Summary
Præsenteret her er to protokoller for indkapsling af svin oocytter i 3D-kultur betingelser. I den første er cumulus-oocyt komplekser (P-piller) indkapslet i fibrin-alginat perler. I den anden, de er omgivet af fluorerede ethylen propylen pulverpartikler (mikrobioreaktorer). Begge systemer sikrer optimale betingelser for at opretholde deres 3D-organisation.
Abstract
Inden for reproduktiv biologi førte den bioteknologiske revolution, der begyndte med kunstig befrugtning og embryooverførselsteknologi, til udvikling af assisterede reproduktionsteknikker såsom oocyt in vitromodning (IVM), in vitro-befrugtning (IVF) og kloning af husdyr ved nuklear overførsel fra somatiske celler. IVM er den metode, der er særlig vigtig. Det er platformteknologien til levering af modne oocytter af god kvalitet til anvendelser såsom reduktion af produktionsintervallet i kommercielt vigtige eller truede arter, forskning i in vitro-menneskelig reproduktion og produktion af transgene dyr til cellebehandlinger. Udtrykket oocyt kvalitet omfatter sin kompetence til at fuldføre modning, befrugtes, og dermed resulterer i sunde afkom. Det betyder, at oocytter af god kvalitet er altafgørende for vellykket befrugtning, herunder IVF procedurer. Dette giver mange vanskeligheder med at udvikle en pålidelig kulturmetode, der vil understøtte væksten ikke kun af menneskelige oocytter, men også af andre store pattedyrarter. Det første skridt i IVM er in vitro kultur oocytter. Dette værk beskriver to protokoller for 3D-kulturen af svin oocytter. I den første er 3D-model cumulus-oocyt komplekser (COC'er) indkapslet i en fibrin-alginat perle interpenetrating netværk, hvor en blanding af fibrin og alginat er geleret samtidigt. I den anden suspenderes p-piller i en dråbe medium og indkapslet med fluorholdige ethylenprokylen (FEP; en copolymer af hexafluoropropylen og tetrafluorethylen) pulverpartikler til mikrobioreaktorer defineret som flydende kugler (LM). Begge 3D-systemer opretholder det gasformige in vitro-kulturmiljø. De opretholder også COCs 3D-organisationen ved at forhindre, at de udfladning og deraf følgende afbrydelse af mellemrumskryds bevares, hvorved det funktionelle forhold mellem oocyt og de omkringliggende follikulære celler bevares.
Introduction
Udviklingen af forskellige kultursystemer, herunder tredimensionelle (3D) dem, har til formål at give optimale betingelser for vækst og modning af oocytter isoleret fra folliklerne selv i de tidligste stadier af udviklingen. Dette er af stor betydning for assisterede reproduktive teknikker (ART), især i betragtning af det stigende antal kvinder, der kæmper med barnløshed efter kræftbehandling1. Modning af oocytter under in vitro-forhold (IVM) er allerede en veletableret teknik, der hovedsagelig anvendes til in vitro embryo produktion med henblik på husdyrreproduktion2. I de fleste pattedyrsarter kan der imidlertid opnås en høj modning af cumulus-oocytkomplekser (COC) (interval 60-90 %)3, men deres udviklingskompetence er stadig utilstrækkelig i forhold til behovene. Dette skyldes, at udviklingen af zygotes opnået på en sådan måde, selv op til blastocyst fase er lav, og efter overførslen til surrogat dyr deres levedygtighed til sigt er reduceret. Der er derfor behov for at øge udviklingskompetencen for embryoner fra oocytter, der blev underkastet IVM-proceduren4. Derfor er nye modning medier5 ved at blive udtænkt og forskellige perioder med in vitro kultur ertestet 6,7 sammen med tilskud af kultur medier med forskellige vækstfaktorer ogmolekyler 8,9.
