Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Протеолитически деградированных альгинат гидрогели и гидрофобных микробиореакторов для инкапсуляции порцина Ооцита

Published: July 30, 2020 doi: 10.3791/61325
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Endocrinology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University in Krakow, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College, 3Department of Experimental Hematology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University in Krakow

Summary

Здесь представлены два протокола инкапсуляции свиных яйцеклеток в условиях 3D культуры. Во-первых, кумулятивно-ооцитные комплексы (КОК) инкапсулируются фибрино-альгинатным бисером. Во втором, они заключены с фторированными частицами порошка этилена пропилена (микробиореакторы). Обе системы обеспечивают оптимальные условия для поддержания их 3D-организации.

Abstract

В репродуктивной биологии биотехнологическая революция, начатая с искусственного оплодотворения и технологии переноса эмбрионов, привела к разработке вспомогательных методов воспроизводства, таких как созревание яйцеклеток в пробирке (IVM), экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и клонирование домашних животных путем ядерной передачи из соматических клеток. IVM является методом, особенно значение. Это платформа технологии для поставок зрелых, хорошего качества яйцеклеток для таких приложений, как сокращение интервала генерации в коммерчески важных или находящихся под угрозой исчезновения видов, исследования, касающиеся воспроизводства человека в пробирке, и производство трансгенных животных для клеточной терапии. Термин oocyte качество включает в себя его компетенцию для завершения созревания, быть оплодотворены, тем самым в результате здорового потомства. Это означает, что яйцеклетки хорошего качества имеют первостепенное значение для успешного оплодотворения, включая процедуры ЭКО. Это создает много трудностей для разработки надежного метода культуры, который будет поддерживать рост не только человеческих яйцеклеток, но и других крупных видов млекопитающих. Первым шагом в IVM является культура in vitro яйцеклеток. В этой работе описаны два протокола для 3D-культуры свиных ооцитов. Во-первых, 3D-модель кумулятивно-ооцитных комплексов (COCs) инкапсулированы в фибрино-альгинатной сети между бисером, в которой смесь фибрина и альгината гелеобразуется одновременно. Во втором, COCs приостановлены в капле среднего и инкапсулируется с фторированным этилен пропиленом (FEP; кополимер гексафторопропилена и тетрафторэтилена) порошковых частиц для формирования микробиореакторов определяется как жидкие мраморы (LM). Обе 3D-системы поддерживают газоэкутную культурную среду in vitro. Они также поддерживают 3D-организацию COC, предотвращая их уплощение и последующее нарушение разрывных соединений, тем самым сохраняя функциональную связь между яйцеклеткой и окружающими фолликулярными клетками.

Introduction

Развитие различных культурных систем, в том числе трехмерных (3D), направлено на создание оптимальных условий для роста и созревания яйцеклеток, изолированных от фолликулов даже на самых ранних стадиях развития. Это имеет большое значение для вспомогательных репродуктивных методов (АРТ), особенно в связи с увеличением числа женщин, которые борются с бесплодием после лечения рака1. Созревание яйцеклеток в условиях in vitro (IVM) уже является устоявшейся техникой, в основном используемой для выработки эмбрионов in vitro с целью воспроизводстваскота 2. Однако, в большинстве видов млекопитающих, даже если высокие темпы созревания кумуляций-ооцитов комплексов (COCs) могут быть достигнуты (диапазон от 60 до 90 %)3, их компетенции в области развития по-прежнему недостаточно для нужд. Это связано с тем, что развитие зиготов, полученных таким образом, даже до стадии бластоцист низкой, а после передачи в суррогатных животных их жизнеспособность снижается. Следовательно, необходимо повысить компетентность в развитии эмбрионов, полученных из яйцеклеток, которые подверглись процедуре IVM4. Таким образом, новые средства созревания5 в настоящее время разработаны и различные периоды культуры in vitroпроверяются 6,7 наряду с добавкой культуры средств массовой информации с различнымифакторами роста и молекул 8,9.

