Summary
Qui presentati sono presentati due protocolli per l'incapsulamento di oociti di porcina in condizioni di coltura 3D. Nel primo, i complessi cumuli-oocici (COC) sono incapsulati in perline fibrin-alginate. Nel secondo, sono racchiusi con particelle di polvere di propilene di etilene fluorrinate (microbioreattori). Entrambi i sistemi garantiscono condizioni ottimali per mantenere la propria organizzazione 3D.
Abstract
Nella biologia riproduttiva, la rivoluzione biotecnologica iniziata con l'inseminazione artificiale e la tecnologia di trasferimento degli embrioni ha portato allo sviluppo di tecniche di riproduzione assistita come la maturazione in vitro di ovociti (IVM), la fecondazione in vitro (IVF) e la clonazione di animali domestici mediante trasferimento nucleare da cellule somatiche. IVM è il metodo particolarmente significativo. È la tecnologia di piattaforma per la fornitura di oociti maturi e di buona qualità per applicazioni quali la riduzione dell'intervallo di generazione in specie commercialmente importanti o in via di estinzione, la ricerca sulla riproduzione umana in vitro e la produzione di animali transgenici per terapie cellulari. Il termine qualità degli oociti include la sua competenza per completare la maturazione, essere fecondato, con conseguente prole sana. Ciò significa che gli oociti di buona qualità sono di primaria importanza per la fecondazione di successo, comprese le procedure di fecondazione in vitro. Ciò pone molte difficoltà a sviluppare un metodo di coltura affidabile che sosterrebbe la crescita non solo degli ovociti umani, ma anche di altre grandi specie di mammiferi. Il primo passo in IVM è la coltura in vitro degli ovociti. Questo lavoro descrive due protocolli per la coltura 3D degli oociti di porcina. Nel primo, i complessi cumuli-oocici modello 3D (COC) sono incapsulati in una rete interpenetrata di perline fibrin-alginate, in cui una miscela di fibrina e alginato viene gelata contemporaneamente. Nel secondo, i COC sono sospesi in una goccia di media e incapsulati con propileti di etilene fluorro (FEP; un copolimero di exafluoropropylene e tetrafluoroetilene) particelle di polvere per formare microbioreattori definiti come marmi liquidi (LM). Entrambi i sistemi 3D mantengono l'ambiente gassoso della coltura in vitro. Mantengono inoltre l'organizzazione 3D dei COC impedendone l'appiattimento e la conseguente interruzione delle giunzioni gap, preservando così la relazione funzionale tra l'ociocite e le cellule follicolari circostanti.
Introduction
Lo sviluppo di vari sistemi di coltura, compresi quelli tridimensionali (3D), mira a fornire condizioni ottimali per la crescita e la maturazione degli oociti isolati dai follicoli anche nelle prime fasi di sviluppo. Questo è di grande importanza per le tecniche di riproduzione assistita (ART), soprattutto in considerazione del crescente numero di donne che stanno lottando con l'infertilità dopo il trattamento delcancro 1. La maturazione degli ovociti in condizioni in vitro (IVM) è già una tecnica consolidata utilizzata principalmente per la generazione di embrioni in vitro ai fini della riproduzione del bestiame2. Tuttavia, nella maggior parte delle specie di mammiferi, anche se è possibile raggiungere alti tassi di maturazione dei complessi cumuli-oocici (COC) (intervallo da 60 a 90 %)3, la loro competenza di sviluppo è ancora inadeguata alle esigenze. Questo perché lo sviluppo degli zigoti ottenuti in modo tale anche fino allo stadio di blastocisti è basso e dopo il trasferimento in animali surrogati la loro vitalità a termine è ridotta. Di conseguenza, è necessario aumentare la competenza di sviluppo degli embrioni ottenuti da ovociti sottoposti alla procedura IVM4. Pertanto, nuovi mezzi dimaturazione 5 sono in fase di escogitazione e vengono testati vari periodi di coltura in vitro6,7 insieme al completamento dei mezzi di coltura con vari fattori di crescita e molecole8,9.
