Summary
Apresentados aqui estão dois protocolos para o encapsulamento de oócitos suínos em condições culturais 3D. No primeiro, os complexos cumulus-oocyte (COCs) são encapsulados em contas fibrina-alginato. No segundo, são fechados com partículas fluoradas de propileno de etileno (microbioreatores). Ambos os sistemas garantem condições ideais para manter sua organização 3D.
Abstract
Na biologia reprodutiva, a revolução da biotecnologia que começou com a inseminação artificial e a tecnologia de transferência de embriões levou ao desenvolvimento de técnicas de reprodução assistida, como oócito na maturação in vitro (IVM), fertilização in vitro (FIV) e clonagem de animais domésticos por transferência nuclear de células somáticas. IVM é o método particularmente importante. É a tecnologia de plataforma para o fornecimento de oócitos maduros e de boa qualidade para aplicações como redução do intervalo de geração em espécies comercialmente importantes ou ameaçadas, pesquisas sobre reprodução humana in vitro e produção de animais transgênicos para terapias celulares. O termo qualidade oócito inclui sua competência para completar o amadurecimento, ser fertilizado, resultando assim em descendentes saudáveis. Isso significa que os oócitos de boa qualidade são primordiais para a fertilização bem sucedida, incluindo procedimentos de FIV. Isso coloca muitas dificuldades para desenvolver um método de cultura confiável que apoiaria o crescimento não só dos oócitos humanos, mas também de outras grandes espécies de mamíferos. O primeiro passo no IVM é a cultura in vitro dos oócitos. Este trabalho descreve dois protocolos para a cultura 3D de oócitos suínos. No primeiro, os complexos cumulus-oocyte do modelo 3D (COCs) são encapsulados em uma rede interpenetrating de contas fibrina-alginato, na qual uma mistura de fibrina e alginato são geladas simultaneamente. No segundo, os COCs são suspensos em uma gota de partículas de pó de médio e encapsulado com etileno fluorado (FEP; copolímero de partículas de hexafluoropropileno e tetrafluoroetileno) para formar microbioreatores definidos como Mármores Líquidos (LM). Ambos os sistemas 3D mantêm o ambiente gasoso de cultura in vitro. Eles também mantêm a organização 3D dos COCs, impedindo seu achatamento e consequente interrupção das junções de lacunas, preservando assim a relação funcional entre o oócito e as células foliculares circundantes.
Introduction
O desenvolvimento de diversos sistemas culturais, incluindo tridimensionais (3D), visa fornecer condições ideais para o crescimento e maturação de oócitos isolados dos folículos mesmo em estágios iniciais de desenvolvimento. Isso é de grande importância para as técnicas de reprodução assistida (TARV), especialmente tendo em vista o crescente número de mulheres que lutam contra a infertilidade após o tratamento do câncer1. A maturação de oócitos em condições in vitro (IVM) já é uma técnica bem estabelecida usada principalmente para a geração de embriões in vitro para fins de reprodução pecuária2. No entanto, na maioria das espécies de mamíferos, mesmo que altas taxas de maturação de complexos cumulus-oócitos (COCs) possam ser alcançadas (faixas de 60 a 90 %)3, sua competência de desenvolvimento ainda é inadequada às necessidades. Isso porque o desenvolvimento das zygotes obtidas de tal forma até o estágio blastocisto é baixo e após a transferência para animais substitutos sua viabilidade de termo é reduzida. Consequentemente, é necessário aumentar a competência de desenvolvimento dos embriões obtidos a partir de oócitos submetidos ao procedimento IVM4. Portanto, novas mídias de maturação5 estão sendo elaboradas e vários períodos de cultura in vitro são testados6,7 juntamente com a suplementação de meios culturais com diversos fatores de crescimento e moléculas8,,9.
