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Biology

पोर्सिन ओसाइट एनकैप्सुलेशन के लिए प्रोटियोलिटीली अवक्रमित एल्गिनेट हाइड्रोगेल्स और हाइड्रोफोबिक माइक्रोबायोरेक्टर

Published: July 30, 2020 doi: 10.3791/61325
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Endocrinology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University in Krakow, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College, 3Department of Experimental Hematology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University in Krakow

Summary

यहां प्रस्तुत 3 डी संस्कृति स्थितियों में पोर्सिन ओसाइट्स के एनकैप्सुलेशन के लिए दो प्रोटोकॉल हैं। पहले में, क्यूमुलस-ओसाइट परिसरों (सीओसी) को फाइब्रिन-एल्गिनेट मोतियों में समझाया जाता है। दूसरे में, वे फ्लोरिनेटेड एथिलीन प्रोपलीन पाउडर कणों (माइक्रोबायोरिएक्टर) से जुड़े होते हैं। दोनों सिस्टम अपने 3D संगठन को बनाए रखने के लिए इष्टतम स्थितियां सुनिश्चित करते हैं।

Abstract

प्रजनन जीव विज्ञान में, कृत्रिम गर्भाधान और भ्रूण हस्तांतरण प्रौद्योगिकी के साथ शुरू हुई जैव प्रौद्योगिकी क्रांति ने ओमेटिक सेल से परमाणु हस्तांतरण द्वारा ओसाइट इन विट्रो परिपक्वता (आईवीएम), इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) और घरेलू जानवरों की क्लोनिंग जैसी सहायता प्राप्त प्रजनन तकनीकों के विकास का नेतृत्व किया। इवीएम विशेष रूप से महत्व की विधि है। यह व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण या लुप्तप्राय प्रजातियों में पीढ़ी के अंतराल को कम करने, विट्रो मानव प्रजनन से संबंधित अनुसंधान, और सेल चिकित्सा के लिए ट्रांसजेनिक जानवरों के उत्पादन जैसे अनुप्रयोगों के लिए परिपक्व, अच्छी गुणवत्ता वाले ओसाइट्स की आपूर्ति के लिए मंच प्रौद्योगिकी है। ओसाइट गुणवत्ता शब्द में परिपक्वता को पूरा करने की क्षमता शामिल है, निषेचित किया जाना है, जिसके परिणामस्वरूप स्वस्थ संतान होती है। इसका मतलब यह है कि आईवीएफ प्रक्रियाओं सहित सफल निषेचन के लिए अच्छी गुणवत्ता के ओसाइट्स सर्वोपरि हैं। यह एक विश्वसनीय संस्कृति विधि विकसित करने के लिए कई कठिनाइयां बन गया है जो न केवल मानव ओसाइट्स बल्कि अन्य बड़ी स्तनधारी प्रजातियों के विकास का समर्थन करेगा। इवीएम में पहला कदम ओसाइट्स की इन विट्रो संस्कृति है। यह काम पोर्सिन ओसाइट्स की 3 डी संस्कृति के लिए दो प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। पहले में, 3 डी मॉडल क्यूमुलस-ओसाइट कॉम्प्लेक्स (सीओसी) को फाइब्रिन-एल्गिनेट मनका इंटरपेनेट्राटिंग नेटवर्क में समझाया जाता है, जिसमें फाइब्रिन और एल्गिनेट का मिश्रण एक साथ होता है। दूसरे में, सीओसी को मध्यम की एक बूंद में निलंबित कर दिया जाता है और फ्लोरिनेटेड एथिलीन प्रोपलीन (एफईपी; हेक्साफ्लोरोप्रोपिलीन और टेट्राफ्लोरोएथिलीन) पाउडर कणों का एक कोपॉलिमर के साथ तरल मार्बल्स (एलएम) के रूप में परिभाषित माइक्रोबायोरेटर्स बनाने के लिए निलंबित कर दिया जाता है। दोनों 3 डी सिस्टम विट्रो संस्कृति वातावरण में गैसीय बनाए रखते हैं। वे गैप जंक्शनों के अपने सपाट और परिणामस्वरूप व्यवधान को रोककर COCs 3D संगठन को भी बनाए रखते हैं, जिससे ओसाइट और आसपास की कूप कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक संबंध बनाए जाते हैं।

Introduction

त्रि-आयामी (3 डी) लोगों सहित विभिन्न संस्कृति प्रणालियों के विकास का उद्देश्य विकास के शुरुआती चरणों में भी रोम से अलग किए गए ओसाइट्स के विकास और परिपक्वता के लिए इष्टतम स्थितियां प्रदान करना है। यह सहायता प्राप्त प्रजनन तकनीकों (एआरटी) के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से उन महिलाओं की बढ़ती संख्या को देखते हुए जो कैंसर के इलाज के बाद बांझपन से जूझ रही हैं1। इन विट्रो स्थितियों (आईवीएम) में ओसाइट्स की परिपक्वता पहले से ही एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है जो मुख्य रूप से पशुधन प्रजनन2के उद्देश्य से इन विट्रो भ्रूण उत्पादन के लिए उपयोग की जाती है। हालांकि, अधिकांश स्तनधारी प्रजातियों में, भले ही क्यूमुलस-ओसाइट परिसरों (सीओसी) की परिपक्वता की उच्च दर प्राप्त की जा सकती है (रेंज 60 से 90%)3,उनकी विकासात्मक क्षमता अभी भी जरूरतों के लिए अपर्याप्त है। इसका कारण यह है कि इस तरह से प्राप्त जाइगोट्स का विकास ब्लास्टोसिस्ट चरण तक कम है और सरोगेट जानवरों में स्थानांतरण के बाद उनकी अवधि की व्यवहार्यता कम हो जाती है। नतीजतन, ओसाइट्स से प्राप्त भ्रूणों की विकासात्मक क्षमता को बढ़ाने की आवश्यकता है जो आईवीएम प्रक्रिया4के अधीन थे। इसलिए , नए परिपक्वता मीडिया5 तैयार किए जा रहे हैं और इन विट्रो संस्कृति के विभिन्न अवधियों का परीक्षण कियाजाताहै 6,7 के साथ - साथ विभिन्न विकास कारकों और अणुओं के साथ संस्कृति मीडिया की पूरकता8,9।