Il primo passo di qualsiasi sistema IVM completo è quello di creare condizioni ottimali per la crescita sostenibile degli ovociti durante la coltura in vitro. La crescita degli oocid è uno degli indicatori specifici della capacità dell'oocid di riprendere la meiosi10,11. Inoltre, un adeguato sistema di coltura in vitro deve essere in grado di sostenere la sua maturazione nucleare e la differenziazione citoplasmica12. La morfologia del complesso cumulus-oocid è un altro indicatore importante utilizzato nelle cliniche ART per selezionare il miglior ovocito per le successive fasi della fecondazione in vitro (IVF) procedura negli esseri umani e bestiame12,13. Tra le caratteristiche morfologiche dei COC considerati sono: il diametro degli oocici, la sua granulazione del citoplasma e la prima integrità del corpo polare14,15. Inoltre, il potenziale di sviluppo degli oocati è correlato all'aspetto e alla compattazione delle cellule cumuli e al numero dei loro strati che circondano l'ociocita. Molto importante per l'appropriato sistema di coltura in vitro di oociti è anche il mantenimento delle cellule oocite-cumulus interazioni corrette e la stabilità del citoscheletro16,17,18,19. Finora, la crescita degli oocici in vitro all'interno dei COC umani è stata dimostrata20. L'uso di COC di mucca ha portato anche a nascite vive. Questi sono stati isolati dai follicoli ovaiosi immaturi e poi colture per 14 giorni fino a quando l'ovocita era sufficientemente grande per sottoporsi alla procedura di fecondazionein vitro 21. Allo stesso modo, i COC isolati dai follicoli antrali del babbuino, sottoposti a IVM dopo che la coltura in vitro ha prodotto ovociti in grado di reinizializzare la meiosi allo stadio metafsie II con una normale struttura del mandrinoche appare 22. Tuttavia, in questo studio gli autori non hanno cercato di fertilizzarli. Tuttavia tali risultati indicano che una procedura simile potrebbe essere applicata non solo a queste specie di mammiferi particolari, ma anche a complessi umani cumuli-oociti ottenuti dai follicoli ciò che dovrebbe consentire di ottenere oociti di buona qualità adatti per una tecnica di fecondazione in vitro di successo.
I risultati descritti sopra sono stati ottenuti con l'applicazione di protocolli IVM convenzionali durante i quali gli ovociti sono stati colturati in sistemi bidimensionali (2D). La procedura di routine nei sistemi di coltura 2D copre gli oociti, immersi in una goccia di un supporto di coltura appropriato, con oliominerale 23,24. Si presume che una sovrapposizione di olio durante la coltura degli ovociti in vitro serva a prevenire l'evaporazione del liquido, garantendo così il mantenimento di un corretto pH e pressione osmotica nella coltura. Anche se un tale sistema di coltura 2D permette di ottenere, anche fino all'87% degli oociti di suini maturi25, è stato dimostrato che la sovrapposizione dell'olio minerale provoca una sostanziale diffusione di materiali lipidi solubili che sono necessari per un corretto sviluppo degli oociti26. Inoltre, a causa di steroidi (progesterone ed estrogeni) diffusione nell'olio minerale durante la coltura di ovociti, un ritardo della maturazione nucleare e la riduzione nella realizzazione di competenza dello sviluppo di ovociti di maiale è stato osservato. Ciò può comportare l'ottenimento di un piccolo numero di zigoti, che inoltre sono caratterizzati da bassa capacità di sviluppo allo stadio della blastocisti e da scarsa vitalità dopo il trasferimento negli animali destinatari27. Pertanto, si sta cercando di aumentare la competenza di sviluppo degli embrioni derivati dagli ovociti ricevuti dopo la procedura IVM, creando condizioni ottimali per raggiungere sia la maturità citoplasmica che nucleare degli ovociti ristrutti insieme ai CC come complessi, in particolare utilizzando sistemi tridimensionali (3D). Negli ultimi due decenni sono stati sviluppati vari sistemi innovativi di coltura in vitro 3D28,29. Questi sono stati progettati per mantenere l'organizzazione spaziale naturale delle cellule e per evitare il loro appiattimento nei piatti di coltura ciò che non può essere raggiunto nelle culture 2D tradizionali. L'attività strutturale e funzionale dei COC coltura può essere assicurata dal mantenimento della loro corretta architettura e dalla comunicazione indisturbata attraverso svincoli tra i varicompartimenti 30. L'idoneità delle bio-scaffold per la coltura in vitro 3D di complessi cumuli-oocici è stata valutata utilizzando biomateriali naturali come vari componenti della matrice extracellulale (ECM; collagene e acido ialuronico)31 o polimeri inerti (alginato)32. Questi tentativi testati in diverse specie hanno portato risultati promettenti in termini di ripresa della meiosi ooccia e realizzazione della loro piena competenza33,34,35. Tuttavia finora non è stato sviluppato alcun sistema 3D adatto alla maturazione di COC isolato da grandi animali domestici, compresi i suini.