O primeiro passo de qualquer sistema IVM completo é criar condições ideais para o crescimento sustentável de oócitos durante a cultura in vitro. O crescimento do oócito é um dos indicadores específicos da capacidade do oócito de retomar a meiose10,11. Além disso, um sistema de cultura in vitro oócito adequado deve ser capaz de suportar sua maturação nuclear e diferenciação citoplasmática12. A morfologia do complexo cumulus-oocyte é outro indicador importante usado nas clínicas de TARV para selecionar o melhor oócito para etapas subsequentes do procedimento de fertilização in vitro (FIV) em humanos e animais12,13. Entre as características morfológicas dos COCs considerados estão: o diâmetro do oóclito, sua granulação citoplasma e a primeira integridade do corpo polar14,15. Além disso, o potencial de desenvolvimento oócito está correlacionado com a aparência e compactação de células cumulus e número de suas camadas em torno do oócito. Muito importante para o sistema de cultura in vitro oócito apropriado é também a manutenção de células oócida-cumulus interações adequadas e estabilidade do citoesqueleto16,17,,18,19. Até agora, o crescimento in vitro de oócitos dentro de COCs humanos foi demonstrado20. O uso de COCs de vaca também resultou em nascidos vivos. Estes foram isolados de folículos ovarianos imaturos e depois cultivados por 14 dias até que o oócito fosse suficientemente grande para se submeter ao procedimento de FIV21. Da mesma forma, cocs isolados de folículos antral babuínos, submetidos ao IVM após a cultura in vitro produzir oócitos capazes de reiniciar a meiose ao estágio metafase II com uma estrutura de fuso de aparecimento normal22. No entanto, neste estudo, os autores não tentaram fertilizá-los. No entanto, tais resultados indicam que um procedimento semelhante poderia ser aplicado não apenas a essas espécies de mamíferos particulares, mas também a complexos humanos cumulus-oócitos obtidos a partir de folículos que deveriam permitir a obtenção de oócitos de boa qualidade adequados para uma técnica de FIV bem sucedida.
Os resultados descritos acima foram obtidos com a aplicação de protocolos ivm convencionais durante os quais os oócitos foram cultivados em sistemas bidimensionais (2D). O procedimento de rotina em sistemas de cultura 2D abrange oócitos, imersos em uma gota de uma mídia cultural adequada, com óleo mineral23,24. Supõe-se que uma sobreposição de óleo durante a cultura in vitro oócito serve para evitar a evaporação líquida, garantindo assim a manutenção do pH adequado e da pressão osmótica na cultura. Embora tal sistema de cultura 2D permita obter, mesmo até 87% dos oócitos suínos maduros25,foi comprovado que a sobreposição de óleo mineral causa difusão substancial de materiais solúveis lipídicos necessários para o desenvolvimento adequado de oócitos26. Além disso, devido à difusão de esteroides (progesterona e estrogênios) no óleo mineral durante a cultura dos oócitos, observou-se um atraso na maturação nuclear e redução da realização da competência de desenvolvimento dos oócitos suínos. Isso pode resultar na obtenção de um pequeno número de zigotas, que além disso são caracterizadas pela baixa capacidade de desenvolvimento para o estágio do blastocisto e pela baixa viabilidade após a transferência para animais receptores27. Portanto, estão sendo feitas tentativas de aumentar a competência de desenvolvimento de embriões derivados de oócitos recebidos após o procedimento de IVM, criando condições ideais para alcançar a maturidade citoplasmática e nuclear dos oócitos cultivados em conjunto com os CCs como complexos, especialmente utilizando sistemas tridimensionais (3D). Vários inovadores sistemas de cultura in vitro 3D foram desenvolvidos nas últimas duas décadas28,29. Estes foram projetados para manter a organização espacial natural das células e evitar seu achatamento em pratos culturais que não podem ser alcançados nas culturas 2D tradicionais. A atividade estrutural e funcional de COCs cultivados pode ser garantida pela manutenção de sua arquitetura adequada e comunicação não perturbada através de cruzamentos de lacunas entre vários compartimentos30. A adequação dos andaimes biopesais para a cultura in vitro 3D de complexos cumulus-oócitos tem sido avaliada utilizando biomateriais naturais, como vários componentes da matriz extracelular (ECM; colágeno e ácido hialurônico)31 ou polímeros inertes (alginato)32. Essas tentativas testadas em diversas espécies trouxeram resultados promissores em termos de retomada da meiose oócito e realização de sua competência plena33,34,,35. No entanto, até agora, nenhum sistema 3D adequado para a maturação de COCs isolado de animais domésticos de grande porte, incluindo suínos, foi desenvolvido.