Det første skridt i ethvert komplet IVM-system er at skabe optimale betingelser for bæredygtig vækst af oocytter under in vitro-kultur. Den oocyte vækst er en af de specifikke indikatorer for oocyt evne til at genoptage meiose10,11. Desuden skal et passende oocyt in vitro-kultursystem kunne understøtte dets nukleare modning og cytoplasmatisk differentiering12. Morfologien af cumulus-oocyt kompleks er en anden vigtig indikator, der anvendes i ART klinikker til at vælge den bedste oocyt for efterfølgende trin i in vitro befrugtning (IVF) procedure hos mennesker og husdyr12,13. Blandt de morfologiske egenskaber ved de behandlede p-pc'er er: oocytdiameteren, dens cytoplasmagranulation og den første polarkropintegritet14,15. Udover, oocyte udviklingspotentiale er korreleret med udseende og komprimering af cumulus celler og antallet af deres lag omkring oocyt. Meget vigtigt for passende oocyt in vitro kultur system er også vedligeholdelse af oocyt-cumulus celler korrekt interaktioner og cytoskeleton stabilitet16,17,18,19. Hidtil har in vitro oocyt vækst inden for menneskelige p-piller blevet påvist20. Brugen af ko-p-piller resulterede også i levendefødte. Disse blev isoleret fra umodne æggestokkene follikler og derefter dyrket i 14 dage, indtil oocyt var tilstrækkelig stor til at gennemgå IVF procedure21. Tilsvarende p-piller isoleret fra bavian antral follikler, udsat for IVM efter in vitro kultur gav oocytter stand til at reinitiere meiose til metafase II fase med en normal vises spindel struktur22. Men i denne undersøgelse forfatterne ikke forsøge at befrugte dem. Ikke desto mindre tyder sådanne resultater på, at en lignende procedure ikke kun kan anvendes på disse særlige pattedyrarter, men også på humane cumulus-oocytkomplekser, der er fremstillet af follikler, hvad der bør gøre det muligt at opnå oocytter af god kvalitet, der er egnet til en vellykket IVF-teknik.
De ovenfor beskrevne resultater blev opnået ved anvendelse af konventionelle IVM-protokoller, hvor oocytter blev dyrket i todimensionale (2D) systemer. Den rutinemæssige procedure i 2D-kultursystemer dækker oocytter, nedsænket i en dråbe af en passende kultur medier, med mineralsk olie23,24. Det antages, at en olieoverlejring under in vitro oocyt kultur tjener til at forhindre flydende fordampning, og dermed sikre opretholdelsen af korrekt pH og osmotisk tryk i kulturen. Selv om et sådant 2D-kultursystem gør det muligt at opnå, selv op til 87% af modne gris oocytter25, er det blevet bevist, at mineralolie overlay forårsager betydelig diffusion af lipidopløselige materialer, som er nødvendige for korrekt oocytter udvikling26. Derudover, på grund af steroider (progesteron og østrogener) diffusion i mineralolie under oocyt kultur, en forsinkelse af nuklear modning og reduktion i udviklingsmæssige kompetence opnåelse af svin oocytter blev observeret. Dette kan resultere i, at der opnås et lille antal zygotes, som desuden er kendetegnet ved lav udviklingskapacitet til blastocyst-fasen og af dårlig levedygtighed efter overførsel til recipientdyr27. Der gøres derfor forsøg på at øge udviklingskompetencen hos embryoner, der stammer fra oocytter, der modtages efter IVM-proceduren, ved at skabe optimale betingelser for at opnå både cytoplasmatisk og nuklear modenhed af oocytter, der dyrkes sammen med CC'er som komplekser, især ved hjælp af tredimensionale (3D) systemer. Der er i de sidste to årtier udviklet forskellige innovative 3D in vitro-kultursystemer28,29. Disse var designet til at opretholde den naturlige rumlige organisering af celler og for at undgå deres udfladning i kulturretter, hvad der ikke kan opnås i de traditionelle 2D-kulturer. De dyrkede p-pillers strukturelle og funktionelle aktivitet kan sikres ved at opretholde deres korrekte arkitektur og uforstyrret kommunikation gennem mellemrumskryds mellem forskelligerum 30. Egnetheden af bio-stilladser til 3D in vitro kultur cumulus-oocyt komplekser er blevet evalueret ved hjælp af naturlige biomaterialer såsom forskellige komponenter i den ekstra-cellulære matrix (ECM; kollagen og hyaluronsyre)31 eller inaktive polymerer (alginat)32. Disse forsøg, der blev testet i flere arter , gav lovende resultater med hensyn til genoptagelse af meiose oocyt meiose og opnåelse af deres fuldekompetence 33,34,35. Indtil videre er der imidlertid ikke udviklet noget 3D-system, der er egnet til modning af p-piller, der er isoleret fra store husdyr, herunder svin.