Questo lavoro descrive due protocolli che possono essere utilizzati per la coltura 3D dei COC dei porci. Il primo protocollo descrive l'incapsulamento in perline fibrin-alginate (FAB). IL FAB può essere formato mescolando simultaneamente una soluzione di alginato e fibrina, che subisce un processo di gelazione sincrona. Questa combinazione fornisce un ambiente meccanico dinamico perché entrambi i componenti contribuiscono alla rigidità della matrice. Una soluzione simile è stata utilizzata in precedenza per la coltura e la maturazione dei follicoliovaioli del topo 36. Nel caso del protocollo presentato, per evitare la degradazione prematura della rete alginata-fibrina, vengono utilizzate concentrazioni opportunamente più elevate di soluzione di cloruro di calcio, garantendo un processo di gelazione veloce e stabile. L'ambiente meccanico dinamico crea condizioni simili a queste nell'ambiente intra-follicolare naturale in cui risiedono i COC e aumentano di dimensioni. Inoltre, il lavoro mostra i risultati rappresentativi dei sistemi di coltura 3D COC, in cui questi sono sospesi in una goccia di media e incapsulati con propilene di etilene fluorrerato (FEP; un copolimero di particelle di polvere di esafluoropropilene e tetrafluoroetilene), per formare microbioreattori (Marmi liquidi, LM). LM sono una forma di bioreactor 3D che sono stati precedentemente indicati per sostenere, tra gli altri, la crescita di microrganismiviventi 37, sferoidi tumorali38 e cellule staminali embrionali39. LM sono stati utilizzati con successo anche per la cultura degli ovocitiovini 40. Nella maggior parte degli esperimenti con LM, i bioreattori sono stati preparati utilizzando il letto in polvere di politetrafluoroetilene (PTFE) con dimensioni di particelle di 1 m41. Il protocollo presentato utilizza FEP, che è molto simile nella composizione e nelle proprietà ai fluoropolimeri PTFE. Ma FEP è più facilmente formabile e più morbido di PTFE e ciò che è particolarmente importante, è altamente trasparente.
Entrambi i sistemi 3D mantengono l'ambiente gassoso della coltura in vitro. Mantengono inoltre l'organizzazione 3D dei COC impedendo la loro appiattimento e la conseguente interruzione delle giunzioni gap, preservando la loro relazione funzionale tra l'ociocite e le cellule follicolari circostanti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le seguenti procedure sono state approvate dal Comitato per il benessere degli animali presso l'Istituto di zoologia e ricerca biomedica dell'Università Jagiellonian.
1. Isolamento dei complessi di cumuli-oociti di porcina
- Per raccogliere materiale per l'isolamento dei follicoli ovaitici, accise ovaie di porcine da dorati prepubertali (circa 6-7 mesi di età, del peso di 70-80 kg) in un macello locale. Scegli circa 20 ovaie di suini da 10 animali per l'isolamento dei COC in ogni esperimento.
NOTA: Supponendo che ogni ovaia produce 3-5 follicoli, il numero totale di follicoli varia da 60 a 100. - Collocare le ovaie in un thermos con salina sterile tamponata al fosfato (PBS; pH 7.4; 38 gradi centigradi) contenente 1% AAS. Assicurarsi che il materiale sperimentale venga trasportato in laboratorio entro 1 h dove viene risciacquato due volte con PBS sterili contenenti antibiotici.
- Dopo aver risciacquato le ovaie, trasferirle al becher riempito con il mezzo HM e conservarle in un'incubatrice a 38 gradi centigradi per il tempo di tutte le manipolazioni.
NOTA: Per ottenere risultati ottimali durante la movimentazione degli oocati, eseguire tutte le procedure nel mezzo DMEM/F12 (mezzo di movimentazione, HM) con l'aggiunta del 2,5% di soluzione antibiotica/antimicotica (AAS) e del siero bovino fetale al 10% (FBS) e controllare il pH a livello di CO2 nell'ambiente, su un tavolo riscaldante con controllo della temperatura (38 gradi centigradi) e sotto il cofano di lamina per ridurre al minimo la contaminazione batterica. - Da grandi follicoli di porcina (6-8 mm di diametro) raccogliere il liquido follicolare (FF) per aspirazione e centrifugazione a 100 x g per 10 min a temperatura ambiente. Dopo di che, filtrare il supernatant utilizzando siringa sterile attaccata a 0,2 filtri poro di membrana e bloccare a -80 gradi C.
NOTA: Utilizzare una siringa insulina (u- 40) per aspirare il liquido follicolare. - Assicurarsi che per l'isolamento 42 siano selezionati solo follicoli sani di medie dimensioni (4-6 mmdi diametro).
NOTA: I COC di grado I, in possesso di un ovocito intatto e rotondo con ooplasma omogeneo e cumulo compatto multistrato (almeno 3-4) sono considerati adatti per un'ulteriore procedura IVM 3D43. - Per isolare i COC, trasferire 2-3 ovaie in una piastra Petri sterile di 10 cm di diametro riempita con HM. Isolare i COC dai follicoli di medie dimensioni seguendo una delle procedure riportate di seguito.
