Summary
此处介绍的两个协议用于在三生培养条件下封装猪卵母细胞。在第一种，积卵-卵母细胞复合物（COCs）封装在纤维蛋白-藻酸珠中。第二，它们被用氟化乙烯丙烯粉末颗粒（微生物反应器）封闭。两个系统都确保以最佳条件维护其 3D 组织。
Abstract
在生殖生物学方面，从人工授精和胚胎移植技术开始的生物技术革命导致辅助生殖技术的发展，如卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）和通过从体细胞核转移克隆家畜。IVM 是特别重要的方法。它是为商业重要或濒危物种的生成间隔缩短、体外人类生殖研究以及细胞疗法的转基因动物生产等应用提供成熟、优质卵母细胞的平台技术。卵母细胞质量一词包括其完成成熟、受精的能力，从而产生健康的后代。这意味着优质卵母细胞对于成功受精至关重要，包括试管婴儿手术。这给开发一种可靠的培养方法带来了许多困难，这种方法不仅支持人类卵母细胞的生长，而且支持其他大型哺乳动物物种的生长。IVM 的第一步是卵母细胞的体外培养。本文描述了猪卵母细胞的3D培养的两个协议。在第一个，3D模型累积-卵母细胞复合物（COCs）封装在一个纤维蛋白-藻酸盐珠渗透网络中，其中纤维蛋白和藻酸盐的混合物同时凝胶化。在第二种材料中，COC悬浮在一滴介质中，用氟化乙烯丙烯（FEP;六氟丙烯和四氟乙烯的共聚物）粉末颗粒封装，形成定义为液体大理石（LM）的微生物反应器。两个 3D 系统都维护体外气态培养环境。他们还通过防止其扁平化和由此破坏间隙结来维护 COC 3D 组织，从而保持卵母细胞与周围卵泡细胞之间的功能关系。
Introduction
各种培养系统的发展，包括三维（3D）的培养系统，旨在为从卵泡分离的卵母细胞的生长和成熟提供最佳条件，即使在发育初期。这对辅助生殖技术（ART）非常重要，特别是鉴于癌症治疗后与不孕症作斗争的妇女越来越多。体外条件（IVM）卵母细胞的成熟已经是一种成熟的技术，主要用于体外胚胎生成，用于牲畜繁殖2。然而，在大多数哺乳动物物种中，即使能达到高成熟率的积卵-卵母细胞复合物（COCs）（范围60至90%），它们的发展能力仍然不足以满足需求。这是因为以这样的方式获得的受精卵的发展，甚至到囊肿阶段是低的，在转移到代孕动物后，其期限的生存能力降低。因此，有必要提高从接受IVM程序4的卵母细胞获得的胚胎的发育能力。因此，新的成熟介质5正在设计，并测试不同时期的体外培养6，77以及6补充各种生长因子和分子的培养媒体,8，9。
任何完整的 IVM 系统的第一步是为卵母细胞在体外培养期间的可持续生长创造最佳条件。卵母细胞生长是卵母细胞恢复卵母细胞能力的具体指标之,一。此外，适当的体外培养系统必须能够支持其核成熟和细胞质分化12。积卵-卵母细胞复合物的形态是 ART 诊所使用的另一个重要指标，用于选择最佳卵母细胞，用于人类和牲畜12、13的体外受精 （IVF） 程序的后续步骤。考虑的COC的形态特征包括：卵母细胞直径、细胞质造粒和第一极体完整性14、15。14,此外，卵母细胞的发育潜力与积细胞的外观和压实及其围绕卵母细胞的层数相关。对于适当的卵母细胞体外培养系统来说，非常重要的也是维持卵母细胞-累积细胞的适当相互作用和细胞骨架稳定性16、17、18、19。16,17,18,19到目前为止，在人体体外卵母细胞生长的人类COC中已经证明20。使用牛科动物也导致活产。这些从不成熟的卵巢卵泡分离，然后培养14天，直到卵母细胞足够大，接受IVF程序21。类似地，从大猩猩蚁卵泡中分离出的COCs，在体外培养后受IVM影响，产生能够重新形成卵母细胞的卵母细胞，以正常出现的主轴结构22。元相II阶段。然而，在这项研究中，作者并没有试图给他们施肥。然而，这些结果表明，类似的程序不仅可应用于这些特定的哺乳动物物种，而且也适用于从卵泡中获得的人类积云-卵母细胞复合物，这些复合物应能获得适合成功的IVF技术的优质卵母细胞。