Dette arbejde beskriver to protokoller, der kan bruges til 3D-kulturen i svine-p-piller. Den første protokol beskriver indkapsling i fibrin-alginat perler (FAB). FAB kan dannes ved samtidig blanding af en alginat- og fibrinopløsning, som gennemgår en synkron geleringsproces. Denne kombination giver et dynamisk mekanisk miljø, fordi begge komponenter bidrager til matrix stivhed. En lignende opløsning har tidligere været anvendt til mus ovariesækken kultur og modning36. For så vidt angår den præsenterede protokol anvendes passende højere koncentrationer af calciumchloridopløsning for at undgå for tidlig nedbrydning af alginat-fibrinnettet, hvilket sikrer en hurtig og stabil geleringsproces. Det dynamiske mekaniske miljø skaber betingelser svarende til disse i det naturlige intrasækkulære miljø, hvor p-piller bor og øger størrelsen. Derudover viser arbejdet repræsentative resultater af COCs 3D-kultursystemer, hvor disse er suspenderet i en dråbe medium og indkapslet med fluorholdige ethylen propylen (FEP; en copolymer af hexafluoropropylen og tetrafluorethylen) pulverpartikler, til at danne mikrobioreaktorer (Flydende kugler, LM). LM er en form for 3D bioreaktor, der tidligere har vist sig at støtte, blandt andre, vækst af levende mikroorganismer37, tumor sfæroider38 og embryonale stamceller39. LMs er også med succes blevet brugt til får oocyt kultur40. I de fleste forsøg med FLYDENDE blev bioreaktorer fremstillet ved hjælp af polytetrafluorethylen (PTFE) pulverseng med partikelstørrelse på 1 μm41. Den præsenterede protokol bruger FEP, som er meget ens i sammensætning og egenskaber til fluorpolymerer PTFE. Men FEP er lettere formbar og blødere end PTFE, og hvad der er særligt vigtigt, det er meget gennemsigtig.
Begge 3D-systemer opretholder det gasformige in vitro-kulturmiljø. De opretholder også COCs 3D-organisationen ved at forhindre deres udfladning og deraf følgende afbrydelse af mellemrumskryds, bevare deres funktionelle forhold mellem oocyt og de omkringliggende follikulære celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende procedurer blev godkendt af Dyrevelfærdsudvalget ved Institut for Zoologi og Biomedicinsk Forskning ved Jagiellonian University.
1. Isolering af porcine cumulus-oocyt komplekser
- At indsamle materiale til isolering af ovariefoske, punktøre æggestokke fra præpubertale gylte (ca. 6-7 måneder, vejer 70 til 80 kg) på et lokalt slagteri. Vælg ca. 20 svine æggestokke fra 10 dyr til COCs isolation i hvert forsøg.
BEMÆRK: Hvis man antager, at hver æggesting giver 3-5 follikler, varierer det samlede antal follikler fra 60 til 100. - Æggestokkene i en termokande med sterilt fosfat-bufferet saltvand (PBS; pH 7.4; 38 °C) indeholdende 1% AAS. Sørg for, at forsøgsmaterialet transporteres til laboratoriet inden for 1 time, hvor det skylles to gange med steril PBS indeholdende antibiotika.
- Efter skylning af æggestokkene overføres de til bægerglasset fyldt med HM-mediet og opbevares i en inkubator ved 38 °C for alle manipulationer.
BEMÆRK: For optimale resultater under håndtering af oocyt, udføres alle procedurer i DMEM/F12 medium (håndteringsmedium, HM) med tilsætning af 2,5 % antibiotikum/antimykotisk opløsning (AAS) og 10 % føtalt kvægserum (FBS) og kontroller pH-prisen ved CO2-niveauet i miljøet, på et varmebord med temperaturkontrol (38 °C) og under laminarhætten for at minimere bakterienedledning. - Fra store svinesække (6-8 mm i diameter) indsamle follikulært væske (FF) ved aspiration og centrifugering ved 100 x g i 10 min ved stuetemperatur. Derefter filtreres supernatanten ved hjælp af steril sprøjte fastgjort til 0,2 μm membran pore filtre og snap fryse ved -80 ° C.
BEMÆRK: Brug en insulinsprøjte (u- 40) til aspiration af follikulært væske. - Sørg for, at kun sunde, mellemstore follikler (4-6 mm i diameter) er udvalgt til COCs isolation42.
BEMÆRK: P-piller i klasse I, der besidder en intakt og rund oocyt med homogene ooplasm og flerlagede (mindst 3-4) kompakte cumulus anses for egnet til yderligere 3D IVM procedure43. - For at isolere p-piller skal du overføre 2-3 æggestokke til en steril petriskål med en diameter på 10 cm fyldt med HM. Iso-pc'er fra mellemstore follikler ved at følge en af nedenstående procedurer.