किसी भी पूर्ण आईवीएम प्रणाली का पहला कदम इन विट्रो संस्कृति के दौरान ओसाइट्स के टिकाऊ विकास के लिए इष्टतम स्थितियां बनाना है। ओसाइट विकास10 , 11,को फिर से शुरू करने की ओसाइट की क्षमता के विशिष्टसंकेतकोंमें से एक है। इसके अलावा, विट्रो संस्कृति प्रणाली में एक उपयुक्त ओसाइट अपनी परमाणु परिपक्वता और साइटोप्लाज्मिक भेदभाव12का समर्थन करने में सक्षम होना चाहिए। क्यूमुलस-ओसाइट परिसर की आकृति विज्ञान एक और महत्वपूर्ण संकेतक है जो एआरटी क्लीनिक में मनुष्यों और पशुधन12, 13,में इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) प्रक्रिया के बाद के चरणों के लिए सबसे अच्छा ओसाइट का चयन करने के लिए उपयोग कियाजाताहै। COCs की रूपात्मक विशेषताओं में से हैं: ओसाइट व्यास, इसकी साइटोप्लाज्म ग्रैनुलेशन और पहला ध्रुवीय शरीर अखंडता14,,15। इसके अलावा, ओसाइट विकासात्मक क्षमता क्यूमुलस कोशिकाओं की उपस्थिति और कॉम्पैक्टेशन और ओसाइट के आसपास उनकी परतों की संख्या से सहसंबद्ध है। उपयुक्त ओसाइट इन विट्रो संस्कृति प्रणाली के लिए बहुत महत्वपूर्ण ओसाइट-क्यूमुलस कोशिकाओं का रखरखाव उचित बातचीत और साइटोस्केलेटनस्थिरता 16, 17,,18,,,19है।18 अब तक, मानव COCs के भीतर इन विट्रो ओसाइट विकास का प्रदर्शन किया गया है20। गाय COCs के उपयोग के साथ भी जीवित जन्म हुआ। इन्हें अपरिपक्व ओवेरियन रोम से अलग किया गया था और फिर 14 दिनों तक संस्कारी किया गया जब तक कि आईवीएफ प्रक्रिया से गुजरने के लिए ऊसाइट पर्याप्त रूप से बड़ा नहीं था21 इसी तरह, लंगूर एंट्रल रोम से अलग COCs, आईवीएम के अधीन इन विट्रो संस्कृति के बाद एक सामान्य दिखने वाली धुरी संरचना22के साथ मेटाफेज द्वितीय चरण में मेयोसिस को फिर से लागू करने में सक्षम ओसाइट्स मिले। हालांकि, इस अध्ययन में लेखकों ने उन्हें उपजाऊ बनाने की कोशिश नहीं की। फिर भी इस तरह के परिणामों से संकेत मिलता है कि एक समान प्रक्रिया न केवल इन विशेष स्तनधारी प्रजातियों के लिए लागू की जा सकती है बल्कि रोम से प्राप्त मानव क्यूमुलस-ओसाइट परिसरों के लिए भी लागू की जा सकती है जो एक सफल आईवीएफ तकनीक के लिए उपयुक्त अच्छी गुणवत्ता के ओसाइट्स प्राप्त करने की अनुमति नी चाहिए।

उपरोक्त वर्णित परिणाम पारंपरिक आईवीएम प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग के साथ प्राप्त किए गए थे जिसके दौरान ओसाइट्स को दो-आयामी (2 डी) प्रणालियों में सुसंस्कृत किया गया था। 2डी कल्चर सिस्टम में नियमित प्रक्रिया ओसाइट्स को कवर कर रही है, जो एक उपयुक्त संस्कृति मीडिया की एक बूंद में डूबी हुई है, जिसमें खनिज तेल23,,24है। यह माना जाता है कि इन विट्रो ओसाइट संस्कृति के दौरान एक तेल ओवरले तरल वाष्पीकरण को रोकने के लिए कार्य करता है, इस प्रकार संस्कृति में उचित पीएच और ऑस्मोटिक दबाव के रखरखाव को सुनिश्चित करता है। यद्यपि इस तरह की 2डी संस्कृति प्रणाली प्राप्त करने की अनुमति देती है, यहां तक कि परिपक्व सुअर ओसाइट्स25के 87% तक, यह साबित हो गया है कि खनिज तेल ओवरले लिपिड घुलनशील सामग्रियों के पर्याप्त प्रसार का कारण बनता है जो उचित ओसाइट्स विकास26के लिए आवश्यक हैं। इसके अतिरिक्त, ओसाइट संस्कृति के दौरान खनिज तेल में स्टेरॉयड (प्रोजेस्टेरोन और एस्ट्रोजेन) प्रसार के कारण, परमाणु परिपक्वता की देरी और सुअर ओसाइट्स की विकासात्मक क्षमता उपलब्धि में कमी देखी गई। इसके परिणामस्वरूप थोड़ी संख्या में ज़िगोट्स प्राप्त हो सकते हैं, जो अतिरिक्त रूप से ब्लास्टोसिस्ट के चरण में कम विकास क्षमता और प्राप्तकर्ताजानवरोंमें स्थानांतरित होने के बाद खराब व्यवहार्यता द्वारा विशेषता हैं। इसलिए, इवीएम प्रक्रिया के बाद प्राप्त ओसाइट्स से प्राप्त भ्रूणों की विकासात्मक क्षमता को बढ़ाने के प्रयास किए जा रहे हैं, जो विशेष रूप से त्रि-आयामी (3 डी) प्रणालियों का उपयोग करके, डीसी के साथ मिलकर सुसंस्कृत ओसाइट्स की साइटोप्लाज्मिक और परमाणु परिपक्वता दोनों को प्राप्त करने के लिए इष्टतम स्थितियां बनाते हैं । पिछले दो दशकों में28 , 29,29के दशक में विभिन्न अभिनव 3डी इन विट्रो कल्चर सिस्टम विकसित किए गए हैं . ये कोशिकाओं के प्राकृतिक स्थानिक संगठन को बनाए रखने और संस्कृति व्यंजनों में उनके सपाट होने से बचने के लिए डिज़ाइन किए गए थे जिन्हें पारंपरिक 2D संस्कृतियों में प्राप्त नहीं किया जा सकता है। सुसंस्कृत सीओसी की संरचनात्मक और कार्यात्मक गतिविधि को उनकी उचित वास्तुकला के रखरखाव और विभिन्न डिब्बों के बीच गैप-जंक्शनों के माध्यम से अविचलित संचार द्वारा सुनिश्चित किया जासकताहै। क्यूमुलस-ओसाइट परिसरों की विट्रो संस्कृति में 3 डी के लिए जैव-मचानों की उपयुक्तता का मूल्यांकन प्राकृतिक बायोमैटेरियल्स जैसे अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम; कोलेजन और हायलूरोनिक एसिड)31 या अक्रिय पॉलीमर (अल्जीनेट)32के विभिन्न घटकों का उपयोग करके किया गया है। कई प्रजातियों में किए गए इन प्रयासों से ओसाइट मेयोसिस बहाली और उनकी पूर्ण क्षमता 33 ,34,,3535की उपलब्धि के संदर्भ में आशाजनक परिणाम सामने आए . हालांकि अब तक, सूअरों सहित बड़े घरेलू जानवरों से अलग COCs परिपक्वता के लिए उपयुक्त कोई 3 डी प्रणाली विकसित नहीं की गई है ।