Первым шагом любой полной системы IVM является создание оптимальных условий для устойчивого роста яйцеклеток во время культуры in vitro. Рост яйцеклеток является одним из специфических показателей способности яйцеклетки возобновить мейоз10,,11. Кроме того, соответствующая система культуры oocyte in vitro должна быть способна поддерживать ее ядерное созревание и цитоплазмическую дифференциацию12. Морфология кумулятивно-ооцитного комплекса является еще одним важным показателем, используемым в клиниках АРТ для выбора лучшего яйцеклетки для последующих шагов процедуры экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) улюдей и скота 12,13. Среди морфологических характеристик COCs рассмотрены: диаметр яйцеклетки, его цитоплазма гранулирования и первойполярной целостности тела 14,15. Кроме того, потенциал развития яйцеклеток коррелирует с появлением и уплотнением кучевых клеток и количества их слоев, окружающих яйцеклетку. Очень важным для соответствующей системы культуры oocyte in vitro также является поддержание клеток ооцита-кумула надлежащего взаимодействия ицитоскелет стабильности 16,17,18,19. До сих пор, в пробирке ооцитов роста в организме человека COCs былопродемонстрировано 20. Использование коровьих КОК также привело к живорождению. Они были изолированы от незрелых фолликулов яичников, а затем культурировали в течение 14 дней, пока яйцеклетка была достаточно большой, чтобы пройтипроцедуру ЭКО 21. Аналогичным образом, COCs изолированы от бабуина антралятивных фолликулов, подвергаются IVM после в пробирке культуры дали ооцитов, способных повторного мейоза на стадии метафазы II с нормальным появлением прядильнуюструктуру 22. Однако в этом исследовании авторы не пытались оплодотворить их. Тем не менее такие результаты свидетельствуют о том, что аналогичная процедура может быть применена не только к этим конкретным видам млекопитающих, но и к человеческим кумулятиво-ооцитным комплексам, полученным из фолликулов, что должно позволить получить яйцеклетки хорошего качества, подходящие для успешной техники ЭКО.

Вышеупомянутые описанные результаты были получены с применением обычных протоколов IVM, в ходе которых яйцеклетки были культуры в двумерных (2D) системах. Обычная процедура в системах 2D культуры охватывает яйцеклетки, погруженные в каплю соответствующих культурных средств массовой информации, сминеральным маслом 23,24. Предполагается, что наложение масла во время экстракорпорального ооцита культуры служит для предотвращения испарения жидкости, обеспечивая тем самым поддержание надлежащего рН и осмотического давления в культуре. Хотя такая система 2D культуры позволяет получить, даже до 87% зрелых свиней ооцитов25, было доказано, что наложение минерального масла вызывает существенное распространение липидных растворимых материалов, которые необходимы для надлежащего развития яйцеклеток26. Кроме того, из-за стероидов (прогестерона и эстрогенов) диффузии в минеральное масло во время культуры яйцеклеток наблюдалась задержка ядерного созревания и снижение компетентности в развитии свиноводных яйцеклеток. Это может привести к получению небольшого количества зиготов, которые дополнительно характеризуются низкой способностью развития к стадии бластоцист и плохой жизнеспособностью после передачи в реципиентживотных 27. Поэтому предпринимаются попытки повысить компетенцию эмбрионов в области развития, полученных из яйцеклеток, полученных после процедуры IVM, путем создания оптимальных условий для достижения как цитоплазмической, так и ядерной зрелости яйцеклеток, культурных вместе с ХК как комплексов, особенно с использованием трехмерных (3D) систем. Различные инновационные 3D в пробирке культуры системы были разработаны в течение последнихдвух десятилетий 28,29. Они были разработаны для поддержания естественной пространственной организации клеток и для того, чтобы избежать их уплощения в культурных блюдах, чего нельзя достичь в традиционных 2D культурах. Структурная и функциональная деятельность культурных COCs может быть обеспечена путем поддержания их надлежащей архитектуры и спокойной связи через разрыв-соединения между различнымиотсеками 30. Пригодность био-лесов для 3D-культуры в пробирке кумулятивно-ооцитных комплексов была оценена с использованием природных биоматериалов, таких как различные компоненты экстра-клеточной матрицы (ECM; коллаген и гиалуроноваякислота) 31 или инертных полимеров(альгинат) 32. Эти попытки, опробованные в нескольких видах, принесли многообещающие результаты с точки зрения возобновления мейозаяйцеклеток и достижения их полной компетентности 33,,34,,35. Однако до сих пор не было разработано 3D-системы, пригодной для созревания КОК, изолированной от крупных домашних животных, включая свиней.