上述结果通过应用传统的IVM协议获得，在二维（2D）系统中培养卵母细胞。2D培养系统中的常规程序是覆盖卵母细胞，浸入一滴适当的培养介质中，与矿物油23，24。23,24假定体外卵母细胞培养期间的油覆盖有助于防止液体蒸发，从而确保培养物中适当的pH值和渗透压力的维持。虽然这种2D培养系统允许获得，甚至高达87%的成熟猪卵母细胞25，已经证明，矿物油覆盖导致脂质可溶性材料的实质性扩散，这是适当的卵母细胞发展所必需的26。此外，由于类固醇（黄体酮和雌激素）在卵母细胞培养期间扩散到矿物油中，观察到核成熟延迟和猪卵母细胞发育能力成就下降。这可能导致获得少量的酶，此外，其特点是发育能力低到囊肿阶段，并转移到接受动物27后生存能力差。因此，正在尝试通过创造最佳条件，实现与CC一起培养的卵母细胞作为复合物，特别是使用三维（3D）系统，提高从IVM程序后接收的卵母细胞衍生的胚胎的发育能力。各种创新的3D体外培养系统已经发展，近二十年来，28，29。,29这些旨在保持细胞的自然空间组织，并避免它们在培养皿中扁平化，这是传统2D培养中无法实现的。养殖COC的结构和功能活动可以通过维护其适当的架构和不受干扰的沟通，通过各种隔间之间的间隙结30，可以确保其结构和功能活动。生物支架对于3D细胞复合物体外培养的适宜性已经使用天然生物材料进行了评估，如细胞外基质（ECM;胶原蛋白和透明质酸）的各种成分（ECM;胶原蛋白和透明质酸）31或惰性聚合物（藻酸盐）32。这些尝试在几个物种的测试带来了有希望的结果，在卵母细胞梅病恢复和实现他们的完全能力33，34，35。33,34,35然而，到目前为止，还没有开发适合从大型家畜（包括猪）分离出的COC成熟3D系统。
本文描述了可用于猪 COC 的 3D 培养的两种协议。第一个协议描述了纤维蛋白-藻酸盐珠（FAB）中的封装。FAB 可以通过同时混合藻酸盐和纤维蛋白溶液而形成，这种溶液经过同步凝胶过程。这种组合提供了一个动态的机械环境，因为两个组件都有助于矩阵刚度。类似的解决方案以前也用于小鼠卵巢卵泡培养和成熟36。在所提出的协议中，为了避免藻酸纤维蛋白网络过早降解，使用适当浓度更高的氯化钙溶液，确保快速稳定的凝胶过程。动态机械环境在 COC 驻留和尺寸增加的自然卵泡环境中创造了类似这样的条件。此外，该作品还展示了COC 3D培养系统的代表性结果，其中这些培养系统悬浮在一滴介质中，并用氟化乙烯丙烯（FEP;六氟丙烯和四氟乙烯的共聚物）粉末颗粒封装，形成微生物反应器（液体大理石、LM）。LM是一种3D生物反应器，以前已经证明支持活微生物37，肿瘤球类38和 胚胎干细胞39的生长。LMs也已成功用于羊卵母细胞培养40。在大多数使用LMs的实验中，生物反应器是使用粒径为1μm41的聚四氟乙烯（PTFE）粉床制备的。提出的协议使用FEP，其成分和性质与氟聚合物PTFE非常相似。但FEP比PTFE更容易形成和柔软，尤其重要的是，它是高度透明的。
两个 3D 系统都维护体外气态培养环境。他们还通过防止其扁平化和由此破坏间隙结，保持卵母细胞和周围卵泡细胞之间的功能关系，来维持COC 3D组织。
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Protocol
下列程序由贾吉洛尼亚大学动物学和生物医学研究所的动物福利委员会批准。