- Tagliare delicatamente la superficie dei follicoli ovaiari sporgenti con una lama chirurgica sterile 15C. Questo farà sì che il liquido follicolare insieme ai COC fluisa nel piatto Petri.
- Aspirare il contenuto follicolare utilizzando l'ago da 28 G con una dimensione di 5/8" attaccata a una siringa usa e getta e trasferirla nel piatto Petri.
NOTA: Scartare i resti di tessuto ovarico. Le fasi successive di isolamento vengono eseguite sotto uno stereomicroscopio.
- Preparare 3-5 60 mm DIVF Petri piatti.
- Aggiungere 1 mL di HM ai pozzi centrali e posizionare 3-4 gocce di HM (50 L per goccia) nei loro anelli esterni.
- Quindi, utilizzando una micropipetta in policarbonato, spostare i COC intatti in gocce di HM negli anelli esterni per risciacmetterli brevemente per 3-4 volte.
- Alla fine, trasferirli individualmente nel pozzo centrale. Conservare queste piastre di fecondazione in vitro in un'incubatrice per ulteriori procedure.
- Dopo aver raccolto i COC, eseguire il passaggio di selezione finale assegnandoli in modo casuale in due diversi protocolli di incapsulamento IVM elencati di seguito.
2. Incapsulamento in perline idrogel fibrin-alginate
- Preparare 1 mL di 50 trombina IU/mL in salina tamponata Tris (TBS; pH 7.4) con 100 mM CaCl2 in un tubo sterile microcentrifuge da 2,0 mL.
- Preparare la soluzione di stock di fibrinogeno (50 mg/mL in TBS) e mantenerla congelata.
NOTA: Per evitare l'agglomerazione durante lo scioglimento del fibrinogeno in TBS, riscaldare TBS a 37 gradi centigradi.- Il giorno della procedura, scongelarlo lentamente sul ghiaccio e subito prima dell'uso portare a temperatura ambiente.
- Poco prima dell'uso mescolare ad un 1:1 rapporto 0.5% soluzione alginata e 50 mg/mL soluzione fibrinogen per ottenere finalmente 2 mL (FA). In un tubo sterile microcentrifuge vorre delicatamente la miscela. Evitare di fare bolle.
- Per preparare le "camere di incubazione", applicare sottili strisce di pellicole di paraffina ai vetrini del microscopio di vetro.
NOTA: Pulire le diapositive con 70 % EtOH prima dell'uso. Una camera di incubazione è formata con due diapositive. Per separarli, posizionare distanziali da 3 mm su uno di essi. - Pipette 7,5 gocce di 5 gradi della miscela FA su questo scivolo in vetro rivestito di pellicce, che ha anche distanziali separati. Su una diapositiva posto 8-10 gocce, disposti in due righe.
- Trasferire, utilizzando una micropipetta, 3-5 COC insieme a un volume minimo (fino a 5 L) di mezzo di maturazione (MM), e metterli precisamente al centro della caduta FA. Questa procedura richiede buone abilità manuali e precisione.
NOTA: Il mezzo di maturazione (MM) è costituito da DMEM/F12, integrato con 10 IU/mL PMSG, 10 IU/mL hCG, 10% FBS e 50% di liquido follicolare porcine (FF) raccolto nel punto 1.4. - Aggiungere 7,5 L di soluzione tromba/Ca2 su ogni goccia FA, solo per coprirli. Non c'è bisogno di mescolarli perché il gel si forma quasi istantaneamente.
- Coprire la camera di incubazione applicando il secondo vetrate di vetro precedentemente preparato alle capsule FA. Con un movimento molto attento ma fermo, capovolgere la camera e posizionarla in un piatto Petri da 100 mm foderato con carta da filtro umida per evitare l'essiccazione.
- Quindi, trasferire il piatto Petri all'incubatrice 5% CO2 (38 gradi centigradi) per circa 5-7 min. Dopo questo, capsule FA diventerà nuvoloso a causa della gelazione simultanea di fibrina e alginato.
- Trasferire le capsule FA in 96 piastre di pozzo (una capsula per pozzo) contenenti 100 MM di L per pozzo.
NOTA: Per non danneggiare le capsule FA formate, eseguire questo passaggio con attenzione con l'uso di forcetti chirurgici. - Ogni 2 giorni si sostituisce metà dell'MM (50 L) con uno fresco e pre-equilibrato. COC immagine utilizzando un microscopio a luce invertita (a 10 volte l'ingrandimento).