В этой работе описаны два протокола, которые могут быть использованы для 3D культуры свиных COCs. Первый протокол описывает инкапсуляцию фибрино-альгинатных бусин (FAB). FAB может быть сформирован путем одновременного смешивания альгината и фибрина раствор, которые проходят синхронный процесс гелизации. Эта комбинация обеспечивает динамическую механическую среду, поскольку оба компонента способствуют жесткости матрицы. Аналогичное решение было использовано ранее для мыши яичников фолликула культуры и созревания36. В случае представленного протокола, чтобы избежать преждевременной деградации сети альгинат-фибрина, используются соответственно более высокие концентрации раствора хлорида кальция, обеспечивая быстрый и стабильный процесс гелеобразования. Динамическая механическая среда создает условия, аналогичные тем, которые находятся в естественной внутриясной среде, в которой находятся КОК, и увеличиваются в размерах. Кроме того, в работе показаны репрезентативные результаты систем 3D культуры COC, в которых они подвешены в капле среднего и инкапсулированы фторированным этиленовым пропиленом (FEP; кополимер гексафторопропилена и тетрафторэтилена) частицами порошка, чтобы сформировать микробиореакторы (жидкие мраморы, ЛМ). LM являются одной из форм 3D биореактора, которые ранее были показаны для поддержки, среди прочего,рост живых микроорганизмов 37, опухолевыхсфероидов 38 и эмбриональных стволовыхклеток 39. LMs также успешно используются для овцы ооцитов культуры40. В большинстве экспериментов с использованием LMs, биореакторы были подготовлены с использованием политетрафторэтилена (PTFE) порошковое ложе с размером частиц 1мкм 41. В представленном протоколе используется FEP, который очень похож по составу и свойствам на фторполимеры PTFE. Но FEP является более легко формируемым и мягче, чем PTFE и что особенно важно, это очень прозрачно.

Обе 3D-системы поддерживают газоэкутную культурную среду in vitro. Они также поддерживают 3D-организацию COCs, предотвращая их уплощение и последующее нарушение разрывных соединений, сохраняя их функциональную связь между яйцеклеткой и окружающими фолликулярными клетками.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Следующие процедуры были одобрены Комитетом по защите животных в Институте зоологии и биомедицинских исследований Ягеллонского университета.

1. Изоляция свиной кумулятивных ооцитов

  1. Для сбора материала для изоляции фолликулов яичников на местной скотобойне акцизные свиные яичники из препубертальных позолот (примерно 6-7 месяцев, весом от 70 до 80 кг). Выберите около 20 свиноводов из 10 животных для изоляции COCs в каждом эксперименте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагая, что каждый яичник дает 3-5 фолликулов, общее количество фолликулов колеблется от 60 до 100.
  2. Поместите яичники в термос со стерильным фосфатно-буферным солевым раствором (PBS; pH 7.4; 38 C), содержащим 1% AAS. Убедитесь, что экспериментальный материал транспортируется в лабораторию в течение 1 ч, где его дважды промывают стерильным PBS, содержащим антибиотики.
  3. После полоскания яичников, перенесите их в стакан, наполненный HM среды и хранить в инкубаторе при 38 градусов по Цельсию на время всех манипуляций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов при обработке яйцеклеток, выполнять все процедуры в DMEM/F12 среды (обработка среднего, HM) с добавлением 2,5% антибиотиков / антимикотических растворов (AAS) и 10% плода бычьей сыворотки (FBS) и контролировать рН на уровне CO2 в окружающей среде, на нагревательном столе с контролем температуры (38 С) и под ламинарным потоком, чтобы свести к минимуму бактериальное загрязнение.
  4. Из крупных свиных фолликулов (диаметром 6-8 мм) собирают фолликулярную жидкость (FF) x g путем аспирации и центрифугации при температуре 100 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого отфильтруйте супернатант с помощью стерильного шприца, прикрепленного к мембранным порным фильтрам 0,2 мкм, и заморозьте при -80 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инсулиновый шприц (u- 40) для аспирации фолликулярной жидкости.
  5. Убедитесь, что для изоляции COCs 42 отбираются только здоровые фолликулы среднего размера (4-6 мм вдиаметре).
    ПРИМЕЧАНИЕ: COCs I класса, обладающие нетронутыми и круглые яйцеклетки с однородной ооплазмы и многослойной (по крайней мере 3-4) компактный кучей считаются пригодными для дальнейшей 3D IVMпроцедуры 43.
  6. Чтобы изолировать КОК, перенесите 2-3 яичника в стерильную чашку Петри диаметром 10 см, наполненную HM. Изолируйте COCs от средних фолликулов, следуя одной из процедур ниже.
    1. Аккуратно вырежьте поверхность выступающих фолликулов яичников стерильным хирургическим лезвием 15C. Это приведет к фолликулярной жидкости вместе с COCs вытекать в чашку Петри.
    2. Аспирировать фолликулярное содержание с помощью 28 G иглы с размером 5/8 "прилагается к одноразовому шприцу и передать его в чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отбросьте остатки ткани яичников. Последующие этапы изоляции проводятся под стереомикроскопом.
  7. Приготовьте 3-5 60 мм блюда ЭКО Петри.
    1. Добавьте 1 мл HM в центральные скважины и поместите 3-4 капли HM (50 йл на каплю) в их внешних кольцах.
    2. Затем, используя поликарбонатный микропипют, переместите неповрежденные COCs на капли HM во внешних кольцах, чтобы промыть их кратко в течение 3-4 раз.
    3. В конце, индивидуально передать их в центральный колодец. Храните эти пластины ЭКО в инкубаторе для дальнейших процедур.
  8. После сбора COC выполните заключительный этап отбора, назначив их случайным образом в два разных протокола инкапсуляции IVM, перечисленных ниже.

