0814 | |
rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID | National Imports | NSN0615 | |
reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
syringe pump | Kent Scientific | Genie Plus | |
β-Casein from bovine Milk | Sigma-Aldrich | C6905 |