यह काम दो प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसका उपयोग पोर्सिन सीओसी की 3डी संस्कृति के लिए किया जा सकता है। पहला प्रोटोकॉल फाइब्रिन-एल्गिनेट मोतियों (एफएबी) में एनकैप्सुलेशन का वर्णन करता है। फैब एक साथ मिश्रण से एक एल्गिनेट और फाइब्रिन समाधान का गठन किया जा सकता है, जो एक समकालिक जेलेशन प्रक्रिया से गुजरता है। यह संयोजन एक गतिशील यांत्रिक वातावरण प्रदान करता है क्योंकि दोनों घटक मैट्रिक्स कठोरता में योगदान देते हैं। इसी प्रकार का समाधान पहले माउस ओवेरियन कूप संस्कृति और परिपक्वता36के लिए किया जाता रहा है . प्रस्तुत प्रोटोकॉल के मामले में, एल्गिनेट-फाइब्रिन नेटवर्क के समय से पहले गिरावट से बचने के लिए, कैल्शियम क्लोराइड समाधान की उचित रूप से उच्च सांद्रता का उपयोग किया जाता है, जिससे तेज और स्थिर जेलेशन प्रक्रिया सुनिश्चित होती है। गतिशील यांत्रिक वातावरण प्राकृतिक अंतर-कूप वातावरण में इनके समान स्थितियां बनाता है जिसमें सीओसी रहते हैं और आकार में वृद्धि करते हैं। इसके अतिरिक्त, काम COCs 3 डी संस्कृति प्रणालियों के प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाता है, जिसमें इन्हें मध्यम की एक बूंद में निलंबित कर दिया जाता है और फ्लोरिनेटेड एथिलीन प्रोपलीन (एफईपी; हेक्साफ्लोरोप्रोपिलीन और टेट्राफ्लोरोएथिलीन) पाउडर कणों का एक कोपॉलिमर, माइक्रोबायोरेक्टर (तरलता मार्बल्स, एलएम) बनाने के लिए। एलएम 3डी बायोरिएक्टर का एक रूप है जिसे पहले समर्थन करने के लिए दिखाया गया है, दूसरों के अलावा, जीवित सूक्ष्मजीवों का विकास37,ट्यूमर गोलाकार38 और भ्रूणस्टेमकोशिकाएं 39। भेड़ ओसाइट संस्कृति40के लिए एलएमएस का भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है । एलएमएस का उपयोग करके अधिकांश प्रयोगों में, बायोरिएक्टर 1 माइक्रोन41के कण आकार के साथ पॉलीटट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) पाउडर बिस्तर का उपयोग करके तैयार किए गए थे। प्रस्तुत प्रोटोकॉल एफईपी का उपयोग करता है, जो फ्लोरोपॉलिमर्स पीएफई के लिए संरचना और गुणों में बहुत समान है। लेकिन FEP अधिक आसानी से रूपिकीय और PTFE की तुलना में नरम है और क्या विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, यह अत्यधिक पारदर्शी है ।

दोनों 3 डी सिस्टम विट्रो संस्कृति वातावरण में गैसीय बनाए रखते हैं। वे गैप जंक्शनों के अपने सपाट और परिणामी व्यवधान को रोककर, ओसाइट और आसपास के कूप कोशिकाओं के बीच अपने कार्यात्मक संबंध को संरक्षित करके COCs 3 डी संगठन को भी बनाए रखते हैं।

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Protocol

जगीलोनियन विश्वविद्यालय में जूलॉजी और बायोमेडिकल रिसर्च संस्थान में पशु कल्याण समिति द्वारा निम्नलिखित प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई ।

1. पोर्सिन क्यूमुलस-ओसाइट परिसरों का अलगाव

  1. ओवेरियन रोम के अलगाव के लिए सामग्री एकत्र करने के लिए, एक स्थानीय कसाईघर में प्रीपुबर्टल गिल्ट्स (लगभग 6-7 महीने की उम्र, 70 से 80 किलोग्राम वजनी) से उत्पाद शुल्क पोर्सिन अंडाशय। प्रत्येक प्रयोग में COCs अलगाव के लिए 10 जानवरों से लगभग 20 सुअर अंडाशय चुनें।
    नोट: प्रत्येक अंडाशय की पैदावार 3-5 रोम को मानते हुए, रोम की कुल संख्या 60 से 100 तक भिन्न होती है।
  2. अंडाशय को थर्मस में बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस; पीएच 7.4; 38 डिग्री सेल्सियस) के साथ रखें जिसमें 1% आस होता है। सुनिश्चित करें कि प्रायोगिक सामग्री को 1 घंटे के भीतर प्रयोगशाला में ले जाया जाता है जहां इसे दो बार बाँझ पीबीएस के साथ धोया जाता है जिसमें एंटीबायोटिक्स होते हैं।
  3. अंडाशय को धोने के बाद, उन्हें एचएम माध्यम से भरे बीकर में स्थानांतरित करें और सभी जोड़तोड़ के समय के लिए 38 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में स्टोर करें।
    नोट: ओसाइट हैंडलिंग के दौरान इष्टतम परिणामों के लिए, डीएमईएम/एफ12 माध्यम (हैंडलिंग मीडियम, एचएम) में 2.5% एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक सॉल्यूशन (आस) और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के अलावा सभी प्रक्रियाओं को पूरा करें और पर्यावरण में सीओ 2 स्तर पर पीएच कोनियंत्रित करें, तापमान नियंत्रण (38 डिग्री सेल्सियस) के साथ एक हीटिंग टेबल पर और बैक्टीरियल संदूषण को कम करने के लिए लैमिनार फ्लो हुड के तहत।
  4. बड़े पोर्सिन रोम (व्यास में 6-8 मिमी) से कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए आकांक्षा और अपकेंद्रित्र पर 100 x ग्राम पर कूप तरल पदार्थ (एफएफ) एकत्र करें। उसके बाद, 0.2 माइक्रोन झिल्ली पोर फिल्टर से जुड़ी बाँझ सिरिंज का उपयोग करके सुपरनैंट को फ़िल्टर करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्नैप फ्रीज करें।
    नोट: कूप तरल पदार्थ की आकांक्षा के लिए एक इंसुलिन सिरिंज (यू-40) का उपयोग करें।
  5. सुनिश्चित करें कि, केवल स्वस्थ, मध्यम आकार के रोम (व्यास में 4-6 मिमी) COCs अलगाव४२के लिए चुना जाता है ।
    नोट: ग्रेड I के COCs, सजातीय ooplasm और बहुस्तरीय (कम से कम 3-4) कॉम्पैक्ट cumulus के साथ एक बरकरार और गोल oocyte रखने के आगे 3 डी IVM प्रक्रिया43के लिए उपयुक्त माना जाता है।
  6. COCs को अलग करने के लिए, एचएम से भरे बाँझ 10 सेमी व्यास पेट्री डिश में 2-3 अंडाशय को स्थानांतरित करें। नीचे दी गई प्रक्रियाओं में से एक का पालन करके मध्यम आकार के रोम से COCs को अलग करें।
    1. धीरे-धीरे एक बाँझ सर्जिकल ब्लेड 15C के साथ फैला हुआ अंडाशय रोम की सतह को काट लें। इससे कोक्स के साथ कूप तरल पदार्थ पेट्री डिश में प्रवाहित होगा।
    2. 28 जी सुई का उपयोग करके कूप सामग्री को 5/8 का आकार "एक डिस्पोजेबल सिरिंज से जुड़ा हुआ है और इसे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
      नोट: अंडाशय के ऊतकों के अवशेषों को त्यागें। अलगाव के बाद के चरणों को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है।
  7. 3-5 60 मिमी आईवीएफ पेट्री व्यंजन तैयार करें।
    1. केंद्रीय कुओं में एचएम की 1 एमसीएल जोड़ें और अपने बाहरी छल्ले में एचएम (50 माइक्रोन प्रति बूंद) की 3-4 बूंदें रखें।
    2. फिर, पॉलीकार्बोनेट माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, अक्षतिग्रस्त COCs को बाहरी छल्ले में एचएम की बूंदों में ले जाएं ताकि उन्हें 3-4 बार संक्षेप में कुल्ला सके।
    3. अंत में, व्यक्तिगत रूप से उन्हें केंद्रीय कुएं में स्थानांतरित करें। आगे की प्रक्रियाओं के लिए एक इनक्यूबेटर में इस आईवीएफ प्लेटों को स्टोर करें।
  8. सीओसी एकत्र होने के बाद, उन्हें बेतरतीब ढंग से नीचे सूचीबद्ध दो अलग-अलग आईवीएम एनकैप्सुलेशन प्रोटोकॉल में असाइन करके अंतिम चयन चरण करें।