2. Инкапсуляция в фибрино-альгинатных гидрогелевых бусинках

  1. Приготовьте 1 мл 50 МЕ/мл тромбина в трис-буферном солевом растворе (TBS; pH 7.4) со 100 мМ CaCl2 в стерильной микроцентрифугной трубке 2,0 мл.
  2. Приготовьте фибриногенный раствор (50 мг/мл в TBS) и держите его замороженным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать слипания при растворении фибриногена в TBS, нагревайте TBS до 37 градусов по Цельсию.
    1. В день процедуры оттаивать его медленно на льду и прямо перед использованием довести до комнатной температуры.
  3. Перед использованием смеси в соотношении 1:1 0,5% альгинат раствор и 50 мг/мл фибриногена решение, чтобы получить, наконец, 2 мл (FA). В стерильной микроцентрифуге трубки аккуратно вихрь смеси. Избегайте пузырей.
  4. Для подготовки "инкубационых камер" нанесите тонкие полоски парафиновых пленок на слайды стеклянного микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протрите слайды с 70% EtOH перед использованием. Одна инкубационая камера образуется с двумя слайдами. Чтобы отделить их, поместите на один из них 3 мм промемиры.
  5. Pipette 7.5 L капли смеси FA на этой парафиновой пленке покрытием стеклянная горка, которая также имеет разделяющие спейсеры. На одном слайде место 8-10 капель, расположенных в два ряда.
  6. Передача, с помощью микропипетта, 3-5 COCs вместе с минимальным объемом (до 5 МКЛ) среды созревания (ММ), и поместить их точно в центре падения FA. Эта процедура требует хороших ручных навыков и точности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда созревания (ММ) состоит из DMEM/F12, дополненной 10 МЕ/МЛ ПМСГ, 10 МЕ/мл ХГЧ, 10% FBS и 50% свиной фолликулярной жидкости (FF), собранной в шаге 1.4.
  7. Добавьте 7,5 мл раствора тромбина/ca2 на каждую каплю FA, чтобы покрыть их. Существует нет необходимости смешивать их, потому что гель образуется почти мгновенно.
  8. Обложка инкубационой камеры, применяя второй, ранее подготовленный стеклянный слайд в капсулы FA. С очень осторожным, но твердым движением, поверните камеру вверх дном и поместите его в 100 мм чашку Петри выложены влажной фильтровальной бумагой, чтобы избежать высыхания.
  9. Затем перенесите чашку Петри в инкубатор 5% CO2 (38 градусов по Цельсию) примерно на 5-7 мин. После этого капсулы FA станут облачными из-за одновременного гелеобразования фибрина и альгината.
  10. Передача капсул ФА в 96 пластин (одна капсула на колодец), содержащих 100 МКЛ ММ на колодец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы не повредить сформированные капсулы FA, выполните этот шаг осторожно с использованием хирургических типсов.
  11. Каждые 2 дня заменяют половину ММ (50 КЛ) свежей, предварительно равнорассмысленой. Изображение COCs с помощью перевернутого светового микроскопа (при увеличении в 10 раз).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культурные условия для культуры COCs FA: 38 градусов по Цельсию, под 5% CO2 атмосферы и относительная влажность 95%. После 4 дней IVM, гидрогели появляются почти ясно из-за прогрессивной деградации компонента фибрина. Оставшийся альгинат следует деградировать ферментативно - альгинат-лиазой, ферментом растительного происхождения, который специально деградирует альгинат и не влияет на клетки животных.
    1. Удалите ММ из колодцев, содержащих капсулы, и добавьте 100 МЛ из 10 МЕ/мл альгинатной лиазы в DMEM. Оставьте культурную тарелку в инкубаторе на 25-30 мин.
    2. Удалите COC из растворенных капсул.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть сделано с разрезом пипетки отзыв.
    3. После нескольких моет в свежем DMEM, передача COCs на внутреннее кольцо блюдо ЭКО (5-10 COCs на блюдо), содержащий PBS. Теперь используйте их для дальнейшего морфологического или биохимического анализа.

3. Инкапсуляция при супергидрофобных фторированных микробиоректорах этиленового пропилена (ФЕП).

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все процедуры IVM проводятся на термостатически контролируемой таблице и COCs поддерживаются на уровне 38 градусов по Цельсию на протяжении всей их обработки.

