Summary

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Published: May 06, 2020
doi:

Summary

TEK molekül düzeyinde DNA’nın bölgeye özgü dekoltesini ölçmek için son derece paralel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, kısıtlama enonuclease NdeI kullanarak tekniği göstermektedir. Yöntem kolayca siteye özgü DNA bölünmesi ile sonuçlanan herhangi bir süreci incelemek için değiştirilebilir.

Abstract

Siteye özgü DNA bölünmesi (SSDC) birçok hücresel süreçte önemli bir adımdır ve gen düzenleme için çok önemlidir. Bu çalışma, aynı anda birçok tek DNA moleküllerinde SSDC ölçme yeteneğine sahip bir kinetik töz açıklar. Her biri hedef sıranın tek bir kopyasını içeren boncuk-bağlı substrat DNA’ları mikroakışkan akış kanalında hazırlanır. Harici mıknatıs paramanyetik boncuklar için zayıf bir kuvvet uygular. 1.000’e kadar ayrı DNA’nın bütünlüğü, geniş alan, düşük büyütme hedefi kullanılarak karanlık alan görüntüleme siperinde mikroboncukların görselleştirilmesiyle izlenebilir. Bir kısıtlama endonükleaz enjekte, NdeI, dekolte reaksiyonu başlatır. Video mikroskobu, ilişkili boncuk hedefin odak düzleminin yukarı ve dışına hareket ettiği çerçeveyi gözlemleyerek her DNA bölünmesinin tam anını kaydetmek için kullanılır. Kare kare boncuk sayma reaksiyonu ölçer ve üstel uyum tepki hızını belirler. Bu yöntem, tek bir deneyde tek moleküllü SSDC reaksiyonları hakkında nicel ve istatistiksel olarak anlamlı verilerin toplanmasına olanak sağlar.

Introduction

Siteye özgü DNA bölünmesi (SSDC) birçok genomik işlemin önemli bir adımıdır. Örneğin, bakteriyel kısıtlama-modifikasyon (RM)1 ve CRISPR2 sistemleri belirli dizilerde yabancı DNA’yı tanıyarak ve yarıklayarak hücreleri faj ve plazmidlerin saldırısına karşı korur. Tip II RM’de, restriksiyon endokleazları (REs) protein-nükleik asit etkileşimleri ile kısa 4-8 baz çifti (bp) dizilerinitanırlar 3. Cas9 gibi CRISPR ilişkili ensonükleazlar, ensonükleazlara bağlı crRNA’lar ile hedef alanın hibridizasyonu yoluyla sitelere bağlanır4. Siteye özgü çift iplikçikli molaların (DSB’ler) oluşturulması da birçok DNA rekombinasyon olayının ilk adımıdır5. Örneğin, V(D)J rekombinasyon tarafından oluşturulan antijen bağlama bölgelerinin çeşitliliği belirli hedef sitelerin tanınmasını ve bölünmesini gerektirir6. Bazı transpozonlar belirli DNA dizileri hedef bilinmektedir, yanı sıra7. Beklendiği gibi, cas9 gibi bu süreçlerde yer alan birçok siteye özgü nükleazlar, gen düzenleme teknolojileri8önemli bir bileşenidir. Buna ek olarak, yeni siteye özgü endokleazlar (örneğin, çinko parmak nükleazları9 ve TALENS10)da genomları döşeyecek şekilde tasarlanmıştır.