- Skær forsigtigt overfladen af de fremspringende ovariesækkler med en steril kirurgisk klinge 15C. Dette vil få follikulært væske sammen med p-piller til at flyde ud i petriskålen.
- Aspirere follikulærindholdet ved hjælp af 28 G nål med en størrelse på 5/8" fastgjort til en engangssprøjte, og overfør den til petriskålen.
BEMÆRK: Kassér resterne af ovarievæv. Efterfølgende isolationsfaser udføres under et stereomikroskop.
- Forbered 3-5 60 mm IVF Petri retter.
- Tilsæt 1 ml HM til de centrale brønde og læg en 3-4 dråber HM (50 μL pr. dråbe) i deres ydre ringe.
- Derefter, ved hjælp af en polycarbonat mikropipette, flytte ubeskadigede p-piller til dråber af HM i de ydre ringe til at skylle dem kort for 3-4 gange.
- I slutningen, individuelt overføre dem til den centrale brønd. Opbevar denne IVF plader i en inkubator for yderligere procedurer.
- Når p-piller er indsamlet, skal du udføre det endelige udvælgelsestrin ved at tildele dem tilfældigt i to forskellige IVM-indkapslingsprotokoller, der er anført nedenfor.
2. Indkapsling i fibrin-alginat hydrogel perler
- Der klargøres 1 ml 50 IE/ml trombin i tris-bufferet saltvand (TBS; pH 7,4) med 100 mM CaCl2 i et 2,0 mL sterilt mikrocentrifugerør.
- Forbered fibrinogen lageropløsning (50 mg/ml i TBS) og hold den frosset.
BEMÆRK: For at undgå sammenklumpning ved opløsning af fibrinogen i TBS opvarmes TBS til 37 °C.- På dagen for proceduren, tø det langsomt på is og lige før brug bringe til stuetemperatur.
- Lige før brug blandes ved en 1:1 forhold 0,5% alginat opløsning og 50 mg/ ml fibrinogen opløsning for at få endelig 2 ml (FA). I en steril mikrocentrifuge rør forsigtigt vortex blandingen. Undgå at lave bobler.
- For at forberede "inkubation kamre", anvende tynde strimler af paraffin film til glas mikroskop dias.
BEMÆRK: Tør objektglasset af med 70 % EtOH før brug. Et inkubationskammer dannes med to objektglas. For at adskille dem skal du placere 3 mm afstandsede på en af dem. - Pipette 7,5 μL dråber af FA blandingen på denne paraffin film belagt glas dias, som også har adskille afstandsløbere. På et dias sted 8-10 dråber, arrangeret i to rækker.
- Overfør, ved hjælp af en mikropipette, 3-5 P-piller sammen med et minimum volumen (op til 5 μL) af modning medium (MM), og placere dem netop i midten af FA drop. Denne procedure kræver gode manuelle færdigheder og præcision.
BEMÆRK: Modningsmediet (MM) består af DMEM/F12, suppleret med 10 IU/ml PMSG, 10 IU/ml hCG, 10% FBS og 50% svinesækkulær væske (FF), indsamlet i trin 1.4. - Tilsæt 7,5 μL trombin/Ca2+ opløsning på hver FA drop, bare for at dække dem. Der er ingen grund til at blande dem, fordi gelen danner næsten øjeblikkeligt.
- Dæk inkubationskammeret til ved at påføre den anden, tidligere forberedte glasrutsjebane på FA-kapslerne. Med en meget omhyggelig, men fast bevægelse, drej kammeret på hovedet og læg det i en 100 mm petriskål foret med fugtigt filterpapir for at undgå tørring.
- Derefter overføres petriskålen til 5% CO2-inkubatoren (38 °C) i ca. 5-7 min. Efter dette, FA kapsler vil blive overskyet på grund af samtidig gelering af fibrin og alginat.
- Overfør FA kapsler i 96 brøndplader (en kapsel pr. brønd), der indeholder 100 μL MM pr. brønd.
BEMÆRK: For ikke at beskadige de dannede FA kapsler, udføre dette trin omhyggeligt med brug af kirurgiske saftriver. - Hver anden dag erstatte halvdelen af MM (50 μL) med frisk, præ-ækvilibreret en. Billed-p-pc'er ved hjælp af et omvendt lysmikroskop (ved 10x forstørrelse).