2. फाइब्रिन-एल्गिनेट हाइड्रोजेल मोतियों में एनकैप्सुलेशन

  1. 2.0 एमएल बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 100 एमसीएम सीएसीएल2 के साथ ट्राइस-बफर खारा (टीबीएस; पीएच 7.4) में 50 आईयू/एमएल थ्रोम्बिन का 1 एमएल तैयार करें।
  2. फिब्रिनोजेन स्टॉक सॉल्यूशन (टीबीएस में 50 मिलीग्राम/एमएल) तैयार करें और इसे फ्रीज रखें।
    नोट: टीबीएस में फाइब्रिनोजन को भंग करते समय झुरमुट से बचने के लिए, टीबीएस को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    1. प्रक्रिया के दिन, यह बर्फ पर धीरे-धीरे गल और सही उपयोग से पहले कमरे के तापमान में लाने के लिए।
  3. बस से पहले एक 1:1 अनुपात ०.५% एल्गिनेट समाधान और ५० मिलीग्राम/एमएल fibrinogen समाधान पर मिश्रण का उपयोग करने के लिए अंत में 2 mL (एफए) मिलता है । एक बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में धीरे से मिश्रण भंवर। बुलबुले बनाने से बचें।
  4. "इनक्यूबेशन कक्षों" को तैयार करने के लिए, ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पैराफिन फिल्मों की पतली स्ट्रिप्स लगाएं।
    नोट: उपयोग से पहले 70% EtOH के साथ स्लाइड पोंछें। एक इनक्यूबेशन चैंबर दो स्लाइड के साथ बनता है। उन्हें अलग करने के लिए, उनमें से एक पर 3 मिमी स्पेसर्स रखें।
  5. इस पैराफिन फिल्म कोटेड ग्लास स्लाइड पर एफए मिश्रण की पिपेट 7.5 माइक्रोल बूंदें, जिसमें स्पेसर्स को अलग किया गया है। एक स्लाइड पर 8-10 बूंदें, दो पंक्तियों में व्यवस्थित।
  6. स्थानांतरण, एक माइक्रोपिपेट, 3-5 COCs का उपयोग करके परिपक्वता माध्यम (एमएम) की न्यूनतम मात्रा (5 माइक्रोल तक) के साथ, और उन्हें एफए ड्रॉप के केंद्र में ठीक रखें। इस प्रक्रिया के लिए अच्छे मैनुअल कौशल और परिशुद्धता की आवश्यकता होती है।
    नोट: परिपक्वता माध्यम (एमएम) DMEM/F12 के होते हैं, 10 IU/mL PMSG, 10 IU/mL hCG, 10% एफबीएस और ५०% पोर्सिन कूप तरल पदार्थ (एफएफ) के साथ पूरक कदम १.४ में एकत्र ।
  7. प्रत्येक एफए ड्रॉप पर थ्रोम्बिन/सीए 2 + समाधान का7.5 माइक्रोन जोड़ें, बस उन्हें कवर करने के लिए। उन्हें मिलाने की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि जेल लगभग तुरंत रूपों।
  8. एफए कैप्सूल के लिए दूसरा, पहले से तैयार ग्लास स्लाइड लागू करके इनक्यूबेशन कक्ष को कवर करें। एक बहुत ही सावधान लेकिन दृढ़ आंदोलन के साथ, चैंबर को उल्टा करें और सुखाने से बचने के लिए नम फिल्टर पेपर के साथ लाइन में लगे 100 मिमी पेट्री डिश में रखें।
  9. इसके बाद पेट्री डिश को 5% सीओ2 इनक्यूबेटर (38 डिग्री सेल्सियस) को करीब 5-7 मिनट के लिए ट्रांसफर करें। इसके बाद, एफई कैप्सूल फाइब्रिन और एल्गिनेट के एक साथ जेलेशन के कारण बादल बन जाएंगे।
  10. एफए कैप्सूल को 96 अच्छी तरह प्लेटों में स्थानांतरित करें (एक कैप्सूल प्रति अच्छी तरह से) जिसमें 100 माइक्रोन एमएम शामिल हैं।
    नोट: गठित एफए कैप्सूल को नुकसान नहीं पहुंचाने के लिए, सर्जिकल संदंश के उपयोग के साथ इस कदम को ध्यान से करें।
  11. हर 2 दिन एमएम (50 माइक्रोल) के आधे हिस्से को ताजा, पूर्व-संतुलन वाले के साथ बदल देते हैं। एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि COCs (10x आवर्धन पर) ।
    नोट: COCs एफए संस्कृति के लिए संस्कृति की स्थिति: 38 डिग्री सेल्सियस, एक 5% सीओ2 वातावरण और सापेक्ष आर्द्रता 95% के तहत। इवीएम के 4 दिनों के बाद, फाइब्रिन घटक के प्रगतिशील क्षरण के कारण हाइड्रोगेल लगभग स्पष्ट दिखाई देते हैं। शेष एल्गिनेट को एंजाइमेटिक रूप से अपमानित किया जाना चाहिए - एल्गिनेट-लिज़ द्वारा, एक पौधे से व्युत्पन्न एंजाइम जो विशेष रूप से एल्गिनेट को कम करता है और पशु कोशिकाओं को प्रभावित नहीं करता है।
    1. कैप्सूल युक्त कुओं से एमएम निकालें और डीएमईएम में 10 आईयू/एमएल एल्गिनेट लीज के 100 माइक्रोन जोड़ें। इनक्यूबेटर में कल्चर प्लेट को 25-30 मिनट के लिए छोड़ दें।
    2. भंग कैप्सूल से COCs निकालें।
      नोट: यह एक कट पिपेट टिप के साथ किया जा सकता है।
    3. एक ताजा डीएमईएम में कई धोता के बाद, पीबीएस युक्त आईवीएफ डिश (5-10 सीओसी प्रति डिश) की आंतरिक अंगूठी में सीओसी स्थानांतरित करें। अब, उन्हें आगे रूपात्मक या जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए उपयोग करें।