1. 猪积细胞-卵母细胞复合物的分离
- 为了收集分离卵巢卵泡的材料，在当地屠宰场从预骨基座（约6-7个月大，体重70至80公斤）中切除猪卵巢。在每个实验中从 10 种动物中选择大约 20 个猪卵巢进行 COC 隔离。
注：假设每个卵巢产生3~5个卵泡，卵泡总数从60到100个。 - 将卵巢放在含有1%AAS的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS;pH 7.4;38°C）的热水瓶中。确保实验材料在 1 小时内被运送到实验室，然后用含有抗生素的无菌 PBS 冲洗两次。
- 冲洗卵巢后，将它们转移到装满 HM 介质的烧杯中，并在 38°C 的培养箱中存放所有操作时间。
注：为了在卵母细胞处理过程中获得最佳效果，在DMEM/F12介质（处理介质，HM）中执行所有程序，添加2.5%的抗生素/抗真菌溶液（AAS）和10%的胎儿牛血清（FBS），并在环境中的CO2 水平、温度控制（38°C）和层外流罩下的加热台上控制pH值，以尽量减少细菌污染。 - 从大型猪毛囊（直径6-8毫米）收集卵泡液（FF）通过吸入和离心在 100xg 在室温下10分钟。之后，使用连接到0.2μm膜孔过滤器的无菌注射器过滤上清液，并在-80°C下捕捉冻结。
注：使用胰岛素注射器（u-40）吸附卵泡液。 - 确保只选择健康、中等大小的卵泡（直径为 4-6 mm）用于 COC 隔离42。
注：I级COC，拥有完整和圆形的卵母细胞与均匀的卵母细胞和多层（至少3-4）紧凑型积液被认为是适合进一步的3D IVM程序43。 - 要分离COCs，请将2-3个卵巢转移到一个直径为10厘米的无菌培养皿中，该培养皿充满HM. 按照以下程序之一，将COCs从中等大小的卵泡中分离。
- 用无菌手术刀片15C轻轻切割突出的卵巢卵泡的表面。这将导致卵泡液以及COCs流入培养皿。
- 使用 28 G 针头将毛囊含量吸入，其大小为 5/8"附在一次性注射器上，并将其转移到培养皿中。
注：丢弃卵巢组织的遗骸。随后的隔离阶段在立体显微镜下进行。
- 准备 3~5 60 毫米试管婴儿培养皿。
- 将 1 mL 的 HM 添加到中央孔中，并在其外圈中放置 3-4 滴 HM（每滴 50 μL）。
- 然后，使用聚碳酸酯微管，将未损坏的 COC 移动到外圈中的 HM 滴，短暂冲洗 3-4 次。
- 最后，将它们单独转移到中央井中。将此 IVF 板存放在培养箱中，以进行进一步手术。
- 收集 COC 后，通过将 COC 随机分配给下面列出的两个不同的 IVM 封装协议来执行最终选择步骤。
2. 纤维蛋白-藻酸盐水凝胶珠中的封装
- 在三口缓冲盐水（TBS;pH 7.4）中，用100 mM CaCl2 在2.0 mL无菌微离心管中准备1 mL的50 IU/mL血栓。
- 准备纤维蛋白原库存溶液（TBS中50毫克/mL），并冷冻。
注：为避免在TBS中溶解纤维蛋白原时出现混在，将TBS加热至37°C。- 在手术当天，在冰上缓慢解冻，并在使用前将室温解冻。
- 在使用混合之前，以1：1的比例0.5%的藻酸盐溶液和50毫克/mL纤维素原溶液得到最后2 mL （FA）。在无菌微离心管中轻轻涡旋混合物。避免制造气泡。
- 要准备"孵化室"，请将薄薄的石蜡薄膜条涂在玻璃显微镜幻灯片上。
注：使用前用 70% EtOH 擦拭幻灯片。一个孵化室由两张幻灯片组成。要将它们分开，请将 3 mm 的分隔器放在其中一个上。 - 滴管 7.5 μL 滴的 FA 混合物到这个石蜡薄膜涂层玻璃幻灯片上，其中也有分离的分隔器。在一个幻灯片上放置 8-10 滴，排列成两行。
