Summary
Burada 3D kültür koşullarında domuz oositkapsülasyonu için iki protokol sunulmuştur. İlk olarak, kümülüs-oosit kompleksleri (COCs) fibrin-aljinat boncuklar kapsüllenir. İkincisi, florlu etilen propilen toz parçacıkları (mikrobiyoreaktörler) ile çevrilidir. Her iki sistem de 3B organizasyonlarını sürdürmek için en uygun koşulları sağlar.
Abstract
Üreme biyolojisinde, suni döllenme ve embriyo transfer teknolojisi ile başlayan biyoteknoloji devrimi, yumurta tüp bebek olgunlaşma (IVM), tüp bebek (IVF) ve somatik hücreden nükleer transfer ile evcil hayvanların klonlanması gibi yardımcı üreme tekniklerinin geliştirilmesine yol açmıştır. IVM özellikle önem eger bir yöntemdir. Ticari olarak önemli veya nesli tükenmekte olan türlerde üretim aralığının azaltılması, in vitro insan üremesi ile ilgili araştırmalar ve hücre tedavileri için transgenik hayvanların üretimi gibi uygulamalar için olgun, kaliteli oositlerin tedariki için platform teknolojisidir. Yumurta kalitesi terimi olgunlaşmayı tamamlama, döllenme ve sağlıklı yavrular olma yetkinliğini içerir. Bu iyi kalitede oositler IVF prosedürleri de dahil olmak üzere başarılı döllenme için her şeyden önemli olduğu anlamına gelir. Bu, sadece insan yumurtalarının değil, diğer büyük memeli türlerinin de büyümesini destekleyecek güvenilir bir kültür yöntemi geliştirmekte birçok zorluk teşkil eder. IVM'de ilk adım yumurtaların in vitro kültürüdür. Bu çalışma, domuz yumurtası 3D kültür için iki protokol açıklar. İlk olarak, 3D model kümülüs kompleksleri (COCs) bir fibrin-aljinat boncuk interpenetrating ağ kapsüllenir, hangi fibrin ve aljinat karışımı aynı anda jellenir. İkincisinde, COC'lar bir damla orta alanda askıya alınır ve sıvı mermerler (LM) olarak tanımlanan mikrobiyoreaktörleri oluşturmak için florürlü propilen (FEP; heksofloropropilen ve tetrafloroetilen kopolimeri) ile kapsüllenirler. Her iki 3D sistem de gaz tüp bebek kültür ortamını korur. Ayrıca, boşluk kavşaklarının düzlemesini ve bunun sonucu olarak bozulmalarını önleyerek, yumurta ve çevresindeki foliküler hücreler arasındaki işlevsel ilişkiyi koruyarak COCs 3D organizasyonunu sürdürürler.
Introduction
Üç boyutlu (3D) olanlar da dahil olmak üzere çeşitli kültür sistemlerinin geliştirilmesi, gelişimin en erken aşamalarında bile foliküllerden izole edilen yumurtaların büyümesi ve olgunlaşması için en uygun koşulları sağlamayı amaçlamaktadır. Bu yardımlı üreme teknikleri için büyük önem taşımaktadır (ART), özellikle kanser tedavisi sonrası kısırlık ile mücadele eden kadınların artan sayıda görünümünde1. In vitro koşullarda yumurtaların olgunlaşması (IVM) zaten hayvancılık üreme amacıyla in vitro embriyo üretimi için kullanılan iyi kurulmuş bir tekniktir2. Ancak, çoğu memeli türünde, kümülüs-oosit komplekslerinin (COC) yüksek olgunlaşma oranları elde edilebilse bile (dağılım %60-90)3,gelişimsel yeterlilikleri hala ihtiyaçlara yetersizdir. Bunun nedeni blastosist evresine kadar bile böyle bir şekilde elde edilen zigotların gelişiminin düşük olması ve vekil hayvanlara aktarılmasından sonra dönemsel canlılıklarının azalmasıdır. Sonuç olarak, IVM prosedürüne tabi tutulan yumurtalardan elde edilen embriyoların gelişimsel yeterliliğinin arttırılması gerekmektedir4. Bu nedenle, yeni olgunlaşma medya5 ve in vitro kültürün çeşitli dönemlerde test edilmektedir6,7 çeşitli büyüme faktörleri ve molekülleri ile kültür medya takviyesi ile birlikte8,9.