  1. Приготовьте 30-мм чашку Петри, содержащую 5 г порошка FEP размером 1 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать свежий порошок FEP. Повторно используемый FEP имеет тенденцию к агрегированию и образует сгустки.
  2. Распределив одну каплю ММ (объемом 30 мкл), содержащую 3-5 КОК, изолированных в шаге 1,6 на кровать порошка FEP. Поверните пластину мягко круговыми движениями, чтобы убедиться, что эти частицы полностью покрыли поверхность жидкой капли и жидких шариков, образовавахся (LM).
  3. Возьмите сформированный LM с помощью пипетки с наконечником 1000 л.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезать кончик пипетки на краю, чтобы разместить его в диаметре LM (4-5 мм). Ориентировочный диаметр такого подготовленного наконечника должен быть немного больше, чем у ЛМ.
  4. Приготовьте несколько 60 мм блюд ЭКО Петри. Добавьте 3-4 мл стерильной воды во внешние кольца для подготовки камеры влажности. Далее поместите один LM в центральный колодец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура требует хороших ручных навыков и точности - если мрамор находится небрежно или падает даже с низкой высоты он будет уничтожен.
  5. Инкубировать шарики в течение 4 дней при 38 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатора.
    1. Изменение среды ежедневно после процедуры: применить 30 МКЛ ММ на каждом LM, что приведет к их распространению, потому что прямой контакт жидкости нарушает гидрофобность покрытых порошков FEP. Когда содержание мрамора растворится, перенесите COC, выпущенные из биореактора, в каплю свежего ММ в чашке Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для точной передачи выпущенных COCs, используйте поликарбонатный микропипют.
    2. После нескольких моет в ММ (3-4 раза), чтобы удалить частицы FEP, передать их с 30 мл свежего ММ на порошковую кровать FEP. Аккуратно поверните пластину круговыми движениями, чтобы частицы порошка полностью покрыли поверхность жидкой капли и образуют новый LM.
    3. Затем следуйте процедуре из шагов 3.3-3.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прозрачное покрытие порошка FEP позволяет контролировать содержание LM с помощью светового микроскопа.

4. Характеристика КОК после процедуры 96-h IVM с использованием двух 3D-систем

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить эффективность используемых систем IVM, оценка COCs морфологически под световым микроскопом. Кроме того, используйте двойную флуоресцентную маркировку красителями calcein AM и ethidium homodimer (EthD-1) для анализажизнеспособности COCs 44.

  1. Морфологическое исследование яйцеклеток после ИВМ с помощью световой и флуоресцентной микроскопии.
    1. Вымойте COCs (как те, которые получены из культуры с использованием FAB и те из LM) с 38 КК 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения обработки COCs и не повредить их во время процедуры окрашивания, используйте 96 или 48 пластины и выполнять каждый шаг окрашивания путем передачи COCs в последующие скважины.
    2. Инкубировать их в 100 МКЛ 1,6 мм кальциин AM и 5,5 мМ ЭтД-1 в течение 30-45 мин при 37 градусов по Цельсию. Разбавить оба вещества в 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что это двухцветный анализ флуоресценции, выполнить этот шаг в темноте.
    3. После инкубации, мыть COC дважды в PBS, а затем погрузить его в антифад монтаж среды, предназначенные для предотвращения быстрого фотоотбела флуоресцентных белков и флуоресцентныхкрасителей( Таблица материалов ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите края крышки стекла от высыхания с любым лаком для ногтей.
    4. Визуализуйте окрашенные образцы под конфокальный лазерный сканирующий микроскоп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для возбуждения флуоресценции обоих зондов (т.е. кальцина и этидия гомодимер-1, EthD-1) настроить аргоновый лазер до 488 нм. Испускаемая флуоресценция отделяется тройным дихроическим фильтром 488/561/633, а затем измеряется на уровне 505–570 нм для зеленого (кальцеин) и 630–750 нм для красного (EthD-1).
    5. Классифицировать COCs на четыре категории, используя модифицированную классификацию, которая применяется к фолликулам яичников в культуре на основе конфокальных изображений флуоресценции в зависимости от процента мертвыхклеток гранулоза 35.  V1: COC с оценочными 100% жизнеспособными CCs; V2: COCs с 10% мертвых CCs; V3: COCs с 10-50% мертвых CCs; V4: COCs с 50% мертвых CCs.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Технически, трудно оценить жизнеспособность яйцеклетки с живым мертвым анализом; поэтому его следует оценить, например, путем анализа митохондриальной ультраструктуры или активности.
  2. Изучение ультраструктуры яйцеклеток после IVM путем передачи электронной микроскопии.
    1. Исправить COCs в 100 йл 2,5% глутаралдегид в 0,1 М буфера какодилата натрия (рН 7,2, комнатная температура) на 2 ч.
    2. Погрузите COCs в буфер какодилат натрия 100 МКл 0,1 М (ночь при 4 градусов по Цельсию) и смойте в том же буфере.
    3. Postfix COCs с 1% осмия тетроксида в 0,1 М натрия какодилат буфера (комнатная температура) в течение 1 ч.
    4. После окрашивания в уранил ацетат (1%), обезвоживание COCs в увеличение серии этанола разбавления (50%, 60%, 70%, 90% и 100%), проникнуть их на ночь при комнатной температуре, а затем два коротких изменений смолы и, наконец, вставлять их в LR Белый.
    5. Далее, чтобы сориентировать и оценить образцы, пятно полутонкие секции (1 мкм) с метиленовым синим / azure II.
    6. Наконец, изучить ультратонкий, вдвойне окрашенные разделы на ультраструктурном уровне с TEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В COCs, использующих обе системы IVM, клетки гранулоза плотно прилипли друг к другу, и большинство восстановленных COCs имели нетронутые слои кучевых клеток(рисунок 1A,B). Кроме того, была сохранена значительная доля кучевых клеток.