- 使用微管传输 3-5 COC 以及最小体积（高达 5 μL）的成熟介质 （MM），并精确地将它们放在 FA 滴的中心。此过程需要良好的手动技能和精度。
注：成熟介质（MM）由DMEM/F12组成，并辅以步骤1.4中收集的10 IU/mL PMSG、10 IU/mL hCG、10%FBS和50%猪卵泡液（FF）。 - 在每个 FA 滴上添加 7.5 μL 的血栓/Ca2° 溶液，以覆盖它们。没有必要混合它们，因为凝胶几乎瞬间形成。
- 将第二个先前准备的玻璃滑梯涂抹到 FA 胶囊上，盖住孵化室。通过非常小心但坚定的运动，将腔室倒置，并放在一个100毫米的培养皿内衬潮湿的滤纸，以避免干燥。
- 然后，将培养皿转移到 5% CO2 培养箱 （38 °C） 约 5-7 分钟。在此之后，FA胶囊将变得多云，因为纤维蛋白和藻酸盐的同步凝胶。
- 将FA胶囊转移到96个井板（每孔一粒），每个孔含有100μL MM。
注：为了不损坏成形的FA胶囊，使用手术钳小心执行此步骤。 - 每 2 天更换一半的 MM （50 μL） 与新鲜，预平衡的。使用倒置光学显微镜成像 COC（放大倍数为 10 倍）。
注：COCs FA 培养的培养条件：38 °C，CO2 大气5% 以下，相对湿度 95%。经过4天的IVM，水凝胶似乎几乎清晰，由于纤维蛋白成分的逐渐降解。剩余的藻酸盐应该通过藻酸酶酶酶降解，这是一种植物源酶，专门降解藻酸盐，不影响动物细胞。- 从含有胶囊的井中去除MM，并在DMEM中加入100μL的10 IU/mL藻酸酶。将培养盘留在培养箱中25-30分钟。
- 从溶解的胶囊中去除COC。
注：这可以通过切割移液器尖端完成。 - 在新鲜 DMEM 中洗涤数次后，将 COC 转移到含有 PBS 的 IVF 盘（每盘 5-10 COC）的内圈。现在，使用它们进行进一步的形态学或生化分析。
3. 超疏水氟乙烯丙烯（FEP）微生物反应器中的封装。
注：确保所有 IVM 程序都在恒温控制表上执行，并且 COC 在整个处理过程中保持在 38°C。
- 准备一个 30 毫米培养皿，包含 5 g 的 FEP 粉床平均粒度为 1 μm。
注：使用新鲜的FEP粉末很重要。重新使用的 FEP 倾向于聚合并形成团块。 - 将步骤 1.6 中分离的 3-5 COC 的单个 MM 液滴（体积为±30 μL）分配到 FEP 粉末的床上。以圆周运动轻轻旋转板，以确保这些颗粒完全覆盖液滴表面和液体弹珠形成 （LM）。
- 使用带 1，000 μL 尖端的移液器拾取成形 LM。
注：在边缘切割移液器尖端，以适应 LM（4-5 mm）的直径。此类准备尖端的近似直径应略大于 LM 的直径。 - 准备几个60毫米试管婴儿培养皿。向外圈加入3-4 mL的无菌水，准备湿度室。接下来，将一个 LM 放入中央井中。
注：此过程需要良好的手动技能和精度 - 如果大理石被不小心放置或从低高度坠落，它将被销毁。 - 在 5% CO 2 培养箱中，在 38 °C 下孵育大理石 4 天。
- 按照程序每天更换介质：在每个 LM 上涂抹 30 μL 的 MM，这会导致其扩散，因为直接液体接触会破坏涂层 FEP 粉末的疏水性。当大理石含量溶解时，将从生物反应器释放的 COC 转移到培养皿中的一滴新鲜 MM 中。
注：要精确传输释放的COC，请使用聚碳酸酯微管。 - 在 MM 中多次洗涤后（3-4 次）以去除 FEP 颗粒，然后用 30 μL 新鲜 MM 将它们转移到 FEP 粉床上。以圆周运动轻轻旋转板，确保粉末颗粒完全覆盖液滴表面，并形成新的 LM。
- 然后按照步骤 3.3-3.4 中的步骤执行该过程。