Este trabalho descreve dois protocolos que podem ser usados para a cultura 3D de COCs suínos. O primeiro protocolo descreve o encapsulamento em contas fibrina-alginato (FAB). A FAB pode ser formada por uma solução de alginato e fibrina, que passa por um processo de gelação síncrona. Essa combinação proporciona um ambiente mecânico dinâmico porque ambos os componentes contribuem para a rigidez da matriz. Uma solução semelhante já foi usada anteriormente para a cultura do folículo ovariano do rato e a maturação36. No caso do protocolo apresentado, para evitar a degradação prematura da rede alginato-fibrina, são utilizadas concentrações adequadamente maiores de solução de cloreto de cálcio, garantindo um processo de gelação rápido e estável. O ambiente mecânico dinâmico cria condições semelhantes a estas no ambiente intra-folicular natural no qual os COCs residem e aumentam de tamanho. Além disso, o trabalho mostra resultados representativos de sistemas de cultura 3D de COCs, nos quais estes são suspensos em uma gota de média e encapsulada com propileno fluorado de etileno (FEP; copolímero de partículas de hexafluoropropileno e tetrafluoroetileno), para formar microbioreatores (Mármores Líquidos, LM). LM é uma forma de bioreator 3D que já foi demonstrado anteriormente para apoiar, entre outros, o crescimento de microrganismos vivos37,esferoides tumorais38 e células-tronco embrionárias39. Os LMs também têm sido usados com sucesso para a cultura oócitode ovelhas 40. Na maioria dos experimentos utilizando LMs, os bioreatores foram preparados utilizando o leito de pó politetrafluoroetileno (PTFE) com tamanho de partícula de 1 μm41. O protocolo apresentado utiliza FEP, que é muito semelhante em composição e propriedades aos fluoropolímeros PTFE. Mas a FEP é mais facilmente formada e mais macia que o PTFE e o que é especialmente importante, é altamente transparente.
Ambos os sistemas 3D mantêm o ambiente gasoso de cultura in vitro. Eles também mantêm a organização 3D dos COCs, impedindo seu achatamento e consequente interrupção das junções de lacunas, preservando sua relação funcional entre o oócito e as células foliculares circundantes.
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Protocol
Os seguintes procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal do Instituto de Zoologia e Pesquisa Biomédica da Universidade Jagiellonian.
1. Isolamento dos complexos de cumulus-oócito suíno
- Para coletar material para o isolamento de folículos ovarianos, extirto de ovários suínos de dourados pré-púbertes (aproximadamente 6-7 meses de idade, pesando 70 a 80 kg) em um matadouro local. Escolha aproximadamente 20 ovários de porcos de 10 animais para isolamento de COCs em cada experimento.
NOTA: Supondo que cada ovário produza de 3 a 5 folículos, o número total de folículos varia de 60 a 100. - Coloque os ovários em uma termoatrica com soro fisiológico estéril tamponado (PBS; pH 7,4; 38 °C) contendo 1% de AAS. Certifique-se de que o material experimental seja transportado para o laboratório dentro de 1h onde ele é enxaguado duas vezes com PBS estéril contendo antibióticos.
- Depois de enxaguar os ovários, transfira-os para o béquer preenchido com hm médio e armazene em uma incubadora a 38 °C para o tempo de todas as manipulações.
NOTA: Para obter resultados ótimos durante o manuseio do oócito, realizar todos os procedimentos em MMEM/F12 médio (médio de manuseio, HM) com a adição de 2,5% de solução antibiótico/antimíctico (AAS) e 10% de soro bovino fetal (FBS) e controlar o pH no nível de CO2 no ambiente, em uma mesa de aquecimento com controle de temperatura (38 °C) e sob o capô de fluxo laminar para minimizar a contaminação bacteriana. - De grandes folículos suínos (6-8 mm de diâmetro) coletam fluido folicular (FF) por aspiração e centrifugação a 100 x g por 10 min à temperatura ambiente. Depois disso, filtre o supernascido usando seringa estéril presa a filtros de poros de membrana de 0,2 μm e escorra ao congelamento a -80 ° C.
NOTA: Use uma seringa de insulina (u- 40) para aspiração de fluido folicular. - Certifique-se de que, apenas folículos saudáveis e de médio porte (4-6 mm de diâmetro) sejam selecionados para isolamento de COCs42.
NOTA: OS COCs de grau I, possuindo um oócito intacto e redondo com ooplasma homogêneo e cumulus compactos multicamadas (pelo menos 3-4) são considerados adequados para o procedimento 3D IVM43. - Para isolar os COCs, transfira 2-3 ovários para uma placa de Petri estéril de 10 cm de diâmetro preenchida com HM. Isolar COCs de folículos de tamanho médio seguindo um dos procedimentos abaixo.