NOTA: Condizioni di coltura per la coltura COCs FA: 38 gradi centigradi, sotto un'atmosfera di CO2 del 5% e umidità relativa 95%. Dopo 4 giorni di IVM, gli idrogel appaiono quasi chiari a causa del progressivo degrado della componente fibrina. L'alginato rimanente dovrebbe essere degradato in modo enzimatico - da alginato-lyase, un enzima derivato dalle piante che degrada specificamente l'alginato e non colpisce le cellule animali.- Togliere MM dai pozzi contenenti le capsule e aggiungere 100 L di 10 IU/mL alginate lyase in DMEM. Lasciare il piatto di coltura nell'incubatrice per 25-30 min.
- Rimuovere i COC dalle capsule disciolte.
NOTA: Questo può essere fatto con una punta di pipetta di taglio. - Dopo diversi lavaggi in un DMEM fresco, trasferire i COC nell'anello interno di un piatto di fecondazione in vitro (5-10 COC per piatto) contenente PBS. Ora, usarli per ulteriori analisi morfologiche o biochimiche.
3. Incapsulamento in microbioreattori di etilene etilene fluororo super-idrofobico (FEP).
NOTA: Assicurarsi che tutte le procedure IVM siano eseguite su tavolo termostatico controllato e coC sono mantenuti a 38 gradi centigradi per tutta la loro movimentazione.
- Preparare un piatto Petri da 30 mm contenente 5 g di particella media fepa in polvere di 1 m.
NOTA: È importante utilizzare polvere FEP fresca. Il FEP ri-utilizzato tende ad aggregare e forma grumi. - Distribuire un singolo goccioline di MM (volume di 30 L) contenente 3-5 COC isolati al punto 1.6 sul letto della polvere FEP. Ruotare delicatamente la piastra con un movimento circolare per assicurarsi che queste particelle coprise la superficie della goccia liquida e delle biglie liquide formate (LM).
- Raccogliere LM formata utilizzando una pipetta con punta da 1.000 L.
NOTA: Tagliare la punta della pipetta sul bordo, per adattarla al diametro del LM (4-5 mm). Il diametro approssimativo di tale punta preparata dovrebbe essere leggermente superiore a quello della LM. - Preparare diversi piatti di 60 mm IVF Petri. Aggiungere 3-4 mL di acqua sterile agli anelli esterni per preparare la camera di umidità. Successivamente, inserire un LM nel pozzo centrale.
NOTA: Questa procedura richiede buone abilità manuali e precisione - se il marmo è posizionato con noncura o cade anche da una bassa altezza sarà distrutto. - Incubare i marmi per 4 giorni a 38 gradi centigradi nell'incubatrice CO2 del 5 %.
- Cambiare il mezzo ogni giorno seguendo la procedura: applicare 30 L di MM su ogni LM, che causerà la loro diffusione perché il contatto liquido diretto interrompe l'idrofobicità delle polveri FEP rivestite. Quando il contenuto di marmo si dissolve, trasferire i COC rilasciati dal bioretettore in una goccia di MM fresco nel piatto Petri.
NOTA: Per trasferire con precisione i COC rilasciati, utilizzare una micropipetta in policarbonato. - Dopo diversi lavaggi in MM (3-4 volte) per rimuovere le particelle FEP, trasferirle con 30 L di MM fresco sul letto in polvere FEP. Ruotare delicatamente la piastra con un movimento circolare per garantire che le particelle di polvere coprise la superficie della goccia liquida e formi un nuovo LM.
- Seguire quindi la procedura descritta nei passaggi 3.3-3.4.
NOTA: Il rivestimento trasparente della polvere FEP consente di monitorare il contenuto LM utilizzando il microscopio leggero.
- Cambiare il mezzo ogni giorno seguendo la procedura: applicare 30 L di MM su ogni LM, che causerà la loro diffusione perché il contatto liquido diretto interrompe l'idrofobicità delle polveri FEP rivestite. Quando il contenuto di marmo si dissolve, trasferire i COC rilasciati dal bioretettore in una goccia di MM fresco nel piatto Petri.
4. Caratterizzazione dei COC dopo la procedura IVM 96-h utilizzando due sistemi 3D
NOTA: Per determinare l'efficienza dei sistemi IVM utilizzati, segnare i COC morfologicamente al microscopio leggero. Inoltre, utilizzare doppia etichettatura fluorescente con calceina AM e coloranti ethidium homodimer (EthD-1) per l'analisi della vitalità COCs44.
- Esame morfologico degli ovociti dopo l'IVM mediante microscopia a fluorescenza e luce.
- Lavare i CC (sia quelli derivati dalla coltura che da LM) con 38 C 1x PBS.