注：FEP粉末的透明涂层允许使用光学显微镜监测 LM 含量。
- 按照程序每天更换介质：在每个 LM 上涂抹 30 μL 的 MM，这会导致其扩散，因为直接液体接触会破坏涂层 FEP 粉末的疏水性。当大理石含量溶解时，将从生物反应器释放的 COC 转移到培养皿中的一滴新鲜 MM 中。
4. 使用两个 3D 系统进行 96 小时 IVM 程序后 COC 的特性
注：要确定使用的 IVM 系统的效率，请用光学显微镜对 COC 进行形态评分。此外，使用双荧光标签与钙蛋白 AM 和乙基同质 （EthD-1） 染料分析 COCs 的可行性44.
- 通过光和荧光显微镜对IVM后卵母细胞进行形态学检查。
- 用 38 °C 1x PBS 清洗 COCs（使用 FAB 和 LM 的培养器）。
注：为了便于处理COC，并且在染色过程中不损坏它们，请使用96或48孔板，通过将COC转移到后续孔来执行每个染色步骤。 - 在100μL的1.6mM钙化物阿姆和5.5 mM EthD-1中孵育30~45分钟，在37°C。 在 1x PBS 中稀释两种物质。
注：因为这是双色荧光检测，所以在黑暗中执行此步骤。 - 孵育后，在PBS中清洗COC两次，然后浸入防淡安装介质中，旨在防止荧光蛋白和荧光染料的快速光漂白（材料表）。
注：保护盖玻璃的边缘，防止任何指甲油干燥。 - 在共和激光扫描显微镜下可视化染色样品。
注：为了激发两个探针的荧光（即钙化物和同质-1，EthD-1）将阿贡激光调至488nm。发射的荧光由三联色过滤器 488/561/633 分离，然后在 505×570 nm 测量为绿色荧光（钙素），在 630×750 nm 的红色过滤器 （EthD-1）。 - 将COC分为四类，使用根据死亡粒细胞35的百分比对培养中的卵巢卵泡进行修改分类。 V1：估计 100% 可行 C 的 COC;V2：具有 10% 死 2% 的 COC;V3：具有 10~50% 死 2C 的 COC;V4：具有 50% 死 C 的 COC。
注：从技术上讲，很难用活死测定来评估卵母细胞的可行性;因此，应该通过分析线粒体超结构或活性来估计。
- 用 38 °C 1x PBS 清洗 COCs（使用 FAB 和 LM 的培养器）。
- 通过透射电子显微镜检查IVM后卵母细胞超结构。
- 将 COC 在 100 μL 2.5% 谷胱甘肽中修复为 0.1 M 卡多迪酸钠缓冲液（pH 7.2，室温）2小时。
- 将 COC 浸入 100 μL 0.1 M 卡诺迪酸钠缓冲液中（在 4 °C 下过夜），并在同一缓冲液中冲洗。
- 在0.1 M卡多酸钠缓冲液（室温）中，用1%的三氧化二氮进行后修复COCs，1小时。
- 在醋酸兰醇染色（1%）后，在乙醇稀释的一系列中脱水COC（50%、60%、70%、90%和100%），在室温下隔夜渗透，随后两次树脂短暂变化，最后将其嵌入LR White中。
- 接下来，要定位和评估样品，用甲基蓝/蔚蓝II染色半薄部分（1 μm）。
- 最后，使用 TEM 检查超薄、双染色部分的超结构级别。
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Representative Results
在使用两种IVM系统的COC中，格兰努洛萨细胞相互紧密地粘附在一起，大多数回收的COC有完整的积液层（图1A，B）。此外，还保留了相当一部分积血细胞。
从COC可行性分析中获得的结果证实，两个系统应用于在体外条件下3D中封装猪卵母细胞，确保了最佳生长条件（图2）。在这两组中，只观察到高活力卵母细胞，V1 = 13%，V2 = 87% 的 FAB 和 10% V1，和 90% V2 的 LM（表 1）。