Birçok yöntem nükleik asitlerin siteye özgü dekolte kinetik ölçmek için kullanılmıştır. Bu jel analizi dahil, floresan11,12, ve sıralama tabanlı yöntemler13. Mikroboncukların tethering ile büyük bir ilerleme sağlandı, hangi DNA’nın tek moleküllerinde DSB’ler iplikçik ayrımı ndan sonra bir boncuk hareketi ile tespit edilmesine olanak sağlar. Bu yöntemlerde, boncuk sonrası dekoltenin iplikçik ayrıştırılması ve hareketini sağlamak için farklı kuvvet türleri kullanılır. Bir durumda, optik tuzaklar EcoRV14tarafından DNA bölünmesi ölçmek için kullanılmıştır. Bu deneylerde, hedef arama araştırmanın amacıdır ve siteye özgü bağlamanın oranı sınırlayan adım olması için koşullar optimize edilebistir. Optik tuzakların bir dezavantajı da aynı anda sadece tek bir DNA’nın gözlemlenebildiğidir. Buna ek olarak, iplikçik ayrımı için test etmek için periyodik büyük çekme kuvveti uygulanmalıdır.

Başka bir teknik sürekli bir şekilde boncuk çekmek için akış ve zayıf manyetik kuvvetlerin bir arada kullanır15. Bu şekilde NdeI ile difüzyon sınırlı dekolte ölçülür. Kullanılan yöntem aynı anda birkaç yüz DA’nın eşzamanlı olarak ölçülmesine olanak sağlayarak, tek bir deneyde istatistiksel anlamlıya ulaşılmasını sağlar. Manyetik cımbız üzerine deneyler de kullanılmıştır. Bu tür bir çalışmada, bir retroviral integrase ekleme oligonükleotid bir DSB dahil edilerek çalışıldı16. Başarılı entegrasyon, DSB’nin bağlı DNA’ya dahil edilmesi ve ekli boncuk kaybıile sonuçlandı. ATP’ye bağlı tip III restriksiyon endokleaz EcoPI benzer bir çalışmada, tek bir deneyde onlarca DNA gözlenmiştir17. Manyetik cımbız, reaksiyon sırasında gerilimin yanı sıra DNA döngünün de kontrol edilebildiği ve izlenebileceği avantajını elinde tutar.

Burada sunulan SSDC kinetik ölçmek için son derece paralel tek molekülyöntemi, hangi BÜYÜK ÖLÇEKLI TEthering büyük ölçekli tethering son gelişmeler yararlanır. Bu yöntem, DNA replikasyonu18,DNA19kontur uzunluğu ve REs15ile dekolte ölçmek için kullanılan önceki yöntemlerin bir iyileşme ve uzantısıdır. Bu teknikte, tanıma dizisinin tek bir kopyasını içeren lineer DNA’lar bir uçta biotin, diğer ucunda digoksijenin ile hazırlanır. Biotin streptavidin bağlar, kovalent bir paramanyetik mikrop bağlı. DNA-boncuk kompleksleri anti-digoksigenin FAB parçaları ile işlevselleştirilmiş bir mikroakışkan kanal içine enjekte edilir. DNA daha sonra digoksigenin adsorbe FAB parçalarına bağlanması yoluyla yüzey eki noktalarına bağlanır. Kalıcı bir mıknatısla uygulanan zayıf manyetik kuvvetler, boncuk ların özellikle yüzeye yapışmamasını önlüyor. Numuneler dekolte reaksiyonu etkinleştirmek için akış kanalına hızla (<30 s) enjekte edilebilir. Veri toplama sırasında akış kapatılır. Her DNA'nın ayrılmasıyla, dekoltenin tam zamanı, reklamın hedefin odak planının yukarı ve dışına doğru hareket ettiği çerçevenin kaydedilmesi yle belirlenebilir ve böylece video kaydından kaybolur. Kalan boncukların kare kare sayısı reaksiyon ilerlemesini ölçmek için kullanılabilir.