BEMÆRK: Kulturforhold for FA-co-piller: 38 °C, under 5% CO2 atmosfære og relativ luftfugtighed 95%. Efter 4 dages IVM, hydrogels synes næsten klar på grund af progressiv nedbrydning af fibrin komponent. Det resterende alginat bør nedbrydes enzymatisk - ved alginat-lyase, et planteafledt enzym, der specifikt nedbryder alginat og ikke påvirker dyreceller.- Fjern MM fra brønde, der indeholder kapslerne, og tilsæt 100 μL 10 IE/ml alginatlyase i DMEM. Lad kulturpladen være i inkubatoren i 25-30 min.
- Fjern p-piller fra de opløste kapsler.
BEMÆRK: Dette kan gøres med en skåret pipettespids. - Efter flere vasker i en frisk DMEM, overføre p-piller til den indre ring af en IVF parabol (5-10 COCs pr fad) indeholder PBS. Brug dem nu til yderligere morfologisk eller biokemisk analyse.
3. Indkapsling i super-hydrofobe fluorerede ethylen propylen (FEP) mikrobioreaktorer.
BEMÆRK: Sørg for, at alle IVM-procedurer udføres på termostatstyrede bord, og at p-piller holdes ved 38 °C under hele deres håndtering.
- Der klargøres en 30 mm petriskål med en partikelstørrelse på 1 μm i FEP-pulvergennemsnit.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge frisk FEP pulver. Den genbrugte FEP tendens til at samle og danner klumper. - Fordel en enkelt dråbe MM (~30 μL i volumen), der indeholder 3-5 COC'er isoleret i trin 1.6 på fep-pulverets seng. Drej pladen forsigtigt i en cirkulær bevægelse for at sikre, at disse partikler helt dækket overfladen af væsken dråbe og flydende kugler dannet (LM).
- Pick up dannet LM ved hjælp af en pipette med 1.000 μL spids.
BEMÆRK: Skær pipettens tip ved kanten, så den kan rummes i diameteren af LM (4-5 mm). Den omtrentlige diameter af en sådan forberedt spids skal være lidt større end LM'. - Forbered flere 60 mm IVF Petri retter. Tilsæt 3-4 ml sterilt vand til de ydre ringe for at forberede fugtighedskammeret. Dernæst skal du placere en LM i den centrale brønd.
BEMÆRK: Denne procedure kræver gode manuelle færdigheder og præcision - hvis marmor er placeret skødesløst eller falder selv fra en lav højde vil det blive ødelagt. - Inkuber kugler i 4 dage ved 38 °C i 5 % CO 2-inkubator.2
- Skift mediet dagligt efter proceduren: anvende 30 μL MM på hver LM, hvilket vil forårsage deres spredning, fordi direkte væskekontakt forstyrrer hydrofobiciteten af de belagte FEP-pulvere. Når marmorindholdet opløses, overføres p-pc'er, der frigives fra bioreaktoren, til en dråbe frisk MM i petriskålen.
BEMÆRK: Brug en polycarbonatmipipette for præcist at overføre frigivne p-piller. - Efter flere vasker i MM (3-4 gange) for at fjerne FEP partikler, overføre dem med 30 μL frisk MM på FEP pulver seng. Drej forsigtigt pladen i en cirkulær bevægelse for at sikre, at pulverpartiklerne helt dækkede væskens overflade og danner et nyt LM.
- Følg derefter proceduren fra trin 3.3-3.4.
BEMÆRK: Den gennemsigtige belægning af FEP-pulver gør det muligt at overvåge LM-indholdet ved hjælp af lysmikroskop.
- Skift mediet dagligt efter proceduren: anvende 30 μL MM på hver LM, hvilket vil forårsage deres spredning, fordi direkte væskekontakt forstyrrer hydrofobiciteten af de belagte FEP-pulvere. Når marmorindholdet opløses, overføres p-pc'er, der frigives fra bioreaktoren, til en dråbe frisk MM i petriskålen.
4. Karakterisering af p-piller efter 96-h IVM-procedure ved hjælp af to 3D-systemer
BEMÆRK: For at bestemme effektiviteten af de anvendte IVM-systemer skal du score p-piller morfologisk under et let mikroskop. Derudover skal du bruge dobbelt fluorescerende mærkning med calcein AM og ethidium homodimer (EthD-1) farvestoffer til analyse af COCs levedygtighed44.
- Morfologisk undersøgelse af oocytter efter IVM ved lys- og fluorescensmikroskopi.
- Vask p-piller (både dem, der stammer fra kultur ved hjælp af FAB og dem fra LM) med 38 °C 1x PBS.