- Corte suavemente a superfície dos folículos ovarianos salientes com uma lâmina cirúrgica estéril 15C. Isso fará com que o fluido folicular junto com os COCs fluam para a placa de Petri.
- Aspire o conteúdo folicular usando agulha de 28 G com um tamanho de 5/8" preso a uma seringa descartável e transfira-o para a placa de Petri.
NOTA: Descarte os restos do tecido ovariano. Os estágios subsequentes de isolamento são realizados sob um estereótipo.
- Prepare 3-5 60 mm de placas de Petri de FIV.
- Adicione 1 mL de HM aos poços centrais e coloque uma gota de 3-4 de HM (50 μL por gota) em seus anéis externos.
- Em seguida, usando uma micropipette de policarbonato, mova os COCs não danificados para gotas de HM nos anéis externos para enxágüe-los brevemente por 3-4 vezes.
- No final, transferi-los individualmente para o poço central. Armazene esta placa de FIV em uma incubadora para procedimentos posteriores.
- Depois que os COCs forem coletados, realize a etapa final de seleção atribuindo-as aleatoriamente em dois protocolos diferentes de encapsulamento IVM listados abaixo.
2. Encapsulamento em contas de hidrogel fibrina-alginato
- Prepare 1 mL de trombina de 50 UI/mL em soro fisiológico tamponado por Tris (TBS; pH 7.4) com 100 mM CaCl2 em um tubo de microcentrifuge estéril de 2,0 mL.
- Prepare a solução de estoque de fibrinogênio (50 mg/mL em TBS) e mantenha-a congelada.
NOTA: Para evitar a aglomeração ao dissolver o fibrinênio em TBS, aqueça a TBS a 37 °C.- No dia do procedimento, descongele-o lentamente no gelo e logo antes do uso trazer à temperatura ambiente.
- Pouco antes do mix de uso em uma solução de 1:1 proporção 0,5% de alginato e solução fibrinogen de 50 mg/mL para obter finalmente 2 mL (FA). Em um tubo de microcentrifuge estéril suavemente vórtice a mistura. Evite fazer bolhas.
- Para preparar "câmaras de incubação", aplique tiras finas de filmes de parafina nos slides do microscópio de vidro.
NOTA: Limpe os slides com 70 % de EtOH antes de usar. Uma câmara de incubação é formada com dois slides. Para separá-los, coloque espaçadores de 3 mm em um deles. - Pipeta 7,5 μL gotas da mistura FA sobre este slide de vidro revestido de filme de parafina, que também tem espaçadores separados. Em um slide place 8-10 gotas, dispostas em duas linhas.
- Transfira, utilizando uma micropipette, 3-5 COCs juntamente com um volume mínimo (até 5 μL) de meio de maturação (MM), e coloque-os precisamente no centro da queda da FA. Este procedimento requer boas habilidades manuais e precisão.
NOTA: O meio de maturação (MM) é composto por DMEM/F12, suplementado com 10 PMSG de UI/mL, 10 UI/mL hCG, 10% FBS e 50% de fluido folicular suíno (FF) coletado na etapa 1.4. - Adicione 7,5 μL de solução thrombin/Ca2+ em cada gota fa, apenas para cobri-los. Não há necessidade de misturá-los porque o gel se forma quase instantaneamente.
- Cubra a câmara de incubação aplicando o segundo slide de vidro previamente preparado nas cápsulas FA. Com um movimento muito cuidadoso, mas firme, vire a câmara de cabeça para baixo e coloque-a em uma placa de Petri de 100 mm forrada com papel filtro úmido para evitar a secagem.
- Em seguida, transfira a placa de Petri para a incubadora de 5% de CO2 (38 °C) por cerca de 5-7 min. Depois disso, as cápsulas fa ficarão nubladas por causa da gelação simultânea de fibrina e alginato.
- Transfira cápsulas FA para 96 placas de poço (uma cápsula por poço) contendo 100 μL MM por poço.
NOTA: Para não danificar as cápsulas fa formadas, realize esta etapa cuidadosamente com o uso de fórceps cirúrgicos. - A cada 2 dias substitua metade do MM (50 μL) por um fresco e pré-equilibrado. COCs de imagem usando um microscópio de luz invertida (a 10x de ampliação).