3. सुपर हाइड्रोफोबिक फ्लोरिनेटेड एथिलीन प्रोपलीन (एफईपी) माइक्रोबायोरिएक्टर्स में एनकैप्सुलेशन।

नोट: सुनिश्चित करें कि सभी आईवीएम प्रक्रियाएं थर्मोस्टैटिक रूप से नियंत्रित टेबल पर की जाती हैं और सीओसी को उनकी हैंडलिंग के दौरान 38 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है।

  1. 30 एमएम पेट्री डिश तैयार करें जिसमें 5 ग्राम एफईपी पाउडर बेड-एवरेज पार्टिकल साइज 1 माइक्रोम हो।
    नोट: ताजा एफईपी पाउडर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। फिर से इस्तेमाल किया FEP कुल और गुच्छों रूपों की आदत है ।
  2. एफईपी पाउडर के बिस्तर पर चरण 1.6 में अलग 3-5 COCs युक्त एमएम (मात्रा में ~ 30 μL) की एक बूंद वितरित करें। प्लेट को धीरे-धीरे एक गोलाकार गति में घुमाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इन कणों ने तरल बूंद और तरल संगमरमर (एलएम) की सतह को पूरी तरह से कवर किया।
  3. 1,000 μL टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करके एलएम का गठन करें।
    नोट: एलएम (4-5 मिमी) के व्यास को समायोजित करने के लिए, किनारे पर पिपेट टिप काटें। इस तरह के तैयार टिप का अनुमानित व्यास एलएम की तुलना में थोड़ा बड़ा होना चाहिए।
  4. कई 60 मिमी आईवीएफ पेट्री व्यंजन तैयार करें। आर्द्रता कक्ष तैयार करने के लिए बाहरी छल्ले में बाँझ पानी की 3-4 एमएल जोड़ें। इसके बाद, एक एलएम को केंद्रीय कुएं में रखें।
    नोट: इस प्रक्रिया को अच्छे मैनुअल कौशल और परिशुद्धता की आवश्यकता होती है - यदि संगमरमर को लापरवाही से रखा जाता है या कम ऊंचाई से भी गिर जाता है तो इसे नष्ट कर दिया जाएगा।
  5. 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 38 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए इनक्यूबेट मार्बल्स।
    1. प्रक्रिया के बाद दैनिक माध्यम बदलें: प्रत्येक एलएम पर एमएम के 30 माइक्रोन लागू करें, जो उनके प्रसार का कारण बनेगा क्योंकि प्रत्यक्ष तरल संपर्क लेपित एफईपी पाउडर की हाइड्रोफोबसिटी को बाधित करता है। जब संगमरमर की सामग्री भंग हो जाती है, तो बायोरिएक्टर से पेट्री डिश में ताजा एमएम की एक बूंद के लिए जारी COCs स्थानांतरित करें।
      नोट: जारी COCs को ठीक से स्थानांतरित करने के लिए, पॉलीकार्बोनेट माइक्रोपिपेट का उपयोग करें।
    2. एफईपी कणों को हटाने के लिए एमएम (3-4 बार) में कई वॉश के बाद, उन्हें एफईपी पाउडर बिस्तर पर ताजा एमएम के 30 माइक्रोन के साथ स्थानांतरित करें। धीरे-धीरे प्लेट को एक गोलाकार गति में घुमाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पाउडर कणों ने तरल बूंद की सतह को पूरी तरह से कवर किया और एक नया एलएम बनाएं।
    3. फिर चरण 3.3-3.4 से प्रक्रिया का पालन करें।
      नोट: एफईपी पाउडर की पारदर्शी कोटिंग हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एलएम सामग्री की निगरानी करने की अनुमति देती है।

4. दो 3 डी सिस्टम का उपयोग करके 96-एच आईवीएम प्रक्रिया के बाद COCs का लक्षण वर्णन

नोट: उपयोग किए गए आईवीएम प्रणालियों की दक्षता निर्धारित करने के लिए, एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत COCs रूपात्मक रूप से स्कोर करें। इसके अतिरिक्त, सीओसी व्यवहार्यता44के विश्लेषण के लिए कैल्सीन एएम और एथिडियम होमोमर (एटीएचडी-1) रंगों के साथ डबल फ्लोरोसेंट लेबलिंग का उपयोग करें।