Результаты анализа жизнеспособности COCs подтвердили, что обе системы, применяемые для инкапсуляции свиных яйцеклеток в 3D условиях in vitro, обеспечили оптимальные условияроста (рисунок 2). В обеих группах наблюдались только высокожизнеспособность яйцеклеток, V1 - 13%, V2 - 87% для FAB и 10% V1 и 90% V2 для LM, соответственно (Таблица 1).

Митохондрии, наблюдаемые трансмиссионной электронной микроскопией (TEM), равномерно распределялись в яйцеклетках, их форма после IVM была оболочкой,как 45. Лишь немногие из них были вытянуты, более того, их кластеризация периодически наблюдалась(рисунок 1C,D). Наблюдалась эндоплазмическая ритикулум, либо связанная с митохондриями, либо свободная в цитоплазме яйцеклеток. Липидные капли появились как небольшие темные круглые структуры и golgi аппарат были возникли с расширенными цистернами (Рисунок 1C,D).

V1 V2 V3 V4
% Номер % Номер % Номер %
Потрясающий 13% 7 87% 48 - -
Lm 10% 9 90% 80 - -
Общее число COCs: 144 16а 128б 0 0

Таблица 1. Результаты по жизнеспособности КОК после инкапсуляции с использованием фибрино-альгинатных бусин (FAB) и микробиореакторов FEP, liquid Marbles (LM). Результаты были даны как средние. Значения с суперскриптами (a, b) значительно отличались (p lt;0.05).

Figure 1
Рисунок 1: Репрезентативные изображения, показывающие морфологию и ультраструктуру КОК после 96 ч инкапсуляции. (A)морфология COCs внутри FAB - световая микроскопия; (B)морфология COCs внутри LM - световая микроскопия; C: ультраструктура oocyte (TEM) после культуры in vitro внутри FAB; D: Ооцит ультраструктуры (TEM) после в пробирке культуры внутри LM. O: яйцеклетка; CCs: кучевые клетки; ЗП: Зона Пеллусия; N: ядро; М: митохондрии; G: Аппарат Голги; ER: эндоплазмический цитикулум; Lp: липидная капля; FA: альгинат и нити фибрина; FEP: порошок кополимера гексафторопропилена и тетрафторэтилена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Представитель флуоресцентные изображения COCs после 96 ч инкапсуляции. (A,B) Изображения, полученные для тех же COCs после культуры in vitro с использованием FAB с двумя фильтрами для визуализации зеленой флуоресценции или красной флуоресценции для живых илимертвых клетоксоответственно и ( C ) слияние обоих. (D,E) Изображения, полученные для тех же COCs после культуры in vitro с использованием LM с двумя фильтрами, чтобы визуализировать зеленую флуоресценцию или красную флуоресценцию для живых илимертвых клеток,соответственно и ( F ) слияние их. Шкала баров 50 мкм. Белые звездочки указывают на клетки, перенеся апоптоз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Способность поддерживать рост в пробирке не только яйцеклетки, но и кучевых клеток, окружающих его и одновременно поддерживая его созревание, чрезвычайно важна для успешных вспомогательных репродуктивных технологий и для содействия пониманию взаимодействия соматических клеток/ооцитов, особенно у видов, переживающих длительный фолликулярный рост, таких как человеческие существа или свиньи. Постоянно совершенствуемые методы IVM становятся полезным инструментом для сохранения репродуктивных вариантов в случаях синдрома поликистозных яичников (СПКЯ), преждевременной недостаточности яичников или окончательного бесплодия (онкотерапия). Кроме того, поскольку некоторые дисфункции яичников могут быть вызваны дисрегулируемого фолликулярного роста, понимание молекулярных и клеточных механизмов, которые контролируют надлежащее развитие яйцеклетки может обеспечить важное понимание патофизиологии и рационального лечения этих условий. Системы культуры in vitro, которые будут поддерживать обслуживание архитектуры COCs 3D во время IVM, требуют шага инкапсуляции в матрице или внутри биореактора. Эта работа описывает протокол, который может быть применен для культуры свиней яйцеклеток. Обе 3D-системы культуры in vitro, представленные здесь, чтобы стимулировать рост и развитие свиных COCs являются удобными для пользователя и позволяют эффективно контролировать выживание как ооцитов, так и кучевых клеток.