BEMÆRK: For at lette håndteringen af p-piller og ikke beskadige dem under farvningsproceduren skal du bruge en 96 eller 48 brøndplade og udføre hvert farvningstrin ved at overføre p-pillerne til efterfølgende brønde. - Inkuber dem i 100 μL på 1,6 mM calcein AM og 5,5 mM EthD-1 i 30-45 min ved 37 °C. Begge stoffer fortyndes i 1x PBS.
BEMÆRK: Da dette er en to-farve fluorescens assay, udføre dette trin i mørke. - Efter inkubationen vaskes COC to gange i PBS og nedsænkes derefter i et antifademonteringsmedium, der er designet til at forhindre hurtig fotobleaching af fluorescerende proteiner og fluorescerende farvestoffer (materialetabel).
BEMÆRK: Beskyt kanterne af dækglasset mod tørring med neglelak. - Visualiser farvede prøver under et konfokalt laserscanningmikroskop.
BEMÆRK: At ophidse fluorescens af begge sonder (dvs. calcein og ethidium homodimer-1, EthD-1) tune en argon laser til 488nm. Den udsendte fluorescens adskilles af et tredobbelt dichroic filter 488/561/633 og måles derefter ved 505−570 nm for det grønne (calcein) og ved 630−750 nm for den røde (EthD-1). - PPC'er klassificeres i fire kategorier ved hjælp af modificeret klassificering, der anvendes på ovariefogeder i kultur baseret på konfokal fluorescensbilleddannelse afhængigt af procentdelen af døde granulosaceller35. V1: P-piller med anslået 100 % levedygtige CC'er; V2: COC'er med 10 % af døde CC'er; V3: COC'er med 10-50 % af de døde CC'er; V4: P-pc'er med 50 % af døde CC'er.
BEMÆRK: Teknisk set er det vanskeligt at vurdere levedygtigheden af oocyt med den levende døde analyse; Det bør derfor estimeres, f.eks.
- Vask p-piller (både dem, der stammer fra kultur ved hjælp af FAB og dem fra LM) med 38 °C 1x PBS.
- Undersøgelse af oocytter ultrastruktur efter IVM ved transmission elektron mikroskopi.
- Fix COCs i 100 μL 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natrium cacodylate buffer (pH 7,2, stuetemperatur) i 2 timer.
- PPC'er nedsænkes i 100 μL 0,1 M natrium cacodylate buffer (natten over ved 4 °C) og skylles i samme buffer.
- Postfix-pc'er med 1% osmium tetroxid i 0,1 M natrium cacodylate buffer (stuetemperatur) i 1 time.
- Efter farvning i uranylacetat (1 %), dehydreres p-piller i en stigende serie af ethanolfortyndinger (50%, 60%, 70%, 90% og 100%), infiltrere dem natten over ved stuetemperatur, efterfulgt af to korte ændringer af harpiks og endelig indlejre dem i LR White.
- Dernæst for at orientere og evaluere prøver, pletten semi-tynde sektioner (1 μm) med methylenblåt/azurblå II.
- Endelig undersøge ultratynde, dobbelt farvede sektioner på ultrastrukturelt niveau med TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I p-piller, der anvender begge IVM-systemer, holdt granulosacellerne sig tæt til hinanden, og de fleste af de genvundne p-piller havde intakte lag af cumulusceller (Figur 1A, B). Desuden blev en betydelig del af cumulusceller bevaret.
Resultaterne af cocs levedygtighedsanalysen bekræftede, at begge systemer, der anvendes til indkapsling af porcine oocytter i 3D in vitro-forhold, sikrede optimale vækstbetingelser (figur 2). I begge grupper blev der kun observeret højværdig oocytter, V1 = 13 %, V2 = 87 % for FAB og 10 % V1 og 90 % V2 for LM (tabel 1).
Mitokondrier, observeret ved transmission elektron mikroskopi (TEM), blev jævnt fordelt i oocytter, deres form efter IVM var shell-lignende45. Kun nogle få af dem blev forlænget, desuden blev deres klyngedannelse sporadisk observeret (figur 1C,D). Endoplasmatisk reticulum blev observeret, enten forbundet med mitokondrier eller fri i oocyt cytoplasma. Lipid dråber syntes som små mørke runde strukturer og Golgi apparater blev opstået med udvidet cisternae (Figur 1C, D).
| V1 | V2 | kr. | kr. | ||||
| % | Antallet | % | Antallet | % | Antallet | % | |
| Fab | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| CoCs samlede antal: 144 | 16a. | 128b | 0 | 0 | |||
Tabel 1. Resultater af levedygtigheden af p-piller efter indkapsling ved hjælp af fibrin-alginat perler (FAB) og mikrobioreaktorer FEP, Flydende Kugler (LM). Resultaterne blev givet som gennemsnit. Værdier med hævet skrift (a, b) varierede statistisk signifikant (p <0,05).