  1. प्रकाश और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा आईवीएम के बाद ओसाइट्स की रूपात्मक परीक्षा।
    1. 38 डिग्री सेल्सियस 1x पीबीएस के साथ कोक्स (फैब और एलएम से उपयोग करने वाले संस्कृति से प्राप्त दोनों) को धोएं।
      नोट: COCs की हैंडलिंग की सुविधा और धुंधला प्रक्रिया के दौरान उन्हें नुकसान नहीं करने के लिए, एक 96 या 48 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करें और बाद के कुओं के लिए COCs स्थानांतरित करके प्रत्येक धुंधला कदम प्रदर्शन करते हैं।
    2. उन्हें 1.6 m calcein AM के 100 माइक्रोन में और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-45 मिनट के लिए 5.5 m EthD-1 में इनक्यूबेट। 1x पीबीएस में दोनों पदार्थों को पतला करें।
      नोट: क्योंकि यह एक दो रंग फ्लोरेसेंस परख है, अंधेरे में इस कदम को अंजाम ।
    3. इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस में दो बार सीओसी धोएं और फिर इसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन और फ्लोरोसेंट रंगों(सामग्रीकी तालिका) के तेजी से फोटोब्लैचिंग को रोकने के लिए डिज़ाइन किए गए एक एंटीफैड बढ़ते माध्यम में विसर्जित कर दें।
      नोट: किसी भी नेल पॉलिश के साथ सुखाने के खिलाफ कवर ग्लास के किनारों की रक्षा करें।
    4. एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के तहत दाग नमूनों की कल्पना करें।
      नोट: दोनों जांच (यानी, कैल्सीन और एथिडियम होमोडिम-1, एटीएचडी-1) के फ्लोरेसेंस को उत्तेजित करने के लिए 488एनएम के लिए एक आर्गन लेजर ट्यून करें। उत्सर्जित फ्लोरेसेंस को ट्रिपल डिक्रोइक फिल्टर 488/561/633 से अलग किया जाता है और फिर हरे रंग (कैल्सीन) के लिए 505−570 एनएम पर मापा जाता है, और लाल एक (एटीएचडी-1) के लिए 630−750 एनएम पर मापा जाता है।
    5. सीओसी को चार श्रेणियों में वर्गीकृत करें, संशोधित वर्गीकरण का उपयोग करके जो मृत ग्रेनुलोसा कोशिकाओं के प्रतिशत के आधार पर कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस इमेजिंग के आधार पर संस्कृति में अंडाशय कूपों पर लागू होता है35।  V1: अनुमानित 100% व्यवहार्य सीसी के साथ COCs; V2: मृत सीसीएस के 10% के साथ COCs; V3: मृत सीसीएस के 10-50% के साथ COCs; V4: मृत CCs के 50% के साथ COCs।
      नोट: तकनीकी रूप से, लाइव-डेड परख के साथ ओसाइट की व्यवहार्यता का आकलन करना मुश्किल है; इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर या गतिविधि का विश्लेषण करके इसका अनुमान लगाया जाना चाहिए।
  2. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आईवीएम के बाद ओसाइट्स अल्ट्रास्ट्रक्चर की जांच।
    1. 2 घंटे के लिए 0.1 एम सोडियम कैकोडिलेट बफर (पीएच 7.2, कमरे के तापमान) में 100 माइक्रोन 2.5% ग्लूटारल्डिहाइड में COCs को ठीक करें।
    2. 100 माइक्रोन 0.1 एम सोडियम कैकोडिलेट बफर (रात 4 डिग्री सेल्सियस पर) में COCs विसर्जित करें और एक ही बफर में कुल्ला करें।
    3. 1 घंटे के लिए 0.1 मीटर सोडियम कैकोडिल बफर (कमरे का तापमान) में 1% ऑस्मियम टेट्रोएक्साइड के साथ पोस्टफिक्स सीओसी।
    4. यूरैनिल एसीटेट (1%) में धुंधला होने के बाद, इथेनॉल कमजोर पड़ने (50%, 60%, 70%, 90% और 100%) की बढ़ती श्रृंखला में डीहाइड्रेट COCs, उन्हें कमरे के तापमान पर रात भर घुसपैठ करते हैं, इसके बाद राल के दो छोटे परिवर्तन होते हैं और अंत में, उन्हें एलआर व्हाइट में एम्बेड करते हैं।
    5. इसके बाद, नमूनों को उन्मुख और मूल्यांकन करने के लिए, मेथिलीन ब्लू/नीला II के साथ दाग अर्द्ध-पतली वर्ग (1 माइक्रोन) ।
    6. अंत में, टेम के साथ अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर अल्ट्राथिन, दोगुना दाग वर्गों की जांच करें।

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Representative Results

दोनों आईवीएम प्रणालियों का उपयोग कर COCs में, ग्रेनुलोसा कोशिकाओं को कसकर एक दूसरे का पालन किया, और बरामद COCs के अधिकांश cumulus कोशिकाओं की परतों बरकरार था(चित्रा 1A, बी)। इसके अतिरिक्त, क्यूमुलस कोशिकाओं का पर्याप्त अनुपात बनाए रखा गया था।

COCs व्यवहार्यता विश्लेषण से प्राप्त परिणामों की पुष्टि की है कि दोनों प्रणालियों विट्रो स्थितियों में 3 डी में पोर्सिन oocytes के encapsulation के लिए लागू इष्टतम विकास की स्थिति(चित्रा 2)सुनिश्चित किया । दोनों समूहों में, केवल उच्च व्यवहार्यता ओसाइट्स देखे गए, V1 = 13%, एफएबी के लिए V2 = 87% और 10% V1, और एलएम के लिए 90% V2 क्रमशः(तालिका 1)।

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टेम) द्वारा मनाया जाने वाला माइटोकॉन्ड्रिया, ओसाइट्स में समान रूप से वितरित किया गया था, आईवीएम के बाद उनका आकार शेल-जैसे45थे। उनमें से केवल कुछ को बढ़ाया गया था, इसके अलावा, उनके क्लस्टरिंग को छिटपुट रूप से देखा गया था(चित्रा 1सी, डी)। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम देखा गया, या तो माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़ा हुआ था या ओसाइट साइटोप्लाज्म में मुफ्त था। लिपिड बूंदें छोटे अंधेरे गोल संरचनाओं के रूप में दिखाई दीं और गोलगी उपकरण फैली हुई सिस्टर्ना(चित्रा 1सी, डी)के साथ उभरा हुआ था।

V1 V2 V3 V4
% संख्या % संख्या % संख्या %
फैब 13% 7 87% 48 - -
Lm 10% 9 90% 80 - -
सीओसी कुल संख्या: 144 16क 128बी 0 0

तालिका 1. फाइब्रिन-एल्गिनेट मोतियों (एफएबी) और माइक्रोबायोरेएक्टर एफईपी, लिक्विड मार्बल्स (एलएम) का उपयोग करके एनकैप्सुलेशन के बाद COCs की व्यवहार्यता पर परिणाम। परिणाम औसत के रूप में दिए गए। सुपरस्क्रिप्ट (ए, बी) के साथ मूल्य सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण (पी & 0.05) भिन्न थे।

Figure 1
चित्र 1: 96 घंटे के एनकैप्सुलेशन के बाद सीओसी की आकृति विज्ञान और अल्ट्रास्ट्रक्चर दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां। (A)फैब के अंदर COCs की आकृति विज्ञान - प्रकाश माइक्रोस्कोपी; (ख)एलएम के अंदर COCs की आकृति विज्ञान - प्रकाश माइक्रोस्कोपी; सी: फैब के अंदर इन विट्रो संस्कृति के बाद ओसाइट अल्ट्रास्ट्रक्चर (TEM); डी: एलएम के अंदर इन विट्रो संस्कृति के बाद ओसाइट अल्ट्रास्ट्रक्चर (TEM)। हे: ओसाइट; सीसी: क्यूमुलस कोशिकाएं; जेडपी: जोना पेल्फुसिडा; एन: नाभिक; एम: माइटोकॉन्ड्रिया; जी: गोलगी उपकरण; ईआर: एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; एलपी: लिपिड बूंद; एफए: एल्गिनेट और फाइब्रिन फिलामेंट्स; एफईपी: हेक्साफ्लोरोप्रोपिलीन और टेट्राफ्लोरोएथिलीन के कोपॉलिमर का पाउडर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एनकैप्सुलेशन के 96 घंटे के बाद COCs के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियां। (A,B) इन विट्रो संस्कृति के बाद एक ही COCs के लिए प्राप्त छवियों को दो फिल्टर के साथ फैब का उपयोग करने के लिए क्रमशः जीवित या मृत कोशिकाओं के लिए हरी फ्लोरेसेंस या लाल फ्लोरेसेंस कल्पना और(सी)दोनों के विलय । (D,E) इन विट्रो संस्कृति के बाद एक ही COCs के लिए प्राप्त छवियों दो फिल्टर के साथ एलएम का उपयोग करने के लिए हरे रंग की फ्लोरेसेंस या जीवित या मृत कोशिकाओं के लिए लाल फ्लोरेसेंस कल्पना, क्रमशः और(एफ)उनमें से विलय । स्केल बार = 50 माइक्रोन। सफेद तारांकन एपोप्टोसिस से गुजरने वाली कोशिकाओं का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