Первый метод культуры in vitro COCs, использующий их инкапсуляцию в фибрино-альгинатных гидрогелевых бусинах (FAB), представленный здесь, позволяет проводить 3D-рост яйцеклеток в активно реагирующей на клетки матричной среде. Ранее опубликованные протоколы на основе альгинатных гидрогелей обычно использовались для исследования развития фолликулов яичников, изолированных от многочисленных видов животных с очень многообещающимирезультатами 32. Интересно, что независимо от окончательного состава альгината гидрогеля32 или инкапсуляциисам 46, эти исследования показали, что альгинат бисером на основе 3D-культуры системы были в состоянии поддерживать фолликулярный рост и их выживание.

Альгинатные гидрогели были мягкими на фолликулах, не влияя на их дальнейшее выживание или развитие в пробирке. Аналогичным образом, протокол культуры in vitro COCs, описанный впервые здесь, подходит для создания высококачественных свиных яйцеклеток, как это было задокументировано как на морфологическом, так и на ультраструктуральном уровнях. Наличие фибриногена в альгинатном растворе и их одновременное гелеобразование приводит к образованию межпенетарной сети, которая создает и еще больше стабилизирует трехмерную среду. Благодаря специфической структурной поддержке внутри такой матрицы, контакты между клетками и паракринной связью между ооцитами и кучевными клетками поддерживаются аналогично присутствующим in vivo.

Двумя наиболее важными шагами в протоколе созревания, описанных в этом документе, являются передача капсул ФА из инкубационные камеры в 96-колодец пластин, содержащих ММ (шаг 2.10.) и удаление COCs из растворенных капсул после энзиматической деградации оставшегося альгината, используя альгинат лиазы (шаг 2.11.). Оба шага требуют значительных ручных навыков и точности, чтобы избежать, в первом случае уничтожения капсул, во втором - повреждения КОК.

Основная сила этого метода, помимо создания оптимальных условий для созревания яйцеклеток крупного домашнего животного, заключается в том, что при анализе с использованием ТЕМ, световой микроскопии или конфокаляций не требуется удаление капсул. Альгинат не является барьером при визуализации. Оставляя COCs в капсулах облегчает манипуляции во время процедуры окрашивания.

Второй COC в пробирке культуры представлены здесь является одним с использованием LM, которые, как правило, антипригарные капли, покрытые микро-масштабируемых частиц и полученные путем просто прокатки небольших объемов жидкости в очень гидрофобныхпорошок 47. Предыдущие исследования с использованием LM для культуры, среди прочего фибробласты48,эритроциты 49, органоидопухоли 38, поджелудочнойжелезы клетки 50 илиовец ооцитов 36 были выполнены с использованием политетрафторэтилена (PTFE) в качестве гидрофобного полимера для подготовки капель. PTFE широко используется в клинике (например, сердечно-сосудистые трансплантаты).

В этой работе мы впервые представляем надежный метод микробиореакторов из частиц FEP для экстракорпоральной культуры свиных КОК. Использование FEP в представленном протоколе, который очень похож по составу и свойствам на PTFE, значительно упрощает подготовку ЛМ. Этот порошок мягче, чем PTFE и что особенно важно, он прозрачный. Это, в свою очередь, упрощает работу при визуализации структур, культурных с ее использованием. Легкость формирования LM с помощью FEP является определенным преимуществом этого метода.

Наиболее важным шагом в протоколе созревания, описанном в этом документе, является собирание и передача сформированного LM в 60-мм чашку IVF Petri с помощью наконечника пипетки (шаги 3.3. и 3.4.). Эти шаги требуют значительных ручных навыков и точности, чтобы избежать уничтожения LM.