线粒体，通过透射电子显微镜（TEM）观察到，均匀地分布在卵母细胞中，其形状在IVM之后是壳状的45。其中只有少数被拉长，此外，它们的聚类是零星观察到的（图1C，D）。观察到内质性沉默，要么与线粒体相关，要么在卵细胞细胞细胞质中游出。脂质液滴出现为小暗圆结构和高尔吉仪器出现与扩张的蓄水池（图1C，D）。
| V1 | V2 | V3 | V4 | ||||
| % | 数量 | % | 数量 | % | 数量 | % | |
| 法布 | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| COC 总数： 144 | 16a | 128b | 0 | 0 | |||
表1.使用纤维蛋白-藻酸盐珠（FAB）和微生物反应器FEP、液体大理石（LM）封装后COCs的可行性结果。 结果给出为平均值。具有上标值 （a， b） 的值在统计上存在显著差异 （p <0.05）。
图1：代表性图像，显示96小时封装后COC的形态和超结构。 （A） FAB 内的 COCs 形态 - 光显微镜;（B） LM - 光显微镜内的COCs形态;C： 卵母细胞超结构 （TEM） 后体外培养在 FAB 内;D： 母细胞超结构 （TEM） 后体外培养在 LM 内。O： 卵母细胞;CCs：积细胞;ZP： 佐纳·佩卢西达;N： 核;M：线粒体;G： 高尔吉仪器;ER：内质性内质性内质性内质性内质性内质性内质性内质性内质性内质性内质性Lp： 脂滴;FA：藻酸盐和纤维素丝;FEP：六氟丙烯和四氟乙烯的聚酯粉末。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：封装96小时后COC的代表性荧光图像。（A，B）在体外培养后为同一COC获得的图像使用FAB与两个过滤器，分别可视化绿色荧光或红色荧光的活细胞或死细胞和（C）合并两者。（D， E）在体外培养使用 LM 与两个过滤器显示活细胞或死细胞的绿色荧光或红色荧光以及 （ F ） 合并后为同一COC获得的图像。比例线 = 50 μm。白色星号表示细胞正在凋亡。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
能够保持体外生长的卵母细胞，但也在其周围的积细胞，同时支持其成熟是极其必要的成功的辅助生殖技术，并促进对体细胞/卵母细胞相互作用的理解，特别是在物种，如人类或猪。不断改进的IVM技术正在成为在多囊卵巢综合征（PCOS）、卵巢过早衰竭或最终不育（肿瘤治疗）的情况下保留生殖选择的重要工具。此外，由于某些卵巢功能障碍可能是由调节性卵泡生长不良引起的，了解控制卵母细胞适当发育的分子和细胞机制可能为病理生理学和合理治疗这些情况提供重要的见解。体外培养系统支持在 IVM 期间维护 COC 3D 架构，需要在矩阵中或生物反应器内进行封装。这项工作描述了一个协议，可以应用于猪卵母细胞的培养。这里介绍的诱导猪COC生长发育的两种3D体外培养系统都使用友好，能够有效控制卵母细胞和积细胞的生存。
COC在纤维蛋白-藻酸水凝胶珠（FAB）中封装的第一个体外培养方法允许在主动细胞反应基质环境中形成3D卵母细胞生长。以前公布的基于藻酸盐水凝胶的协议通常用于研究从众多动物物种中分离出的卵巢卵泡的发展，结果非常有希望。有趣的是，无论藻酸盐水凝胶32 的最终组成或封装方法本身46，这些研究表明，藻酸盐珠基3D培养系统能够支持卵泡生长和生存。