न केवल ओसाइट के बल्कि इसके आसपास की क्यूमुलस कोशिकाओं के साथ-साथ इसकी परिपक्वता का समर्थन करने की क्षमता न केवल ओसाइट के विकास में बनाए रखने की क्षमता और सफल सहायता प्राप्त प्रजनन प्रौद्योगिकियों के लिए और विशेष रूप से मनुष्य या सूअरों जैसे लंबे समय तक कूप विकास से गुजरने वाली प्रजातियों में दैहिक कोशिका/ओसाइट इंटरैक्शन की समझ को आगे बढ़ाने के लिए बेहद आवश्यक है । लगातार बेहतर आईवीएम तकनीक पॉलीसिस्टिक ओवेरियन सिंड्रोम (पीसीओएस), समय से पहले अंडाशय विफलता, या निश्चित बांझपन (ऑन्कोथेरेपी) के मामलों में प्रजनन विकल्पों को संरक्षित करने के लिए उपयोगी उपकरण बन रही हैं। इसके अलावा, चूंकि कुछ अंडाशय की बीमारी डिस्स्केरिलेट कूप विकास के कारण हो सकती है, इसलिए आणविक और सेलुलर तंत्र को समझना जो ओसाइट के उचित विकास को नियंत्रित करता है, इन स्थितियों के रोगविज्ञान और तर्कसंगत उपचार में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इन विट्रो कल्चर सिस्टम जो आईवीएम के दौरान सीओसी 3डी आर्किटेक्चर के रखरखाव का समर्थन करेंगे, मैट्रिक्स में या बायोरिएक्टर के अंदर एनकैप्सुलेशन के एक कदम की आवश्यकता होती है। यह काम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसे पोर्सिन ओसाइट्स की संस्कृति के लिए लागू किया जा सकता है। पोर्सिन सीओसी के विकास और विकास को प्रेरित करने के लिए यहां प्रस्तुत 3 डी इन विट्रो कल्चर सिस्टम उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं और ओसाइट और क्यूमुलस कोशिकाओं के अस्तित्व दोनों के प्रभावी नियंत्रण के लिए अनुमति देते हैं।

यहां प्रस्तुत फाइब्रिन-एल्गिनेट हाइड्रोगेल मोतियों (एफएबी) में अपने एनकैप्सुलेशन का उपयोग करके COCs की पहली इन विट्रो संस्कृति विधि सक्रिय रूप से सेल-उत्तरदायी मैट्रिक्स वातावरण में 3 डी ओसाइट विकास की अनुमति देती है। एल्गिनेट हाइड्रोगेल पर आधारित पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल का उपयोग आमतौर पर कई पशु प्रजातियों से अलग ओवेरियन रोम के विकास की जांच के लिए किया जाता था, जिसके बहुत आशाजनक परिणाम32थे । दिलचस्प बात यह है कि एल्गिनेट हाइड्रोगेल32 या एनकैप्सुलेशन विधि की अंतिम संरचना कीपरवाहकिए बिना, इन अध्ययनों से पता चला है कि एल्गिनेट मनका-आधारित 3 डी संस्कृति प्रणालियां कूप विकास और उनके अस्तित्व का समर्थन करने में सक्षम थीं।

एल्गिनेट हाइड्रोगेल रोम पर कोमल थे, जो विट्रो में उनके आगे के अस्तित्व या विकास को प्रभावित नहीं करते थे। इसी तरह, यहां पहली बार वर्णित COCs के इन विट्रो संस्कृति प्रोटोकॉल, अच्छी गुणवत्ता वाले सुअर ओसाइट्स उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त है, क्योंकि इसे रूपात्मक और अल्ट्रास्ट्रक्चरल दोनों स्तरों पर प्रलेखित किया गया था। एक एल्गिनेट समाधान में फाइब्रिनोजेन की उपस्थिति और उनके एक साथ जेलिंग, एक इंटरपेनेटिंग नेटवर्क के गठन में परिणाम देता है जो त्रि-आयामी वातावरण को बनाता है और आगे स्थिर करता है। इस तरह के मैट्रिक्स के अंदर विशिष्ट संरचनात्मक समर्थन के कारण, ओसाइट्स और क्यूमुलस कोशिकाओं के बीच सेल-टू-सेल संपर्क और पैराक्रिन संचार को वीवो में मौजूद इन लोगों के समान बनाए रखा जाता है।

इस दस्तावेज़ में वर्णित परिपक्वता प्रोटोकॉल में दो सबसे महत्वपूर्ण कदम इनक्यूबेशन कक्षों से एफए कैप्सूल का 96-अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित करना है जिसमें एमएम (चरण 2.10)और शेष एल्गिनेट के एंजाइमेटिक गिरावट के बाद भंग कैप्सूल से COCs को हटाना, एल्गिनेट lyase (चरण 2.11.) का उपयोग करके। दोनों चरणों से बचने के लिए महत्वपूर्ण मैनुअल कौशल और परिशुद्धता की आवश्यकता होती है, पहले मामले में कैप्सूल का विनाश, दूसरे में - COCs को नुकसान।

इस विधि की मुख्य ताकत, एक बड़े घरेलू जानवर की ओसाइट परिपक्वता के लिए इष्टतम शर्तों को स्थापित करने के अलावा, यह है कि टेम, लाइट माइक्रोस्कोपी या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विश्लेषण के दौरान, कोई कैप्सूल हटाने की आवश्यकता नहीं है। इमेजिंग करते समय एल्गिनेट एक बाधा नहीं है। कैप्सूल में COCs छोड़ने धुंधला प्रक्रिया के दौरान हेरफेर की सुविधा।