NOTA: Condições de cultura para a cultura da FA dos COCs: 38 °C, sob uma atmosfera de CO2 de 5% e umidade relativa 95%. Após 4 dias de IVM, os hidrogéis parecem quase claros devido à degradação progressiva do componente fibrina. O alginato restante deve ser degradado enzimaticamente - por alginato-lyase, uma enzima derivada de plantas que especificamente degrada alginato e não afeta células animais.- Remova mm de poços contendo as cápsulas e adicione 100 μL de 10 UI/mL alginate lyase em DMEM. Deixe a placa de cultura na incubadora por 25-30 min.
- Remova os COCs das cápsulas dissolvidas.
NOTA: Isso pode ser feito com uma ponta de pipeta cortada. - Depois de várias lavagens em um DMEM fresco, transfira COCs para o anel interno de um prato de FIV (5-10 COCs por prato) contendo PBS. Agora, use-os para análises morfológicas ou bioquímicas.
3. Encapsulamento em microbiorretores de etileno fluoróbico super-hidrofóbico (FEP).
NOTA: Certifique-se de que todos os procedimentos de IVM sejam realizados na tabela controlada termostaticamente e os COCs sejam mantidos a 38 °C durante todo o manuseio.
- Prepare uma placa de Petri de 30 mm contendo 5 g de fep pó de tamanho médio de partícula de 1 μm.
NOTA: É importante usar pó FEP fresco. O FEP reutilizado tende a agregar e forma aglomerados. - Distribua uma única gota de MM (~30 μL em volume) contendo 3-5 COCs isolados na etapa 1.6 no leito do pó FEP. Gire a placa suavemente em um movimento circular para ter certeza de que essas partículas cobriram completamente a superfície da gota líquida e das bolinhas líquidas formadas (LM).
- Pegue lM formado usando uma pipeta com ponta de 1.000 μL.
NOTA: Corte a ponta da pipeta na borda, para acomodá-la ao diâmetro do LM (4-5 mm). O diâmetro aproximado dessa ponta preparada deve ser ligeiramente maior do que o do LM. - Prepare várias placas de Petri de FERTILIZAÇÃO IN VITRO de 60 mm. Adicione 3-4 mL de água estéril aos anéis externos para preparar a câmara de umidade. Em seguida, coloque um LM no poço central.
NOTA: Este procedimento requer boas habilidades manuais e precisão - se o mármore for colocado descuidadamente ou cair mesmo de uma altura baixa, ele será destruído. - Incubar bolinhas de gude por 4 dias a 38 °C em incubadora de 5 % CO2.
- Altere o meio diariamente após o procedimento: aplique 30 μL de MM em cada LM, o que causará sua disseminação porque o contato líquido direto interrompe a hidroofobidade dos pós FEP revestidos. Quando o teor de mármore se dissolver, transfira COCs liberados do bioreator para uma gota de MM fresco na placa de Petri.
NOTA: Para transferir com precisão cocs liberados, use uma micropipette de policarbonato. - Depois de várias lavagens em MM (3-4 vezes) para remover partículas FEP, transfira-as com 30 μL de MM fresco para o leito de pó FEP. Gire suavemente a placa em um movimento circular para garantir que as partículas de pó cobrissem completamente a superfície da gota líquida e formassem um novo LM.
- Em seguida, siga o procedimento das etapas 3.3-3.4.
NOTA: O revestimento transparente do pó FEP permite monitorar o conteúdo LM usando microscópio leve.
- Altere o meio diariamente após o procedimento: aplique 30 μL de MM em cada LM, o que causará sua disseminação porque o contato líquido direto interrompe a hidroofobidade dos pós FEP revestidos. Quando o teor de mármore se dissolver, transfira COCs liberados do bioreator para uma gota de MM fresco na placa de Petri.
4. Caracterização de COCs após procedimento ivm de 96 h usando dois sistemas 3D
NOTA: Para determinar a eficiência dos sistemas de IVM utilizados, ecore COCs morfologicamente sob um microscópio leve. Além disso, utilize rotulagem fluorescente dupla com corantes de calcein AM e ethidium homodimer (EthD-1) para análise da viabilidade de COCs44.
- Exame morfológico de oócitos após o IVM por microscopia de luz e fluorescência.
- Lavar COCs (ambos derivados da cultura usando FAB e os de LM) com 38 °C 1x PBS.
NOTA: Para facilitar o manuseio dos COCs e não danificá-los durante o procedimento de coloração, utilize uma placa de 96 ou 48 poços e realize cada etapa de coloração transferindo os COCs para poços subsequentes. - Incuba-os em 100 μL de 1,6 mM calcein AM e 5,5 mM EthD-1 para 30-45 min a 37 °C. Diluir ambas as substâncias em 1x PBS.