藻酸盐水凝胶对卵泡温和，不影响其进一步的生存或体外发育。同样，这里首次描述的COC的体外培养协议，适合产生优质的猪卵母细胞，因为它在形态和超结构水平上都有记载。纤维蛋白原在藻酸盐溶液中的存在及其同时凝胶，导致形成一个渗透网络，创造并进一步稳定三维环境。由于这种基质内的特定结构支持，卵母细胞和积细胞之间的细胞间接触和寄生虫素的通信与体内的这种联系保持相似。
本文档中描述的成熟协议中的两个最关键步骤是，使用藻酸溶酶（步骤 2.11）将 FA 胶囊从孵化室转移到包含 MM 的 96 孔板中，以及在溶解胶囊中去除 COC。这两个步骤都需要大量的手工技能和精度，以避免，在第一种情况下，胶囊的破坏，在第二 - 损坏的COCs。
这种方法的主要优势，除了为大型家畜的卵母细胞成熟建立最佳条件外，在使用TEM、轻显微镜或共生显微镜进行分析时，无需去除胶囊。在成像时，藻酸盐不是障碍。将 COC 留在胶囊中有助于在染色过程中进行操作。
这里介绍的第二个COC体外培养物是使用LM的，它通常是由微尺度颗粒覆盖的不粘液滴，只需在非常疏水粉末47中滚动少量液体即可获得。以往利用LM进行培养的研究，包括成纤维细胞48、红血球49、肿瘤器官38、胰腺细胞50或羊卵母细胞36等，都利用聚四氟乙烯（PTFE）作为水性聚合物制备液滴。PTFE在诊所被广泛使用（例如心血管移植物）。
在这项工作中，我们首次提出了一种可靠的方法，用于用FEP颗粒制造的微生物反应器，用于猪COC的体外培养。在提出的协议中使用FEP，在组成和性能上与PTFE非常相似，使得LM的制备更加容易。这种粉末比PTFE更软，尤其重要的是，它是透明的。这反过来又简化了使用结构培养的结构成像过程中的工作。使用FEP形成LM的易用性是该方法的一个明显优势。
本文档中描述的成熟协议中最关键的步骤是使用移液器尖端（步骤 3.3. 和 3.4）拾取并转移成形的 LM 到 60 mm IVF 培养皿中。这些步骤需要大量的手动技能和精度，以避免 LM 的破坏。
可能， 这里介绍的 3D 卵母细胞成熟诱导协议的主要限制是， 获得适当的研究材料， 从未用抗生素治疗的动物收集， 合成代谢类固醇 （即纳龙， 大胆酮） 或醋酸醇， 促进其快速生长相对较大的困难.这些类固醇， 尽管在欧洲被禁止使用， 仍然广泛用于工业牲畜育种在育肥期的最后两个月， 这导致， 除其他外， 扰乱性成熟.
总之，这里介绍的两个3D系统都保持了最佳的体外培养环境。他们还通过防止其扁平化和由此破坏间隙结来维护COCs 3D组织，从而保持卵母细胞与周围卵泡细胞之间的功能关系，这对正确的卵细胞成熟至关重要。因此，这两种模型都是生殖生物学基础研究的宝贵工具，也可能具有临床相关性，从而改善不孕症治疗。此外，它们还可用于开发新的生物技术方法，以及牲畜改良。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者非常感谢：Waclaw Twozydlo博士（贾吉洛尼亚大学动物学和生物医学研究所发育生物学和无脊椎动物形态学系）在TEM的技术设施;Beata Snakowska女士（贾吉洛尼亚大学动物学和生物医学研究所内分泌学系）提供技术援助;到日本济隆大学动物学和生物医学研究所细胞生物学和成像系，JEOL JEM 2100HT（日本东京，日本 JEOL）。波兰国家科学中心2018/29/N/NZ9/00983赠款支持这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
References
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