Aşağıda sunulan tam protokol yanı sıra NdeI kullanılarak toplanan örnek veriler. Tekniğin nasıl uygulanabildiğini örnek olarak, bir dizi protein konsantrasyonu için bölünme oranları, önemli bir metal kofaktör olan iki farklı magnezyum konsantrasyonu ile ölçülür. Protokolün bu uygulaması NdeI’yi kullansa da, yöntem DNA substrat tasarımını değiştirerek herhangi bir yere özgü nükleaz ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Protocol

1. Akış hücresi yapma Kapakların yıkanması Boyama kavanozları ve etanol (EtOH) ile sonicate yerleştirin, sonra 1 M KOH (her biri için 30 dakika için). EtOH’da KOH yağışını önlemek için yıkarlar arasında ddH2O ile iyice durulayın. Toplam dört yıkama (iki EtOH ve iki KOH) sayısı için hem EtOH hem de KOH yıkama adımlarını 1x tekrarlayın. Temizlenmiş kapakları boyama kavanozlarında ddH2O’da saklayın. Temizleme bir jile…

Representative Results

Bu teknik kullanılarak, SSDC ndeI oranları iki farklı magnezyum konsantrasyonlarında (2 mM ve 4 mM) çeşitli protein konsantrasyonları (0.25-4.00 U/mL) olarak ölçüldü. Bu koşulların her biri deney başına birkaç yüz ila 1.000 bağlı NA’larla en az iki kez çoğaltıldı. Şekil 2 deneysel tasarımı tanımlar. Şekil 3 veri toplama ve analiz ayrıntıları örneklerini gösterir. Şekil 4, magnezyumun iki konsantrasy…

Discussion

Protokol, deney sırasında iplikçik ayrımının gözlenmiş olması koşuluyla, herhangi bir SSDC sisteminin kinetiklerini ölçmek için kullanılabilir. Dekolte tespiti, bağlı boncuk kopması gözlemleyerek etkilenir ve bu nedenle iplikçik ayırma anında işaretler. Tüm önceki adımlar dekolte tespitinden önce meydana gelir; böylece, sadece toplam transit süresi kaydedilir.

Akış hücre örtüsü temiz cama antikor proteininin spesifik olmayan adsorpsiyonu ile işlevselhale geti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı hibe MCB-1715317 tarafından desteklenmiştir.

Materials

5 minute Epoxy Devcon 14250
anti-digoxigenin FAB fragments Roche Diagnostics 11214667001
camera and software Jenoptik GRYPHAX SUBRA
data analysis software Vernier Inc. LP
double sided tape Grace Biolabs SA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline Corning 21-031-CV
ethanol 95% VWR 89370-082
forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC Integrated DNA Technologies n/a
image analysis software National Institutes of Health ImageJ
inverted microscope Nikon TE2000
knife printer Silhouette
M13mp18 DNA New England Biolabs N4040S
MyOne streptavidin beads Thermo Fisher Scientific 65601
NdeI enzyme New England Biolabs R0111S
PCR cleanup kit Qiagen 28104
pluronic F-127 Anatrace P305
polyethylene tubing PE-20 BD Intramedic 427406
polyethylene tubing PE-60 BD Intramedic 427416
Q5 Mastermix New England Biolabs M0492S
rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID National Imports NSN0814
rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID National Imports NSN0615
reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC Integrated DNA Technologies n/a
syringe pump Kent Scientific Genie Plus
β-Casein from bovine Milk Sigma-Aldrich C6905

References

  1. Tock, M. R., Dryden, D. T. The biology of restriction and anti-restriction. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).
  2. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  3. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).
  4. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  5. Sadowski, P. D. Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops. The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).
  6. Schatz, D. G. Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase. Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).
  7. Craig, N. L. Tn7: a target site-specific transposon. Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).
  8. Gori, J. L., et al. Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).
  9. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  10. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  11. Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease. Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).
  12. Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease. Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).
  13. Becker, W. R., et al. High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2. Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).
  14. vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. How DNA coiling enhances target localization by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).
  15. Gambino, S., et al. A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage. Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).
  16. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  17. van Aelst, K., et al. Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).
  18. Williams, K., et al. A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates. American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).
  19. Song, D., et al. Tethered particle motion with single DNA molecules. American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).
  20. Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis. Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).
  21. Piatt, S., Price, A. C. Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments. PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).

Play Video

Cite This Article
Matozel, E. K., Dale, N., Price, A. C. Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage. J. Vis. Exp. (159), e61236, doi:10.3791/61236 (2020).

View Video