NOTA: Per facilitare la movimentazione dei COC e non danneggiarli durante la procedura di colorazione, utilizzare una piastra di 96 o 48 pozzi ed eseguire ogni fase di colorazione trasferendo i CRC ai pozzi successivi. - Incubarli in 100 l di 1,6 mM calcein AM e 5,5 mM EthD-1 per 30-45 min a 37 gradi centigradi. Diluire entrambe le sostanze in 1x PBS.
NOTA: Poiché si tratta di un'analisi della fluorescenza a due colori, eseguire questo passaggio al buio. - Dopo l'incubazione, lavare il COC due volte in PBS e poi immergerlo in un mezzo di montaggio antifade progettato per prevenire una rapida fototrasta di proteine fluorescenti e coloranti fluorescenti (Tabella dei materiali).
NOTA: Proteggere i bordi del vetro di copertura contro l'essiccazione con qualsiasi smalto. - Visualizza campioni macchiati sotto un microscopio a scansione laser confocale.
NOTA: Per eccitare la fluorescenza di entrambe le sonde (ad esempio, calceina ed ethidium homodimer-1, EthD-1) sintonizzare un laser argon a 488nm. La fluorescenza emessa è separata da un filtro tripico dicroico 488/561/633 e quindi misurata a 505-570 nm per quella verde (calceina) e a 630-750 nm per quella rossa (EthD-1). - Classificare i COC in quattro categorie, utilizzando la classificazione modificata applicata ai follicoli ovarici in coltura basata sull'imaging a fluorescenza confocale a seconda della percentuale di cellule di granulosa morte35. V1: COC con CC stimati al 100% vitali; V2: COC con il 10% dei CC morti; V3: COC con il 10-50% dei CC morti; V4: COC con il 50% dei CC morti.
NOTA: Tecnicamente, è difficile valutare la fattibilità dell'ociocite con il saggio vivo-morto; pertanto, dovrebbe essere stimato, ad esempio, analizzando l'ultrastruttura mitocondriale o l'attività.
- Lavare i CC (sia quelli derivati dalla coltura che da LM) con 38 C 1x PBS.
- Esame dell'ultrastruttura degli ovociti dopo l'IVM mediante microscopia elettronica a trasmissione.
- Fissare i COC in 100 L 2,5% di glutaraldeide in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,2, temperatura ambiente) per 2 h.
- Immergere i COC in un buffer cacodylate di sodio da 0,1 M (durante la notte a 4 gradi centigradi) e risciacre nello stesso buffer.
- CoC di suffisso con 1% di tetroxide di oscio in tampone cacodylato di sodio (temperatura ambiente) per 1 h.
- Dopo la colorazione nell'acetato di uranil (1%), i COC disidratano in una serie crescente di diluizioni di etanolo (50%, 60%, 70%, 90% e 100%), infiltrarli durante la notte a temperatura ambiente, seguiti da due brevi cambiamenti di resina e, infine, incorporarli in LR White.
- Successivamente, per orientare e valutare i campioni, macchiare le sezioni semi-sottili (1 m) con blu di metilene/azzurro II.
- Infine, esaminare le sezioni ultrasososore, doppiamente macchiate a livello ultrastrutturale con il TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nei COC che utilizzano entrambi i sistemi IVM, le cellule granulosa si aderiscevano strettamente l'una all'altra e la maggior parte dei COC recuperati aveva strati intatti di cellule cumuli(Figura 1A,B). Inoltre, sono state mantenute una parte sostanziale delle cellule cumuli.
I risultati ottenuti dall'analisi della fattibilità dei CFC hanno confermato che entrambi i sistemi applicati per l'incapsulamento degli oociti di suina in condizioni in vitro 3D hanno garantito condizioni di crescita ottimali (Figura 2). In entrambi i gruppi sono stati osservati solo oociti ad alta vitalità, V1 - 13 %, V2 - 87 % per FAB e 10 % V1 e 90 % V2 per LM, rispettivamente (tabella 1).
I mitocondri, osservati dalla microscopia elettronica a trasmissione (TEM), sono stati distribuiti uniformemente negli ovociti, la loro forma dopo che l'IVM era simile auna conchiglia 45. Solo alcuni di essi sono stati allungati, inoltre, il loro raggruppamento è stato osservato sporadicamente (Figura 1C,D). È stato osservato il reticolo endoplasmico, associato ai mitocondri o libero nel citoplasma oocito. Le goccioline di lipidi sono apparse come piccole strutture rotonde scure e l'apparato Golgi sono emersi con cisterne dilatate(Figura 1C,D).
| V1 | V2 | V3 | V4 | ||||
| % | Numero | % | Numero | % | Numero | % | |
| Favoloso | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| CoC numero totale: 144 | 16a | 128b | 0 | 0 | |||
Tabella 1. Risultati sulla fattibilità dei COC dopo l'incapsulamento utilizzando perline fibrin-alginate (FAB) e microbioreattori FEP, Marmi Liquidi (LM). I risultati sono stati dati in media. I valori con apico (a, b) differivano statisticamente in modo significativo (p <0.05).