NOTA: Por se trata de um ensaio de fluorescência de duas cores, realize esta etapa no escuro. - Após a incubação, lave o COC duas vezes em PBS e, em seguida, mergulhe-o em um meio de montagem antifado projetado para evitar a fotoblemação rápida de proteínas fluorescentes e corantes fluorescentes(Tabela de Materiais).
NOTA: Proteja as bordas do vidro de cobertura contra a secagem com qualquer esmalte. - Visualize amostras manchadas sob um microscópio de varredura a laser confocal.
NOTA: Para excitar a fluorescência de ambas as sondas (ou seja, calcein e ethidium homodimer-1, EthD-1) sintonize um laser de argônio a 488nm. A fluorescência emitida é separada por um filtro dicromático triplo 488/561/633 e, em seguida, medida em 505-570 nm para o verde (calcein), e em 630-750 nm para o vermelho (EthD-1). - Classificar os COCs em quatro categorias, utilizando classificação modificada aplicada aos folículos ovarianos na cultura com base em imagens de fluorescência confocal, dependendo da porcentagem de células de granulosa mortas35. V1: COCs com CCs estimados 100% viáveis; V2: COCs com 10% dos CCs mortos; V3: COCs com 10-50% de CCs mortos; V4: COCs com 50% dos CCs mortos.
NOTA: Tecnicamente, é difícil avaliar a viabilidade do oócito com o ensaio morto vivo; portanto, deve-se estimar, por exemplo, analisando a ultraestrutura mitocondrial ou atividade.
- Lavar COCs (ambos derivados da cultura usando FAB e os de LM) com 38 °C 1x PBS.
- Exame de ultraestrutura de oócitos após o IVM por microscopia eletrônica de transmissão.
- Fixar COCs em 100 μL 2,5% glutaraldeído em 0,1 M tampão de cacodilato de sódio (pH 7,2, temperatura ambiente) por 2 h.
- Mergulhe os COCs em 100 μL 0,1 M tampão de cacodilato de sódio (durante a noite a 4 °C) e enxágue no mesmo buffer.
- COCs pós-fixados com 1% de tetroxida de ósmio em 0,1 M tampão de cacodilato de sódio (temperatura ambiente) por 1h.
- Após a coloração do acetato de urano (1%), desidratar os COCs em uma série crescente de diluições de etanol (50%, 60%, 70%, 90% e 100%), infiltrar-se durante a noite à temperatura ambiente, seguido por duas breves mudanças de resina e, finalmente, incorporá-los em LR White.
- Em seguida, para orientar e avaliar amostras, colorir seções semifinas (1 μm) com azul de metileno/azul/azul II.
- Finalmente, examine seções ultrathin, duplamente manchadas no nível ultraestrutural com o TEM.
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Representative Results
Em COCs usando ambos os sistemas DE IVM, as células de granulosa aderiram firmemente umas às outras, e a maioria dos COCs recuperados tinha camadas intactas de células cumulus(Figura 1A,B). Além disso, uma proporção substancial de células cumulus foram mantidas.
Os resultados obtidos a partir da análise de viabilidade dos COCs confirmaram que ambos os sistemas aplicados para o encapsulamento de oócitos suínos em condições in vitro 3D garantiram condições ideais de crescimento(Figura 2). Em ambos os grupos, foram observados apenas oócitos de alta viabilidade, V1 = 13 %, V2 = 87 % para FAB e 10 % V1, e 90 % V2 para LM, respectivamente (Tabela 1).
Mitocôndrias, observadas pela microscopia eletrônica de transmissão (TEM), foram distribuídas uniformemente em oócitos, sua forma após IVM foram como uma concha45. Apenas alguns deles foram alongados, além disso, seu agrupamento foi esporadicamente observado(Figura 1C,D). Observou-se ânticulo endoplasmático, associado a mitocôndrias ou livre no citoplasma oócito. Gotículas lipídicas apareceram como pequenas estruturas redondas escuras e aparelhos Golgi surgiram com cisternae dilatada (Figura 1C,D).
| V1 | V2 | V3 | V4 | ||||
| % | Número | % | Número | % | Número | % | |
| Fab | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| Número total de COCs: 144 | 16a | 128b | 0 | 0 | |||
Mesa 1. Resultados sobre a viabilidade dos COCs após o encapsulamento utilizando contas fibrina-alginato (FAB) e microbioreatores FEP, Mármores Líquidos (LM). Os resultados foram dados como média. Os valores com sobrescritos (a, b) diferiram estatisticamente significativamente (p <0,05).