Figur 1: Repræsentative billeder, der viser p-pillers morfologi og ultrastruktur efter en indkapsling på 96 timer. aA) morfologi af COC'er inde i FAB - let mikroskopi; BB) morfologi af p-piller inde i LM - let mikroskopi; C: oocyt ultrastruktur (TEM) efter in vitro kultur inde FAB; D: oocyt ultrastruktur (TEM) efter in vitro kultur inde LM. O: oocyt; CC'er: cumulus celler; ZP: zona pellucida; N: kerne; M: mitokondrier; G: Golgi-apparater; ER: endoplasisk reticulum; Lp: lipid dråbe; FA: alginat og fibrinfilamenter; FEP: pulver af copolymer af hexafluoropropylen og tetrafluorethylen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative fluorescerende billeder af p-piller efter 96 timers indkapsling. (A,B) De billeder, der er opnået for de samme p-piller efter in vitro-kulturen ved hjælp af FAB med to filtre til at visualisere grøn fluorescens eller rød fluorescens for henholdsvis levende eller døde celler og ( C )fusionerebegge. (D,E) De billeder, der er opnået for de samme p-piller efter in vitro-kulturen ved hjælp af LM med to filtre til at visualisere grøn fluorescens eller rød fluorescens for henholdsvis levende eller døde celler og(F) fusionereaf dem. Skalastænger = 50 μm. Hvide stjerner indikerer celler, der gennemgår apoptose. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til at opretholde in vitro vækst ikke kun af oocyt, men også af cumulus celler omkring det og samtidig støtte dens modning er yderst afgørende for den vellykkede assisteret reproduktive teknologier og for at fremme forståelsen af somatiske celle / oocyt interaktioner især hos arter, der gennemgår langvarig follikulær vækst såsom mennesker eller svin. Løbende forbedrede IVM teknikker bliver nyttigt redskab til at bevare reproduktive muligheder i tilfælde af polycystisk ovariesyndrom (PCOS), for tidlig ovariesvigt, eller endelig infertilitet (oncotherapy). Desuden, da visse ovariedysfunktionsfunktionss kan være forårsaget af dysreguleret follikulær vækst, forståelse af de molekylære og cellulære mekanismer, der styrer korrekt udvikling af oocyt kan give vigtig indsigt i patofysiologi og rationel behandling af disse betingelser. In vitro kultur systemer, der ville støtte vedligeholdelsen af COCs 3D-arkitektur under IVM, kræver et trin i indkapsling i en matrix eller inde i en bioreaktor. Dette arbejde beskriver en protokol, der kan anvendes til kulturen af svin oocytter. Begge 3D in vitro-kultursystemer, der præsenteres her for at fremkalde vækst og udvikling af porcine-co'er, er brugervenlige og giver mulighed for effektiv kontrol med både oocyt- og cumuluscellernes overlevelse.
Den første in vitro kultur metode af p-piller ved hjælp af deres indkapsling i fibrin-alginat hydrogel perler (FAB) præsenteret her giver mulighed for en 3D oocyt vækst i en aktivt celle-lydhør matrix miljø. Tidligere offentliggjorte protokoller baseret på alginathydrgeler blev normalt anvendt til undersøgelse af udviklingen af ovariefoskler isoleret fra mange dyrearter med meget lovende resultater32. Interessant, uanset den endelige sammensætning af alginat hydrogel32 eller indkapslingsmetoden selv46, disse undersøgelser viste, at alginat perle-baserede 3D-kultursystemer var i stand til at støtte follikulær vækst og deres overlevelse.
Alginat hydrogels var skånsomme mod folliklerne, ikke påvirker deres yderligere overlevelse eller udvikling in vitro. På samme måde er in vitro-kulturprotokollen for p-piller, der er beskrevet for første gang her, egnet til at generere svinestøvler af god kvalitet, som det blev dokumenteret på både morfologisk og ultrastrukturelt niveau. Tilstedeværelsen af fibrinogen i en alginatopløsning og deres samtidige gelering resulterer i dannelsen af et interpenetrerende netværk, som skaber og yderligere stabiliserer det tredimensionelle miljø. På grund af den specifikke strukturelle støtte inde i en sådan matrix, celle-til-celle kontakter og parakrine kommunikation mellem oocytter og cumulus celler opretholdes på samme måde som disse til stede in vivo.