Figura 1: Immagini rappresentative che mostrano la morfologia e l'ultrastruttura dei COC dopo 96 h di incapsulamento. (A) morfologia dei COC all'interno di FAB - microscopia leggera; (B) morfologia dei COC all'interno di LM - microscopia leggera; C: ultrastruttura oocita (TEM) dopo la coltura in vitro all'interno di FAB; D: ultrastruttura ovocita (TEM) dopo la coltura in vitro all'interno di LM. O: oocita; CC: cellule cumuli; P: zona pellucida; N: nucleo; M: mitocondri; G: Apparato Golgi; ER: reticolo endoplasmico; Lp: goccia lipidico; FA: filamenti alginati e fibrin; FEP: polvere di copolymer di esafluoropropylene e tetrafluoroetilene. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini fluorescenti rappresentative dei COC dopo 96 h di incapsulamento. (A,B) Le immagini ottenute per gli stessi COC dopo la coltura in vitro utilizzando FAB con due filtri per visualizzare la fluorescenza verde o la fluorescenza rossa per le cellule vive o morte rispettivamente e (C) si fondono di entrambi. (D,E) Le immagini ottenute per gli stessi COC dopo la coltura in vitro utilizzando LM con due filtri per visualizzare la fluorescenza verde o la fluorescenza rossa per le cellule vive o morte, rispettivamente e (F) si fondono di loro. Barre di scala di 50 m. Gli asterischi bianchi indicano le celle sottoposte a apoptosi. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La capacità di mantenere la crescita in vitro non solo dell'oocito, ma anche delle cellule cumuli che la circondano e contemporaneamente sostenere la sua maturazione è estremamente essenziale per le tecnologie di riproduzione assistita di successo e per promuovere la comprensione delle interazioni cellulare/oocite somatiche soprattutto nelle specie che subiscono una crescita follicolare prolungata come gli esseri umani o i maiali. Tecniche IVM continuamente migliorate stanno diventando uno strumento utile per preservare le opzioni riproduttive nei casi di sindrome dell'ovaio policistico (PCOS), insufficienza ovarica prematura o infertilità definitiva (oncoterapia). Inoltre, poiché alcune disfunzioni ovariche potrebbero essere causate da una crescita follicolare disregolata, comprendere i meccanismi molecolari e cellulari che controllano il corretto sviluppo dell'ociocita può fornire importanti informazioni sulla fisiofisiologia e sul trattamento razionale di queste condizioni. I sistemi di coltura in vitro che supporterebbe il mantenimento dell'architettura 3D COC durante IVM, richiedono una fase di incapsulamento in una matrice o all'interno di un bioreactor. Questo lavoro descrive un protocollo che può essere applicato per la cultura degli oociti di suno. Entrambi i sistemi di coltura in vitro 3D presentati qui per indurre la crescita e lo sviluppo di COC di porcine sono user-friendly e consentono il controllo efficace della sopravvivenza delle cellule oociti e cumuli.
Il primo metodo di coltura in vitro dei COC che utilizzano il loro incapsulamento in perline idrogel fibrin-alginate (FAB) qui presentate consente una crescita degli oocici 3D in un ambiente a matrice attivamente reattivo alle cellule. Protocolli precedentemente pubblicati basati su idrogel alginati sono stati di solito utilizzati per lo studio dello sviluppo di follicoli ovaiari isolati da numerose specie animali con risultati molto promettenti32. È interessante notare che, indipendentemente dalla composizione finale dell'alginato idrogel32 o il metodo di incapsulamento stesso46, questi studi hanno dimostrato che i sistemi di coltura 3D a base di perline alginate sono stati in grado di sostenere la crescita follicolare e la loro sopravvivenza.
Gli idrogel alginati erano delicati sui follicoli, non influenzando la loro ulteriore sopravvivenza o sviluppo in vitro. Allo stesso modo, il protocollo di coltura in vitro dei COC descritto per la prima volta qui, è adatto a generare ovociti di maiale di buona qualità, come è stato documentato sia a livello morfologico che ultrastrutturale. La presenza di fibrinogeno in una soluzione alginata e la loro gelling simultanea, si traduce nella formazione di una rete interpenetrata che crea e stabilizza ulteriormente l'ambiente tridimensionale. A causa del supporto strutturale specifico all'interno di tale matrice, i contatti tra cellule e la comunicazione paraclina tra ovociti e cellule cumuli sono mantenuti in modo simile a questi presenti in vivo.