Herhangi bir komple IVM sisteminin ilk adımı in vitro kültür sırasında yumurtasürdürülebilir büyüme için en uygun koşulları oluşturmaktır. Oosit büyümesi, yumurtanın10,11numaralı mayaya devam etme yeteneğinin belirli göstergelerinden biridir. Buna ek olarak, uygun bir oosit in vitro kültür sistemi nükleer olgunlaşma ve sitoplazmik farklılaşma12destekleyen yeteneğine sahip olmalıdır. Kümülüs-oosit kompleksinin morfolojisi, insan ve hayvanda in vitro fertilizasyon (IVF) prosedürünün sonraki adımları için en iyi yumurtayı seçmek için ART kliniklerinde kullanılan bir diğer önemli göstergedir12,13. Düşünülen COC'ların morfolojik özellikleri arasında: yumurta çapı, sitoplazma granülasyonu ve ilk polar vücut bütünlüğü14,15. Ayrıca, yumurta gelişim potansiyeli kümülüs hücrelerinin görünümü ve sıkıştırma ve yumurta çevreleyen tabakalarının sayısı ile ilişkilidir. Çok uygun oosit in vitro kültür sistemi için önemli de oosit-kümülüs hücrelerinin uygun etkileşimleri ve sitoiskelet istikrar16,17,,18,19bakım . Şimdiye kadar, insan COCs içinde in vitro oosit büyümegösterilmiştir 20. İnek COC'lerinin kullanımı da canlı doğumlarla sonuçlandı. Bu olgunlaşmamış yumurtalık folikülleri izole edildi ve daha sonra 14 gün boyunca kültüre kadar oosit ivf prosedürü21geçmesi için yeterince büyüktü . Benzer şekilde, in vitro kültür den sonra IVM tabi babun antral folikülleri izole COCs normal görünen iğ yapısı ile metafaz II aşamasına mayiosis reinitiating yeteneğine sahip oositler verdi22. Ancak bu çalışmada yazarlar onları döllemeye çalışmadı. Yine de bu tür sonuçlar, benzer bir prosedürün sadece bu memeli türlerine değil, aynı zamanda foliküllerden elde edilen insan kümülüs-oosit komplekslerine de uygulanabileceğini göstermektedir.
Yukarıda açıklanan sonuçlar, yumurtaların iki boyutlu (2D) sistemlerde kültürlendiği konvansiyonel IVM protokollerinin uygulanması ile elde edilmiştir. 2D kültür sistemlerinde rutin prosedür, uygun bir kültür ortamının bir damla batırılmış, mineral yağ23,,24ile oositler kapsayan . Bu in vitro oosit kültürü sırasında bir yağ bindirme sıvı buharlaşmayı önlemek için hizmet, böylece kültürde uygun pH ve ozmotik basınç bakımı sağlanması kabul edilir. Böyle bir 2D kültür sistemi elde etmek için izin rağmen, olgun domuz oositlerin bile% 87 kadar25, bu mineral yağ bindirme uygun yumurta gelişimi için gerekli olan lipid çözünür malzemelerin önemli difüzyon neden olduğu kanıtlanmıştır26. Ayrıca, yumurta kültürü sırasında mineral yağiçine steroidler (progesteron ve östrojenler) difüzyon nedeniyle, nükleer olgunlaşma bir gecikme ve domuz yumurtalarının gelişimsel yeterlilik başarı azalma gözlenmiştir. Bu zigotaz sayıda elde neden olabilir, ayrıca blastosist aşamasına düşük gelişim kapasitesi ile karakterizedir ve alıcı hayvanlara aktarılan sonra kötü canlılık ile27. Bu nedenle, IVM prosedürü nden sonra alınan yumurtalardan elde edilen embriyoların gelişimsel yeterliliğini artırmak için, özellikle üç boyutlu (3D) sistemler kullanılarak, kompleks olarak C'lerle birlikte kültüre sahip yumurtaların hem sitoplazmik hem de nükleer olgunluğa ulaşması için en uygun koşulları yaratarak girişimler yapılmaktadır. Çeşitli yenilikçi 3D in vitro kültür sistemleri son yirmi yılda28,,29geliştirilmiştir. Bunlar, hücrelerin doğal uzamsal organizasyonunu sürdürmek ve geleneksel 2B kültürlerde elde edilemeyen kültür yemeklerinde düzleştirmelerini önlemek için tasarlanmıştır. Kültürlü COC'ların yapısal ve işlevsel aktivitesi, uygun mimarilerinin sürdürülmesi ve çeşitli bölmeler arasındaki boşluk kavşakları aracılığıyla kesintisiz iletişim ile sağlanabilir30. Kümülüs-oosit komplekslerinin 3D in vitro kültürü için biyo-iskelelerin uygunluğu ekstra-hücre dışı matriks (ECM; kollajen ve hyaluronik asit)31 veya inert polimerler (aljinat)32gibi doğal biyomalzemeler kullanılarak değerlendirilmiştir. Çeşitli türlerde test edilen bu girişimler, yumurta lı kekozisin yeniden başlaması ve tam yeterliliklerinin elde edilmesini açısından umut verici sonuçlar almıştır33,34,35. Ancak şimdiye kadar, domuzlar da dahil olmak üzere büyük evcil hayvanlardan izole COCs olgunlaşma için uygun hiçbir 3D sistem geliştirilmiştir.