यहां प्रस्तुत दूसरी सीओसी इन विट्रो संस्कृति एलएम के उपयोग के साथ एक है, जो आम तौर पर माइक्रो-स्केल्ड कणों द्वारा कवर की जाने वाली नॉनस्टिक बूंदें होती हैं और एक बहुत ही हाइड्रोफोबिक पाउडर47में तरल की छोटी मात्रा को रोलिंग करके प्राप्त होती हैं। संस्कृति के लिए एलएम के उपयोग के साथ पिछले अध्ययन, अन्य फाइब्रोब्लास्ट48,लाल रक्त कोशिकाओं49,ट्यूमर38के ऑर्गेनॉइड, अग्नाशय की कोशिकाएं50 या भेड़ ओसाइट्स36 बूंदों की तैयारी के लिए पॉलीटट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) का उपयोग करके किए गए हैं। PTFE व्यापक रूप से क्लिनिक में प्रयोग किया जाता है (जैसे, हृदय कलम) ।

इस काम में, हम पहली बार, पोर्सिन COCs की इन विट्रो संस्कृति के लिए एफईपी कणों से बने माइक्रोबायोरेक्टर्स के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रस्तुत करते हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में एफईपी का उपयोग, जो पीएफई के लिए संरचना और गुणों में बहुत समान है, एलएम की तैयारी को बहुत आसान बनाता है। यह पाउडर पीटीएफई की तुलना में नरम है और विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, यह पारदर्शी है। यह बदले में इसके उपयोग के साथ सुसंस्कृत संरचनाओं की इमेजिंग के दौरान काम को सरल बनाता है। FEP का उपयोग कर एलएम बनाने में आसानी इस विधि का एक निश्चित लाभ है।

इस दस्तावेज़ में वर्णित परिपक्वता प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम एक पिपेट टिप (चरण 3.3. और 3.4.) का उपयोग करके 60 मिमी आईवीएफ पेट्री डिश में गठित एलएम को उठा रहा है और स्थानांतरित कर रहा है। इन चरणों में एलएम के विनाश से बचने के लिए महत्वपूर्ण मैनुअल कौशल और सटीकता की आवश्यकता होती है।

संभवतः, यहां प्रस्तुत 3 डी ओसाइट परिपक्वता प्रेरण प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा एंटीबायोटिक दवाओं, एनाबोलिक स्टेरॉयड (यानी, नाड्रोलोन, बोल्डेनोन) या मेलेंजेस्ट्रॉल एसीटेट के साथ इलाज नहीं किए गए जानवरों से एकत्र उचित अनुसंधान सामग्री प्राप्त करने में अपेक्षाकृत बड़ी कठिनाई है जो उनके तेजी से विकास को बढ़ावा देती है। इन स्टेरॉयड, उनके उपयोग के बावजूद यूरोप में प्रतिबंध लगा दिया जा रहा है, अभी भी व्यापक रूप से मेद अवधि है, जो कारण बनता है, दूसरों के बीच, परेशान यौन परिपक्वता के पिछले दो महीनों के दौरान औद्योगिक पशुधन प्रजनन में उपयोग कर रहे हैं.

अंत में, यहां प्रस्तुत दोनों 3 डी सिस्टम विट्रो संस्कृति वातावरण में इष्टतम गैसीय बनाए रखते हैं। वे गैप जंक्शनों के अपने सपाट और परिणामी व्यवधान को रोककर COCs 3D संगठन को भी बनाए रखते हैं, इस प्रकार ओसाइट और आसपास की कूप कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक संबंध को संरक्षित करते हैं, जो उचित ओसाइट परिपक्वता के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, दोनों मॉडल प्रजनन जीव विज्ञान में बुनियादी अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान उपकरण हैं और नैदानिक प्रासंगिकता भी हो सकती है, जिससे बांझपन उपचार में सुधार हो सकता है। इसके अतिरिक्त, वे भी उपन्यास जैव प्रौद्योगिकी विधियों के विकास के लिए लागू किया जा सकता है, साथ ही पशुधन सुधार के लिए ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक बहुत आभारी हैं: टीईएम में तकनीकी सुविधाओं के लिए डॉ वाक्लॉ दोरजिडिलो (विकासात्मक जीव विज्ञान और अकशेरुकी आकृति विज्ञान विभाग, जूलॉजी और बायोमेडिकल रिसर्च संस्थान, जगीलोनियन विश्वविद्यालय); तकनीकी सहायता के लिए सुश्री बीटा स्नाकोवस्का (एंडोक्राइनोलॉजी विभाग, इंस्टीट्यूट ऑफ जूलॉजी एंड बायोमेडिकल रिसर्च, जगीलोनियन विश्वविद्यालय) के लिए; सेल बायोलॉजी एंड इमेजिंग विभाग, जूलॉजी एंड बायोमेडिकल रिसर्च संस्थान, जगीलोनियन विश्वविद्यालय, जेईओएल जेईएम 2100HT (JEOL, टोक्यो, जापान) के लिए। इस काम को नेशनल साइंस सेंटर पोलैंड से ग्रांट 2018/29/N/NZ9/00983 ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General
Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml Thermo Fisher 15240062 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)
DMEM/F12 (500ml) Sigma-Aldrich D8062 Handling and Maturation Medium
DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml Thermo Fisher 14190144
FCS (100 ml) Thermo Fisher 16140063 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)
PBS (1x, pH 7.4) 500ml Thermo Fisher 10010023
TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml Cayman Chemicals 600232 1x final concentration. Other brand can be use
Maturation Medium
hCG (1 VIAL of 10 000 U) Sigma-Aldrich CG10
PMSG BioVendor RP1782721000
Fibrin-alginate beads
Alginate Lyase Sigma-Aldrich A1603 (Step 2.11.1)
Thrombin Sigma-Aldrich T9326-150UN (Step 2.1)
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 (Step 2.1)
Fibrinogen (250mg) Sigma-Aldrich F3879 (Step 2.2)
Sodium Alginate Sigma-Aldrich W201502 (Step 2.3) use for alginate solution
Liquid Marble
FEP Dyneon GmbH 3M AdMD A-66670
Morphological examination
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fisher L3224 (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 mounting medium
Ultrastructure examination
Glutaraldehyde solution Sigma-Aldrich G5882 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)
LR White resin Sigma-Aldrich L9774 (Step 4.2.4.)
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 (Step 4.2.5.)
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich O5500 (Step 4.2.3.)
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250 Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)
Uranyl Acetate POCH 868540111 (Step 4.2.4.)
Specific instruments, tools
30 mm Pteri dish TPP 93040
60 mm IVF Petri dish Falcon 353653
Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor RI Life Sciences 8-72-288
Ez-Tip RI Life Sciences 8-72-4155/20
Heating Table SEMIC Other brands can be used
Incubator Panasonic MCO-170AIC-PE Other brands can be used
Sterile petri dish (10 cm) NEST Biotechnology 704002
Sterile syringe filters with 0.2 µm GOOGLAB SCIENTIFIC GB-30-022PES
Thermos Quechua 5602589 Other brands can be used

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References

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Gorczyca, G., Wartalski, K., Tabarowski, Z., Duda, M. Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation. J. Vis. Exp. (161), e61325, doi:10.3791/61325 (2020).

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