Figura 1: Imagens representativas mostrando a morfologia e a ultraestrutura dos COCs após 96 h de encapsulamento. (A) morfologia de COCs dentro da FAB - microscopia leve; (B) morfologia de COCs dentro de LM - microscopia leve; C: ultraestrutura oócida (TEM) após cultura in vitro dentro da FAB; D: ultraestrutura oócida (TEM) após cultura in vitro dentro de LM. O: oócito; CCs: células cumulus; ZP: zona pellucida; N: núcleo; M: mitocôndrias; G: Aparelho golgi; ER: órticulum endoplasmático; Lp: gotícula lipídica; FA: filamentos de alginato e fibrina; FEP: pó de copolímero de hexafluoropropileno e tetrafluoroetileno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens fluorescentes representativas de COCs após 96 h de encapsulamento. (A,B) As imagens obtidas para os mesmos COCs após a cultura in vitro usando FAB com dois filtros para visualizar fluorescência verde ou fluorescência vermelha para células vivas ou mortas, respectivamente, e (C) fusão de ambos. (D,E) As imagens obtidas para os mesmos COCs após a cultura in vitro usando LM com dois filtros para visualizar fluorescência verde ou fluorescência vermelha para células vivas ou mortas, respectivamente e (F) fusão deles. Barras de escala = 50 μm. Asteriscos brancos indicam células submetidas à apoptose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A capacidade de manter o crescimento in vitro não só do oócito, mas também das células cumulus ao seu redor e simultaneamente apoiar sua maturação é extremamente essencial para as tecnologias reprodutivas assistidas bem sucedidas e para promover a compreensão das interações somáticas de células/oócitos especialmente em espécies submetidas ao crescimento folicular prolongado, como seres humanos ou suínos. Técnicas de IVM continuamente melhoradas estão se tornando ferramentas úteis para preservar opções reprodutivas em casos de síndrome do ovário policístico (SPC), insuficiência ovariana prematura ou infertilidade definitiva (oncoterapia). Além disso, uma vez que certas disfunções ovarianas podem ser causadas pelo crescimento folicular desregulado, compreender os mecanismos moleculares e celulares que controlam o desenvolvimento adequado do oócito pode fornecer uma visão importante sobre a fisiopatologia e o tratamento racional dessas condições. Sistemas de cultura in vitro que suportariam a manutenção da arquitetura 3D de COCs durante o IVM, requerem uma etapa de encapsulamento em uma matriz ou dentro de um bioreator. Este trabalho descreve um protocolo que pode ser aplicado para a cultura dos oócitos suínos. Ambos os sistemas de cultura in vitro 3D apresentados aqui para induzir o crescimento e o desenvolvimento de COCs suínos são fáceis de usar e permitem o controle efetivo da sobrevivência das células oócitos e cumulus.
O primeiro método de cultura in vitro de COCs usando seu encapsulamento em contas de hidrogel fibrin-alginato (FAB) apresentado aqui permite um crescimento de oócito 3D em um ambiente de matriz ativamente responsiva às células. Protocolos publicados anteriormente baseados em hidrogéis alginatos eram geralmente utilizados para a investigação do desenvolvimento de folículos ovarianos isolados de inúmeras espécies animais com resultados muito promissores32. Curiosamente, independentemente da composição final do hidrogel alginato32 ou do próprio método de encapsulamento46,esses estudos mostraram que os sistemas de cultura 3D baseados em contas de alginato foram capazes de suportar o crescimento folicular e sua sobrevivência.
Os hidrogéis alginatos eram gentis nos folículos, não afetando sua sobrevivência ou desenvolvimento in vitro. Da mesma forma, o protocolo de cultura in vitro dos COCs descrito pela primeira vez aqui, é adequado para gerar oócitos suínos de boa qualidade, como foi documentado em níveis morfológicos e ultraestruturais. A presença de fibrinogênio em uma solução de alginato e sua gelagem simultânea, resulta na formação de uma rede de interpenetração que cria e estabiliza ainda mais o ambiente tridimensional. Devido ao suporte estrutural específico dentro dessa matriz, os contatos célula-célula e a comunicação paracrída entre oócitos e células cumulus são mantidos de forma semelhante às presentes in vivo.