I due passaggi più critici del protocollo di maturazione descritto in questo documento sono il trasferimento delle capsule FA dalle camere di incubazione in piastre da 96 ben contenenti MM (passo 2.10.) e la rimozione dei CFC dalle capsule disciolte dopo la degradazione ezimatica dell'alginato rimanente, utilizzando lyase alginata (passaggio 2.11.). Entrambi i passaggi richiedono una significativa abilità manuale e precisione per evitare, nel primo caso la distruzione delle capsule, nel secondo - danni ai COC.
La forza principale di questo metodo, oltre a stabilire condizioni ottimali per la maturazione dell'ovocita di un grande animale domestico, è che durante l'analisi utilizzando TEM, microscopia leggera o microscopia confocale, non è necessaria alcuna rimozione della capsula. Alginate non è una barriera quando si imaging. Lasciare COC in capsule facilita la manipolazione durante la procedura di colorazione.
La seconda coltura in vitro COC qui presentata è quella con l'uso di LM, che generalmente sono goccioline antiaderente coperte da particelle micro-scalate e ottenute semplicemente rotolando piccoli volumi di un liquido in una polvere molto idrofobica47. Precedenti studi con l'uso di LM per la coltura, tra gli altri fibroblasti48,globuli rossi 49, organoide di un tumore38, cellule pancreatiche50 o oociti di pecora36 sono stati eseguiti utilizzando politetrafluoroetilene (PTFE) come polimero idrofobico per la preparazione delle goccioline. PTFE è ampiamente usato nella clinica (ad es. innesti cardiovascolari).
In questo lavoro, presentiamo, per la prima volta, un metodo affidabile per microbioreattori fatti di particelle FEP per la coltura in vitro di COC di suini. L'uso di FEP nel protocollo presentato, che è molto simile nella composizione e nelle proprietà al PTFE, rende la preparazione di LM molto più facile. Questa polvere è più morbida di PTFE e ciò che è particolarmente importante, è trasparente. Questo a sua volta semplifica il lavoro durante l'imaging di strutture culture con il suo utilizzo. La facilità di formare LM utilizzando FEP è un netto vantaggio di questo metodo.
Il passo più critico del protocollo di maturazione descritto in questo documento è la raccolta e il trasferimento di LM in una piastra DivF Petri da 60 mm utilizzando una punta di pipetta (passaggi 3.3. e 3.4.). Questi passaggi richiedono una notevole abilità manuale e precisione per evitare la distruzione di LM.
Forse, la limitazione principale dei protocolli di induzione di maturazione ovocito 3D presentati qui è la difficoltà relativamente grande nell'ottenere un adeguato materiale di ricerca raccolto da animali non trattati con antibiotici, steroidi anabolizzanti (cioè, nadrolone, boldenone) o acetato di melengestrol che promuovono la loro rapida crescita. Questi steroidi, nonostante il loro uso sia vietato in Europa, sono ancora ampiamente utilizzati nell'allevamento di bestiame industriale durante gli ultimi due mesi del periodo di ingrasso, che provoca, tra gli altri, la maturazione sessuale disturbata.
In conclusione, entrambi i sistemi 3D qui presentati mantengono l'ambiente di coltura in vitro gassoso ottimale. Mantengono inoltre l'organizzazione 3D dei COC impedendo la loro appiattimento e la conseguente interruzione delle giunzioni di gap, preservando così la relazione funzionale tra l'ociocita e le cellule follicolari circostanti, ciò che è fondamentale per una corretta maturazione degli oocici. Pertanto, entrambi i modelli sono uno strumento prezioso per la ricerca di base nella biologia riproduttiva e possono anche avere rilevanza clinica, portando a un migliore trattamento dell'infertilità. Inoltre, possono anche essere applicati per lo sviluppo di nuovi metodi biotecnologici, nonché per il miglioramento del bestiame.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori sono molto grati a: Dr Waclaw Tworzydlo (Dipartimento di Biologia dello Sviluppo e Morfologia Invertebrata, Istituto di zoologia e ricerca biomedica, Università Jagiellonian) per strutture tecniche in TEM; beata Snakowska (Dipartimento di Endocrinologia, Istituto di zoologia e ricerca biomedica dell'Università jagielloniana) per assistenza tecnica; al Dipartimento di Biologia Cellulare e Imaging, Istituto di zoologia e ricerca biomedica, Università Jagielloniana, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Giappone). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzione 2018/29/N/N/N/00983 dal National Science Centre Polonia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
References
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L.
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T.
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D.
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).