Bu çalışma, domuz COCs 3D kültür için kullanılabilecek iki protokolleri açıklar. İlk protokol de fibrin-aljinat boncuklarda (FAB) kapsülleme tanımlanır. FAB eşzamanlı bir aljinat ve fibrin çözeltisi karıştırma tarafından oluşturulabilir, hangi bir senkron jelleşme sürecinden geçmesi. Her iki bileşen de matris sertliğine katkıda bulununca, bu kombinasyon dinamik bir mekanik ortam sağlar. Benzer bir çözüm daha önce fare yumurtalık folikül kültürü ve olgunlaşma36için kullanılmıştır. Sunulan protokolde, aljinat-fibrin ağının erken bozulmasını önlemek için, hızlı ve istikrarlı bir jelleşme süreci sağlayarak uygun şekilde daha yüksek kalsiyum klorür çözeltisi konsantrasyonları kullanılır. Dinamik mekanik ortam, COC'lerin bulunduğu ve boyutlarının arttığı doğal foliküler ortamda buna benzer koşullar yaratır. Buna ek olarak, çalışma, mikrobiyoreaktörler (Sıvı Mermerler, LM) oluşturmak için, ortam bir damla askıya alınan ve florlu etilen propilen (FEP; heksofloropropilen ve tetrafloroetilen kopolimer) toz parçacıkları ile kapsüllenmiş cocs 3D kültür sistemlerinin temsili sonuçlarını göstermektedir. LM daha önce destek gösterilmiştir 3D biyoreaktör bir formudur, diğerleri arasında, yaşayan mikroorganizmaların büyüme37, tümör sferoidler38 ve embriyonik kök hücreler39. LMs de başarıyla koyun yumurta kültürü40için kullanılmıştır. LM'ler kullanılarak yapılan deneylerin çoğunda biyoreaktörler 1 μm41partikül boyutuna sahip politetrafloroetilen (PTFE) toz yatağı kullanılarak hazırlanmıştır. Sunulan protokol, floropolimerler PTFE'ye kompozisyon ve özellikleri çok benzer olan FEP'i kullanır. Ama FEP ptfe daha kolay biçimlenebilir ve yumuşak ve ne özellikle önemlidir, son derece şeffaftır.
Her iki 3D sistem de gaz tüp bebek kültür ortamını korur. Ayrıca, oosit ve çevresindeki foliküler hücreler arasındaki işlevsel ilişkiyi koruyarak, boşluk kavşaklarının düzlemesini ve bunun sonucu olarak bozulmasını önleyerek COCs 3D organizasyonunu sürdürürler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki prosedürler Jagiellonian Üniversitesi Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Domuz kümülüs-oosit komplekslerinin izolasyonu
- Yumurtalık foliküllerinin izolasyonu için malzeme toplamak için, prepubertal yaldızlardan (yaklaşık 6-7 aylık, 70 ila 80 kg ağırlığında) yerel bir mezbahada domuz yumurtalıkları için malzeme toplamak. Her deneyde COC izolasyonu için 10 hayvandan yaklaşık 20 domuz yumurtalığı seçin.
NOT: Her yumurtalığın 3-5 folikül verdiğini varsayarsak, toplam folikül sayısı 60 ile 100 arasında değişir. - Yumurtalıkları steril fosfat tamponlu salin (PBS; pH 7.4; 38 °C) %1 AAS içeren bir termosa yerleştirin. Deney materyalinin 1 saat içinde laboratuvara taşındığından emin olun ve burada iki kez antibiyotik içeren steril PBS ile durulanır.
- Yumurtalıkları duruladıktan sonra, hm orta ile dolu beher aktarın ve tüm manipülasyonlar zaman için 38 °C'de bir kuvözde saklayın.
NOT: Oosit işleme sırasında en iyi sonuçlar için, %2,5 antibiyotik/antimikotik solüsyon (AAS) ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ilavesi ile DMEM/F12 ortamında (işleme ortamı, HM) tüm prosedürleri uygulayın ve pH'ı ortamdaKI CO2 düzeyinde, sıcaklık kontrolü (38 °C) ve bakteriyel kontaminasyonu en aza indirmek için laminar kaputunun altında kontrol edin. - Büyük domuz foliklerinden (6-8 mm çapında) oda sıcaklığında 10 dk için 100 x g'de aspirasyon ve santrifüj ile foliküler sıvı (FF) toplanır. Bundan sonra, 0,2 μm membran gözenek filtreleri bağlı steril şırınga kullanarak supernatant filtre ve -80 ° C'de snap dondurma.
NOT: Foliküler sıvıa aspirasyon için insülin şırınga (u- 40) kullanın. - CO'ların izolasyonu için sadece sağlıklı, orta büyüklüktefoliküllerin (4-6 mm çapında) seçildiğinden emin olun42.
NOT: Homojen ooplazmalı ve çok katmanlı (en az 3-4) kompakt kümülüs ile bozulmamış ve yuvarlak oosit esahip grade I'nin COC'leri daha fazla 3D IVM prosedürü için uygun kabul edilir43. - COC'leri izole etmek için, 2-3 yumurtalıkları HM ile doldurulmuş steril 10 cm çapındaki Petri kabına aktarın. Aşağıdaki prosedürlerden birini izleyerek COC'leri orta büyüklükteki foliküllerden izole edin.