As duas etapas mais críticas do protocolo de maturação descrito neste documento são a transferência de cápsulas fa de câmaras de incubação para placas de 96 poços contendo MM (etapa 2.10.) e a remoção de COCs das cápsulas dissolvidas após a degradação enzimática do alginato restante, utilizando lyase alginato (passo 2.11.). Ambas as etapas requerem habilidade manual significativa e precisão para evitar, no primeiro caso, a destruição de cápsulas, no segundo - dano aos COCs.
A principal força deste método, além de estabelecer condições ideais para a maturação do oócito de um animal doméstico de grande porte, é que durante a análise utilizando TEM, microscopia leve ou microscopia confocal, não é necessária a remoção da cápsula. Alginato não é uma barreira quando se imagem. Deixar COCs em cápsulas facilita a manipulação durante o procedimento de coloração.
A segunda cultura in vitro COC apresentada aqui é aquela com o uso de LM, que geralmente são gotículas antiaderente cobertas por partículas micro-dimensionadas e obtidas simplesmente rolando pequenos volumes de um líquido em um pó muito hidrofóbico47. Estudos anteriores com o uso de LM para cultura, entre outros fibroblastos48, glóbulos vermelhos49,organoide de um tumor38,células pancreáticas50 ou oócitosovinos 36 foram realizados utilizando politetrafluoroetileno (PTFE) como polímero hidrofóbico para a preparação das gotículas. O PTFE é amplamente utilizado na clínica (por exemplo, enxertos cardiovasculares).
Neste trabalho, apresentamos, pela primeira vez, um método confiável para microbioreatores feitos de partículas FEP para cultura in vitro de COCs suínos. O uso da FEP no protocolo apresentado, que é muito semelhante na composição e propriedades ao PTFE, facilita muito a elaboração do LM. Este pó é mais macio que o PTFE e o que é especialmente importante, é transparente. Isso, por sua vez, simplifica o trabalho durante a imagem de estruturas cultivadas com seu uso. A facilidade de formar LM usando FEP é uma vantagem definitiva deste método.
O passo mais crítico no protocolo de maturação descrito neste documento é pegar e transferir LM formado em placa de Petri de 60 mm de FIV usando uma ponta de pipeta (etapas 3.3. e 3.4.). Estas etapas requerem habilidade manual significativa e precisão para evitar a destruição de LM.
Possivelmente, a principal limitação dos protocolos de indução de maturação de oócito 3D apresentados aqui é a dificuldade relativamente grande na obtenção de material de pesquisa adequado coletado de animais não tratados com antibióticos, esteroides anabólicos (ou seja, nadrolona, boldenone) ou acetato de melengestrol que promovem seu rápido crescimento. Esses esteroides, apesar de seu uso ser proibido na Europa, ainda são amplamente utilizados na pecuária industrial durante os últimos dois meses do período de engorda, o que causa, entre outros, o amadurecimento sexual perturbado.
Em conclusão, ambos os sistemas 3D aqui apresentados mantêm o ambiente de cultura in vitro gasoso ideal. Eles também mantêm a organização 3D dos COCs, impedindo seu achatamento e consequente interrupção das junções de lacunas, preservando assim a relação funcional entre o oócito e as células foliculares circundantes, o que é crucial para a maturação adequada do oócito. Assim, ambos os modelos são uma ferramenta valiosa para pesquisas básicas em biologia reprodutiva e também podem ter relevância clínica, levando a um melhor tratamento de infertilidade. Além disso, também podem ser aplicados para o desenvolvimento de novos métodos de biotecnologia, bem como para a melhoria da pecuária.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores são muito gratos: dr. Waclaw Tworzydlo (Departamento de Biologia do Desenvolvimento e Morfologia de Invertebrados, Instituto de Zoologia e Pesquisa Biomédica da Universidade Jagiellonian) para instalações técnicas no TEM; à Sra. Beata Snakowska (Departamento de Endocrinologia, Instituto de Zoologia e Pesquisa Biomédica da Universidade Jagiellonian) para assistência técnica; para o Departamento de Biologia Celular e Imagem, Instituto de Zoologia e Pesquisa Biomédica, Universidade Jagiellonian, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tóquio, Japão). Este trabalho foi apoiado pela bolsa 2018/29/N/NZ9/00983 do National Science Centre Poland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
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