De to mest kritiske trin i modningsprotokollen, der er beskrevet i dette dokument, er overførsel af FA-kapsler fra inkubationskamre til 96-brøndplader, der indeholder MM (trin 2.10.), og fjernelse af p-piller fra de opløste kapsler efter enzymatisk nedbrydning af det resterende alginat ved hjælp af alginatlyase (trin 2.11.). Begge trin kræver betydelig manuel dygtighed og præcision for at undgå, i det første tilfælde ødelæggelse af kapsler, i det andet - skader på p-piller.
Den vigtigste styrke af denne metode, ud over at etablere optimale betingelser for oocyt modning af et stort husdyr, er, at under analyse ved hjælp af TEM, lys mikroskopi eller konfokal mikroskopi, ingen kapsel fjernelse er nødvendig. Alginat er ikke en barriere ved billeddannelse. Hvis du lader p-pillerne blive i kapsler, er det lettere at manipulere under farvningsproceduren.
Den anden COC in vitro kultur præsenteres her er den ene med brug af LM, som generelt er nonstick dråber dækket af mikro-skalerede partikler og opnås ved blot rullende små mængder af en væske i en meget hydrofobe pulver47. Tidligere undersøgelser med brug af LM til kultur, blandt andet fibroblaster48, røde blodlegemer49, organoid af en tumor38, pancreas celler50 eller får oocytter36 er blevet udført ved hjælp af polytetrafluorethylen (PTFE) som en hydrofob polymer til fremstilling af dråberne. PTFE er meget udbredt i klinikken (f.eks. kardiovaskulære grafts).
I dette arbejde præsenterer vi for første gang en pålidelig metode til mikrobioreaktorer fremstillet af FEP-partikler til in vitro-kultur af svine-pc'er. Brugen af FEP i den præsenterede protokol, som er meget ens i sammensætning og egenskaber til PTFE, gør forberedelsen af LM meget lettere. Dette pulver er blødere end PTFE, og hvad der er særligt vigtigt, det er gennemsigtigt. Dette forenkler til gengæld arbejdet under billeddannelse af strukturer dyrket med dets anvendelse. Den nemme at danne LM ved hjælp af FEP er en klar fordel ved denne metode.
Det mest kritiske trin i modningsprotokollen, der er beskrevet i dette dokument, er at samle og overføre dannet LM til 60 mm IVF Petriskål ved hjælp af en pipettespids (trin 3.3. og 3.4.). Disse trin kræver betydelig manuel dygtighed og præcision for at undgå ødelæggelse af LM.
Muligvis, den vigtigste begrænsning af 3D oocyt modning induktion protokoller præsenteret her er den relativt store vanskeligheder med at opnå ordentlig forskning materiale indsamlet fra dyr, der ikke behandles med antibiotika, anabolske steroider (dvs. nadrolone, boldenone) eller melengestrol acetat som fremmer deres hurtige vækst. Disse steroider, på trods af deres anvendelse er forbudt i Europa, er stadig meget udbredt i den industrielle husdyravl i løbet af de sidste to måneder af opfedning periode, som forårsager, blandt andre, forstyrret seksuel modning.
Afslutningsvis vil jeg være, at begge 3D-systemer præsenteret her opretholder det optimale gasformige in vitro-kulturmiljø. De opretholder også COCs 3D-organisation ved at forhindre deres udfladning og deraf følgende afbrydelse af kløftkryds og dermed bevare det funktionelle forhold mellem oocyt og de omkringliggende follikulære celler, hvad der er afgørende for korrekt oocytmodning. Begge modeller er således et værdifuldt redskab til grundforskning i reproduktiv biologi og kan også have klinisk relevans, hvilket fører til forbedret fertilitetsbehandling. Derudover kan de også anvendes til udvikling af nye bioteknologiske metoder samt til husdyrforbedring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er meget taknemmelige for: dr Waclaw Tworzydlo (Institut for Udviklingsbiologi og Hvirvelløse Morfologi, Institut for Zoologi og Biomedicinsk Forskning, Jagiellonian University) for tekniske faciliteter i TEM; beata Snakowska (Institut for Endokrinologi, Institut for Zoologi og Biomedicinsk Forskning, Jagiellonian University) for teknisk bistand; institut for cellebiologi og billeddannelse, Institut for Zoologi og Biomedicinsk Forskning, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japan). Dette arbejde blev støttet af tilskud 2018/29/N/NZ9/00983 fra National Science Centre Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
References
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).