- Çıkıntılı yumurtalık foliküllerinin yüzeyini steril cerrahi bıçak 15C ile hafifçe kesin. Bu, cocs ile birlikte foliküler sıvı Petri kabına dışarı akmasına neden olacaktır.
- Tek kullanımlık şırıngaya bağlı 5/8" boyutuna sahip 28 G iğne kullanarak foliküler içeriği aspire edin ve Petri kabına aktarın.
NOT: Yumurtalık dokusu kalıntılarını atın. İzolasyonun sonraki aşamaları stereomikroskop altında gerçekleştirilir.
- 3-5 60 mm IVF Petri yemekleri hazırlayın.
- Merkezi kuyulara 1 mL HM ekleyin ve dış halkalarına 3-4 damla HM (damla başına 50°L) yerleştirin.
- Daha sonra, bir polikarbonat mikropipet kullanarak, 3-4 kez kısa bir süre durulamak için dış halkalar HM damla hasarsız COCs taşıyın.
- Sonunda, ayrı ayrı merkezi kuyuya aktarın. Daha fazla işlem için bu IVF plakaları bir kuvözde saklayın.
- COC'ler toplandıktan sonra, bunları aşağıda listelenen iki farklı IVM kapsülleme protokolüne rasgele atayarak son seçim adımını gerçekleştirin.
2. Fibrin-aljinat hidrojel boncuklarda kapsülleme
- Tris-tamponlu salin (TBS; pH 7.4) 2.0 mL steril mikrosantrifüj tüp1 mL 50 IU / mL trombin hazırlayın.
- Fibrinojen stok çözeltisi (TBS'de 50 mg/mL) hazırlayın ve dondurulmuş halde tutun.
NOT: TBS'de fibrinojeni eriterken kümelenmeyi önlemek için TBS'yi 37 °C'ye ısıtın.- İşlem günü, buz üzerinde yavaşça eritin ve kullanım oda sıcaklığına getirmeden hemen önce.
- Kullanımdan hemen önce karışım 1:1 oranında %0.5 aljinat çözeltisi ve 50 mg/mL fibrinojen çözeltisi sonunda 2 mL (FA) elde etmek için kullanılır. Steril bir mikrosantrifüj tüp yavaşça karışımı girdap. Kabarcıklar yapmaktan kaçının.
- "Kuluçka odaları" hazırlamak için, cam mikroskop slaytlar parafin filmleri ince şeritler uygulayın.
NOT: Slaytları kullanmadan önce %70 EtOH ile silin. Bir kuluçka odası iki slaytile oluşturulur. Onları ayırmak için, bunlardan birine 3 mm boşluk yerleştirin. - Pipet 7.5 μL fa karışımı damla bu parafin film kaplı cam slayt üzerine, aynı zamanda boşluk ayıran vardır. Bir slayt yerde 8-10 damla, iki satır halinde düzenlenmiştir.
- Bir mikropipet kullanarak, 3-5 COK'yu ve minimum hacim (5°L'ye kadar) olgunlaşma ortamını (MM) aktarın ve bunları tam olarak FA damlasının ortasına yerleştirin. Bu yordam iyi manuel beceri ve hassasiyet gerektirir.
NOT: Olgunlaşma ortamı (MM), 10 IU/mL PMSG, 10 IU/mL hCG, %10 FBS ve %50 domuz folikülü sıvısı (FF) ile desteklenen DMEM/F12'den oluşur. - Sadece onları kapsayacak şekilde, her FA damla 7,5 μL trombin / Ca2 + çözeltisi ekleyin. Jel neredeyse anında formları çünkü onları karıştırmak için gerek yoktur.
- Fa kapsüller için ikinci, daha önce hazırlanmış cam slayt uygulayarak kuluçka odası kapağı. Çok dikkatli ama sağlam bir hareketle, odayı ters çevirin ve kurumasını önlemek için nemli filtre kağıdıyla kaplı 100 mm'lik Petri kabına yerleştirin.
- Daha sonra Petri kabını yaklaşık 5-7 dakika boyunca %5 CO2 kuluçka makinesine (38 °C) aktarın. Bundan sonra, FA kapsülfibrin ve aljinat eşzamanlı jelasyon nedeniyle bulutlu olacak.
- FA kapsüllerini kuyu başına 100°L MM içeren 96 kuyu plakasına (kuyu başına bir kapsül) aktarın.
NOT: Oluşan FA kapsüllerine zarar vermemek için cerrahi forseps ler kullanarak bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. - Her 2 günde bir MM'nin (50 μL) yarısını taze, önceden dengelendirilmiş olanla değiştirin. Ters ışık mikroskobu (10x büyütme) kullanan görüntü COC'ları.
NOT: COCs FA kültürü için kültür koşulları: 38 °C, %5 CO2 atmosfer ve bağıl nem %95 altında. IVM 4 gün sonra, hidrojeller fibrin bileşeninin ilerleyici bozulması nedeniyle neredeyse net görünür. Kalan aljinat enzimatik olarak aljinat-lyaz, özellikle aljinat bozan ve hayvan hücrelerini etkilemeyen bir bitki kaynaklı enzim tarafından bozulmalıdır.- MM'yi kapsülleri içeren kuyulardan çıkarın ve DMEM'e 100°L 10 IU/mL aljinat liaz ekleyin. 25-30 dakika kuvözde kültür plakası bırakın.
- Çözünmüş kapsüllerden COC'leri çıkarın.
NOT: Bu bir kesme pipet ucu ile yapılabilir. - Taze bir DMEM'de birkaç yıkamadan sonra, PBS içeren bir IVF yemeğinin (çanak başına 5-10 COC) iç halkasına COC aktarın. Şimdi, daha fazla morfolojik veya biyokimyasal analiz için kullanın.
3. Süper hidrofobik florlu etilen propilen (FEP) mikrobiyoreaktörlerde kapsülleme.
NOT: Tüm IVM prosedürlerinin termostatik kontrollü masada ve COC'lerin kullanım ları boyunca 38 °C'de tutulmasından emin olun.
- 1 μm FEP toz yatak ortalama parçacık boyutu 5 g içeren bir 30 mm Petri çanak hazırlayın.
NOT: Taze FEP tozu kullanmak önemlidir. Yeniden kullanılan FEP toplam eğilimindedir ve kümeler oluşturur. - Adım 1.6'da izole edilmiş 3-5 CO'yu içeren tek bir MM damlasını (hacim olarak~30°L) FEP tozunun yatağına dağıtın. Bu parçacıkların sıvı damlayüzeyini ve oluşan sıvı bilyelerin (LM) yüzeyini tamamen kapladığından emin olmak için plakayı dairesel bir hareketle hafifçe döndürün.
- 1.000 μL uçlu bir pipet kullanarak lm'yi toplayıp edin.
NOT: LM (4-5 mm) çapına uyacak şekilde pipet ucunu kenardan kesin. Bu tür hazırlanmış ucun yaklaşık çapı LM'den biraz daha büyük olmalıdır. - Birkaç 60 mm IVF Petri yemekleri hazırlayın. Nem haznesini hazırlamak için dış halkalara 3-4 mL steril su ekleyin. Sonra, merkezi kuyuya bir LM yerleştirin.
NOT: Bu prosedür iyi manuel beceri ve hassasiyet gerektirir - mermer dikkatsizce yerleştirilir veya hatta düşük bir yükseklikten düşerse yok edilecektir. - Mermerleri % 5 CO2 kuluçka makinesinde 38 °C'de 4 gün kuluçkaya yatırın.
- Prosedürü takip eden ortamı günlük olarak değiştirin: Her LM'ye 30 μL MM uygulayın, bu da doğrudan sıvı teması kaplanmış FEP tozlarının hidrofobikliğini bozduğu için bunların yayılmasına neden olacaktır. Mermer içeriği eridiğinde, biyoreaktörden salınan COC'leri Petri kabındaki bir damla taze MM'ye aktarın.
NOT: Serbest bırakılan COC'ları tam olarak aktarmak için polikarbonat mikropipet kullanın. - FEP partiküllerini çıkarmak için MM'de (3-4 kez) birkaç kez yıkaldıktan sonra, 30 μL taze MM ile FEP toz yatağına aktarın. Toz parçacıklarının sıvı damlasının yüzeyini tamamen kaplayıp yeni bir LM oluşturmasını sağlamak için plakayı dairesel bir hareketle yavaşça döndürün.
- Ardından 3.3-3.4 adımlarından prosedürü izleyin.
NOT: FEP tozunun şeffaf kaplaması, ışık mikroskobu kullanılarak LM içeriğinin izlenmesini sağlar.
- Prosedürü takip eden ortamı günlük olarak değiştirin: Her LM'ye 30 μL MM uygulayın, bu da doğrudan sıvı teması kaplanmış FEP tozlarının hidrofobikliğini bozduğu için bunların yayılmasına neden olacaktır. Mermer içeriği eridiğinde, biyoreaktörden salınan COC'leri Petri kabındaki bir damla taze MM'ye aktarın.
4. 96-h IVM prosedürü nden sonra iki 3D sistem kullanılarak COC'ların karakterizasyonu
NOT: Kullanılan IVM sistemlerinin verimliliğini belirlemek için, ışık mikroskobu altında morfolojik olarak COC'leri puan. Ayrıca, COCs canlılık analizi için calcein ve ethidium homodimer (EthD-1) boyaları ile çift floresan etiketleme kullanın44.
- IVM sonrası yumurtaların ışık ve floresan mikroskobu ile morfolojik incelemesi.
- 38 °C 1x PBS ile COC'leri (hem FAB kullanarak kültürden türetilenler hem de LM'den elde edilenleri) yıkayın.
NOT: COC'lerin kullanımını kolaylaştırmak ve boyama işlemi sırasında onlara zarar vermemek için, 96 veya 48 kuyu plakası kullanın ve COC'leri sonraki kuyulara aktararak her boyama adımını gerçekleştirin. - 37 °C'de 100 μL 1.6 mM calcein ve 5.5 mM EthD-1 ile 30-45 dakika kuluçkaya yatırın. Her iki maddeyi de 1x PBS'de seyreltin.
NOT: Bu iki renkli floresan bir teşp olduğundan, karanlıkta bu adımı gerçekleştirin. - Kuluçkadan sonra, COC'yi PBS'de iki kez yıkayın ve floresan proteinlerin ve floresan boyaların hızlı fotobeyazmasını önlemek için tasarlanmış bir antifade montaj ortamına batırın (Malzeme Tablosu).
NOT: Kapak camı kenarlarını herhangi bir oje ile kurura karşı koruyun. - Bir konfokal lazer tarama mikroskobu altında lekeli örnekleri görselleştirin.
NOT: Her iki probun floresanını (yani calcein ve ethidium homodimer-1, EthD-1) 488nm'ye kadar bir argon lazeri ayarlayın. Yayılan floresan üçlü dikroik filtre 488/561/633 ile ayrılır ve daha sonra yeşil (calcein) için 505−570 nm ve kırmızı filtre için 630−750 nm (EthD-1) olarak ölçülür. - Ölü granülosa hücrelerinin yüzdesine bağlı olarak konfokal floresan görüntülemedayalı kültür yumurtalık folikülleri uygulanan modifiye sınıflandırma kullanarak, dört kategoriye COCs sınıflandırma35. V1: Yaklaşık %100 uygun c'lere sahip COC'lar; V2: Ölü C'lerin %10'una sahip COC'lar; V3: Ölü CC'lerin %10-50'si olan COC'lar; V4: Ölü CC'lerin %50'si ile COC'lar.
NOT: Teknik olarak, canlı ölü tsay ile yumurta canlılığını değerlendirmek zordur; bu nedenle, mitokondriyal ultrayapı veya aktivite analiz ederek, örneğin tahmin edilmelidir.
- 38 °C 1x PBS ile COC'leri (hem FAB kullanarak kültürden türetilenler hem de LM'den elde edilenleri) yıkayın.
- Transmisyon elektron mikroskobu ile IVM sonrası oositultrayapının incelenmesi.
- 100 μL%2.5 glutaraldehitteki COC'leri 0,1 M sodyum kacodylate tamponda (pH 7,2, oda sıcaklığında) 2 saat boyunca düzeltin.
- 100 μL 0,1 M sodyum kacodylate tampon (4 °C gecede) ve aynı tampon içinde durula.
- 0,1 M sodyum kacodylate tampon (oda sıcaklığında) 1 saat için% 1 osmiyum tetroksit ile Postfix COCs.
- Uranyal asetatta boyama (%1) sonra, artan etanol seyreltme serisindeki COC'leri kurutun (%50, %60, %70, %90 ve %100), oda sıcaklığında bir gecede sızdırın, ardından iki kısa rezorin değişimi ve son olarak LR White'a yerleştirin.
- Daha sonra, numuneleri yönlendirmek ve değerlendirmek için yarı ince bölümleri (1 μm) metilen mavisi/masmavi II ile lekeleyin.
- Son olarak, TEM ile ultraince, iki kat lekeli bölümleri ultrayapısal düzeyde inceleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her iki IVM sistemi kullanan COC'larda granülosa hücreleri birbirine sıkıca yapışmış ve kurtarılan COC'ların çoğunda bozulmadan kümülüs hücresi katmanları bulunurdu(Şekil 1A,B). Ayrıca kümülüs hücrelerinin önemli bir kısmı korunmuştur.
COCs canlılık analizinden elde edilen sonuçlar, 3Boyutlu in vitro koşullarda domuz yumurtalarının kapsülasyonu için uygulanan her iki sistem de optimum büyüme koşullarını sağladığını doğrulamıştır(Şekil 2). Her iki grupta da sadece yüksek canlılık oositleri gözlendi, Sırasıyla V1 = %13, FAB için V2 = % 87 ve LM için % 10 V2 (Tablo 1).
İletim elektron mikroskobu (TEM) ile gözlenen mitokondri, yumurtalarda eşit olarak dağıtıldı, IVM sonrası şekilleri kabuk benzeri45idi. Bunlardan sadece birkaçı uzamış, dahası, kümelenmeleri düzensiz olarak gözlenmiştir (Şekil 1C,D). Endoplazmik retikulum gözlendi, ya mitokondri ile ilişkili ya da yumurta sitoplazmasında serbest. Lipid damlacıkları küçük koyu yuvarlak yapılar olarak ortaya çıktı ve Golgi aparatı genişlemiş sarnıç ile ortaya çıktı (Şekil 1C,D).
| V1 | V2 | V3 | V4 | ||||
| % | Numarası | % | Numarası | % | Numarası | % | |
| Fab | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| COCs toplam sayısı: 144 | 16a | 128b | 0 | 0 | |||
Tablo 1. Fibrin-aljinat boncuklar (FAB) ve mikrobiyoreaktörler FEP, Sıvı Mermerler (LM) kullanılarak kapsülleme sonrası COC'ların canlılığı ile ilgili sonuçlar. Sonuçlar ortalama olarak verildi. Üst yazılara sahip değerler (a, b) istatistiksel olarak anlamlı olarak farklılık gösterirdi (p <0.05).
Şekil 1: 96 saat kapsülleme den sonra COC'ların morfolojisini ve ultrayapısını gösteren temsili görüntüler. FABAiçindeki COC'ların morfolojisi - ışık mikroskobu; (B) LM içindeki COC'ların morfolojisi - ışık mikroskobu; C: FAB içinde in vitro kültürden sonra oosit ultrastructure (TEM); D: OOSIT ultrastructure (TEM) LM içinde in vitro kültür sonra. O: oosit; CCs: kümülüs hücreleri; ZP: zona pellucida; N: çekirdek; M: mitokondri; G: Golgi aparatı; ER: endoplazmik retikulum; Lp: lipid damlacık; FA: aljinat ve fibrin filamentler; FEP: heksafloropropilen ve tetrafloroetilen kopolimer tozu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kapsülleme 96 h sonra COC'ların temsili floresan görüntüleri. (A,B) Aynı COC'ler için in vitro kültürden sonra fab iki filtre ile canlı veya ölü hücreler için sırasıyla yeşil floresan veya kırmızı floresan ve(C)her ikisinin birleştirilmesi görselleştirmek için kullanarak elde edilen görüntüler. (D,E) Canlı veya ölü hücreler için yeşil floresan veya kırmızı floresanyı görselleştirmek için iki filtre ile LM kullanarak in vitro kültürden sonra aynı COC'lar için elde edilen görüntüler ve(F)bunların birleştirilmesi. Ölçek çubukları = 50 μm. Beyaz yıldızlar apoptoz geçiren hücreleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sadece yumurtanın değil, onu çevreleyen kümülüs hücrelerinin de tüp bebek büyümesini sürdürebilme ve aynı zamanda olgunlaşmasını destekleyebilme yeteneği, başarılı yardımcı üreme teknolojileri için ve özellikle insan veya domuz gibi uzun süreli foliküler büyüme uygulanan türlerde somatik hücre/oosit etkileşimlerinin anlaşılmasını ilerletmek için son derece önemlidir. Sürekli geliştirilmiş IVM teknikleri polikistik over sendromu (PCOS), erken yumurtalık yetmezliği veya kesin kısırlık (onkoterapi) durumlarında üreme seçeneklerini korumak için yararlı bir araç haline gelmektedir. Buna ek olarak, bazı yumurtalık disfonksiyonları disregulated foliküler büyüme neden olabilir bu yana, oosit düzgün gelişimini kontrol moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak patofizyoloji si ve bu koşulların rasyonel tedavi içine önemli bir fikir sağlayabilir. IVM sırasında COCs 3D mimarisinin bakımını destekleyecek in vitro kültür sistemleri, bir matris veya bir biyoreaktör içinde kapsülleme bir adım gerektirir. Bu çalışma, domuz yumurtası kültürü için uygulanabilecek bir protokolü açıklamaktadır. Domuz cocs büyüme ve gelişimini teşvik etmek için burada sunulan her iki 3D in vitro kültür sistemleri kullanıcı dostu ve hem yumurta ve kümülüs hücrelerinin hayatta etkili kontrol sağlar.
Burada sunulan fibrin-aljinat hidrojel boncuk (FAB) kendi kapsülleme kullanarak COCs ilk in vitro kültür yöntemi aktif hücre duyarlı matris ortamında 3D oosit büyüme sağlar. Daha önce aljinat hidrojelleri dayalı yayınlanan protokoller genellikle çok umut verici sonuçlar32ile çok sayıda hayvan türünden izole yumurtalık foliküllerinin gelişiminin araştırılması için kullanılmıştır . İlginçtir, ne olursa olsun aljinat hidrojel son bileşimi32 veya kapsülleme yöntemi kendisi46, Bu çalışmalar aljinat boncuk tabanlı 3D kültür sistemleri foliküler büyüme ve hayatta kalma destek başardık gösterdi.
Aljinat hidrojelleri foliküller üzerinde nazik, onların daha fazla hayatta kalma veya in vitro gelişimi etkilemez. Benzer şekilde, burada ilk kez açıklanan COC'ların in vitro kültür protokolü, hem morfolojik hem de ultrayapısal düzeylerde belgelenmiş gibi kaliteli domuz yumurtaları üretmek için uygundur. Bir aljinat çözeltisinde fibrinojenin varlığı ve eşzamanlı jelling, üç boyutlu ortamı oluşturan ve daha da stabilize eden bir iç içe geçmiş ağın oluşumuna neden olmaktadır. Böyle bir matrisin içindeki spesifik yapısal destek nedeniyle, yumurtalıklar ve kümülüs hücreleri arasındaki hücre-hücre bağlantıları ve parakrin iletişim, in vivo mevcut olanlara benzer şekilde sürdürülmektedir.
Bu belgede açıklanan olgunlaşma protokolündeki en kritik iki adım, FA kapsüllerinin kuluçka odalarından MM içeren 96 kuyulu plakalara (adım 2.10.) aktarılması ve aljinat liyaz (adım 2.11) kullanılarak kalan aljinatın enzimatik bozulmasından sonra çözünmüş kapsüllerden COC'lerin çıkarılmasıdır. Her iki adım da, ilk durumda kapsüllerin imha önlemek için önemli manuel beceri ve hassasiyet gerektirir, ikinci - COCs hasar.
Bu yöntemin temel gücü, büyük bir evcil hayvanın yumurta olgunlaşması için en uygun koşulların belirlenmesine ek olarak, TEM, ışık mikroskobu veya konfokal mikroskopi kullanılarak yapılan analizler sırasında kapsül çıkarılmasına gerek olmamasıdır. Aljinat görüntüleme bir engel değildir. COC'lerin kapsüllere ayrılması boyama işlemi sırasında manipülasyonu kolaylaştırır.
Burada sunulan ikinci COC in vitro kültür LM kullanımı ile olan, genellikle mikro ölçekli parçacıklar ile kaplı yapışmaz damlacıklar ve sadece çok hidrofobik toz47bir sıvı küçük hacimlerde haddeleme elde edilen biridir. Kültür için LM kullanımı ile önceki çalışmalar, diğerleri arasında fibroblastlar48, kırmızı kan hücreleri49, bir tümörün organoid38, pankreas hücreleri50 veya koyun oositler36 damlacıkların hazırlanması için bir hidrofobik polimer olarak politetrafloroetilen (PTFE) kullanılarak yapılmıştır. PTFE klinikte yaygın olarak kullanılmaktadır (örn. kardiyovasküler greftler).
Bu çalışmada, ilk kez, domuz cocs in vitro kültür için FEP parçacıklarından yapılmış mikrobiyoreaktörler için güvenilir bir yöntem salıyoruz. SUNULAN protokolde FEP'nin kullanımı, ptfe'ye kompozisyon ve özellikler açısından çok benzer, LM'nin hazırlanmasını çok daha kolay hale getirir. Bu toz PTFE daha yumuşak ve ne özellikle önemli, şeffaftır. Bu da kullanımı ile kültürlü yapıların görüntüleme sırasında iş kolaylaştırır. FEP kullanarak LM oluşturma kolaylığı bu yöntemin kesin bir avantajıdır.
Bu belgede açıklanan olgunlaşma protokolündeki en kritik adım, oluşan LM'yi pipet ucu (3.3. ve 3.4.) kullanarak 60 mm IVF Petri kabına almak ve aktarmaktır. Bu adımlar LM imha önlemek için önemli manuel beceri ve hassasiyet gerektirir.
Muhtemelen, burada sunulan 3D oosit olgunlaşma indüksiyon protokollerinin ana sınırlama antibiyotik ile tedavi edilmeyen hayvanlardan toplanan uygun araştırma materyali elde nispeten büyük zorluk, anabolik steroidler (yani, nadrolone, boldenone) veya melengestrol asetat onların hızlı büyümesini teşvik. Bu steroidler, Avrupa'da yasaklanmış olan kullanımlarına rağmen, hala yaygın olarak yağlanma döneminin son iki ay içinde endüstriyel hayvancılık kullanılmaktadır, hangi neden, diğerleri arasında, cinsel olgunlaşma rahatsız.
Sonuç olarak, burada sunulan her iki 3D sistem optimum gaz in vitro kültür ortamını korumasağlar. Ayrıca, boşluk kavşaklarının düzleşmesini ve bunun sonucu olarak bozulmasını önleyerek, yumurta ve çevresindeki foliküler hücreler arasındaki fonksiyonel ilişkiyi koruyarak, uygun yumurta olgunlaşması için çok önemli olan COCs 3D organizasyonunu sürdürürler. Böylece, her iki model de üreme biyolojisi temel araştırma için değerli bir araç tır ve aynı zamanda klinik önemi olabilir, geliştirilmiş kısırlık tedavisine yol açan. Ayrıca, aynı zamanda yeni biyoteknoloji yöntemleri geliştirmek için, hem de hayvancılık geliştirme için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar çok müteşekkir: dr Waclaw Tworzydlo (Gelişimbiyoloji ve Omurgasız Morfoloji Bölümü, Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jagiellonian Üniversitesi) TEM teknik tesisleri için; Teknik yardım için Bayan Beata Snakowska'ya (Endokrinoloji Anabilim Dalı, Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jagiellonian Üniversitesi); Hücre Biyolojisi ve Görüntüleme Bölümü, Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jagiellonian Üniversitesi, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japonya). Bu çalışma Polonya Ulusal Bilim Merkezi'nin 2018/29/N/NZ9/00983 sayılı hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
References
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).