Возможно, основным ограничением 3D протоколов индукции яйцеклеток, представленных здесь, является относительно большая трудность в получении надлежащего исследовательского материала, собранного у животных, не обработанных антибиотиками, анаболическими стероидами (т.е. надролоном, болденоном) или меленгетрол ацетатом, которые способствуют их быстрому росту. Эти стероиды, несмотря на их использование запрещено в Европе, по-прежнему широко используются в промышленном животноводстве в течение последних двух месяцев периода откорма, который вызывает, среди прочего, нарушается полового созревания.

В заключение, обе 3D-системы, представленные здесь, поддерживают оптимальную газоэкутную культурную среду in vitro. Они также поддерживают COCs 3D организации, предотвращая их уплощение и последующее нарушение разрыва соединений, тем самым сохраняя функциональную связь между яйцеклетки, и окружающие фолликулярные клетки, что имеет решающее значение для надлежащего созревания яйцеклеток. Таким образом, обе модели являются ценным инструментом для фундаментальных исследований в области репродуктивной биологии, а также могут иметь клиническую значимость, что приводит к улучшению лечения бесплодия. Кроме того, они могут также применяться для разработки новых биотехнологических методов, а также для улучшения животноводства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы очень благодарны: д-р Вацлав Tworzydlo (департамент биологии развития и беспозвоночных морфологии, Институт зоологии и биомедицинских исследований, Ягеллонский университет) для технических объектов в ТЕМ; г-же Беатой Снаковской (департамент эндокринологии, Институт зоологии и биомедицинских исследований Ягеллонского университета) за техническую помощь; на кафедру клеточной биологии и визуализации, Институт зоологии и биомедицинских исследований, Ягеллонский университет, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Токио, Япония). Эта работа была поддержана грантом 2018/29/N/N'9/00983 от Национального научного центра Польши.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General
Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml Thermo Fisher 15240062 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)
DMEM/F12 (500ml) Sigma-Aldrich D8062 Handling and Maturation Medium
DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml Thermo Fisher 14190144
FCS (100 ml) Thermo Fisher 16140063 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)
PBS (1x, pH 7.4) 500ml Thermo Fisher 10010023
TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml Cayman Chemicals 600232 1x final concentration. Other brand can be use
Maturation Medium
hCG (1 VIAL of 10 000 U) Sigma-Aldrich CG10
PMSG BioVendor RP1782721000
Fibrin-alginate beads
Alginate Lyase Sigma-Aldrich A1603 (Step 2.11.1)
Thrombin Sigma-Aldrich T9326-150UN (Step 2.1)
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 (Step 2.1)
Fibrinogen (250mg) Sigma-Aldrich F3879 (Step 2.2)
Sodium Alginate Sigma-Aldrich W201502 (Step 2.3) use for alginate solution
Liquid Marble
FEP Dyneon GmbH 3M AdMD A-66670
Morphological examination
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fisher L3224 (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 mounting medium
Ultrastructure examination
Glutaraldehyde solution Sigma-Aldrich G5882 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)
LR White resin Sigma-Aldrich L9774 (Step 4.2.4.)
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 (Step 4.2.5.)
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich O5500 (Step 4.2.3.)
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250 Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)
Uranyl Acetate POCH 868540111 (Step 4.2.4.)
Specific instruments, tools
30 mm Pteri dish TPP 93040
60 mm IVF Petri dish Falcon 353653
Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor RI Life Sciences 8-72-288
Ez-Tip RI Life Sciences 8-72-4155/20
Heating Table SEMIC Other brands can be used
Incubator Panasonic MCO-170AIC-PE Other brands can be used
Sterile petri dish (10 cm) NEST Biotechnology 704002
Sterile syringe filters with 0.2 µm GOOGLAB SCIENTIFIC GB-30-022PES
Thermos Quechua 5602589 Other brands can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
  2. Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
  3. Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
  4. Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
  5. Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
  6. You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
  7. Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
  8. Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
  9. Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
  10. Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
  11. Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
  12. Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
  13. de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
  14. Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
  15. Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
  16. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
  17. Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
  18. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  19. Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
  20. Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
  21. Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
  22. Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
  23. Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
  24. Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
  25. Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
  26. Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
  27. Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
  28. Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
  29. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
  30. Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
  31. Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
  32. Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
  33. Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
  34. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  35. Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
  36. Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
  37. Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
  38. Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
  39. Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
  40. Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  41. Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
  42. Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
  43. Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
  44. Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
  45. Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
  46. Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
  47. Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
  48. Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
  49. Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
  50. Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 161 кумуляции-ооцитов комплексов 3D инкапсуляция альгинат микробиореакторы FEP
Протеолитически деградированных альгинат гидрогели и гидрофобных микробиореакторов для инкапсуляции порцина Ооцита
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gorczyca, G., Wartalski, K.,… More

Gorczyca, G., Wartalski, K., Tabarowski, Z., Duda, M. Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation. J. Vis. Exp. (161), e61325, doi:10.3791/61325 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter