Summary

Proteolytisk degradert alginat hydrogeler og hydrofobe mikrobioreaktorer for svin oocyte innkapsling

Published: July 30, 2020
doi:

Summary

Presentert her er to protokoller for innkapsling av svinoocytter i 3D kulturforhold. I den første, cumulus-oocyte komplekser (COCs) er innkapslet i fibrin-alginat perler. I den andre er de omsluttet av fluorerte etylenpropylenpulverpartikler (mikrobioreaktorer). Begge systemene sikrer optimale forhold for å opprettholde sin 3D-organisasjon.

Abstract

I reproduktiv biologi førte bioteknologirevolusjonen som begynte med kunstig inseminasjon og embryooverføringsteknologi til utvikling av assisterte reproduksjonsteknikker som oocyte in vitro modning (IVM), in vitro befruktning (IVF) og kloning av husdyr ved kjernefysisk overføring fra somatisk celle. IVM er metoden spesielt av betydning. Det er plattformteknologien for levering av modne, god kvalitet oocytes for applikasjoner som reduksjon av generasjonsintervallet i kommersielt viktige eller truede arter, forskning om in vitro menneskelig reproduksjon, og produksjon av transgene dyr for celleterapi. Begrepet oocyte kvalitet inkluderer sin kompetanse til å fullføre modning, befruktes, og dermed resulterer i sunne avkom. Dette betyr at oocytes av god kvalitet er avgjørende for vellykket befruktning inkludert IVF prosedyrer. Dette utgjør mange vanskeligheter med å utvikle en pålitelig kulturmetode som ville støtte vekst ikke bare av menneskelige oocytter, men også av andre store pattedyrarter. Det første trinnet i IVM er in vitro kulturen av oocytes. Dette arbeidet beskriver to protokoller for 3D-kulturen av svinoocytter. I den første, 3D-modellen cumulus-oocyte komplekser (COCs) er innkapslet i en fibrin-alginat perle interpenetrating nettverk, der en blanding av fibrin og alginat er gelled samtidig. I den andre er COCer suspendert i en dråpe medium og innkapslet med fluorisert etylenpropylen (FEP; en komolymer av hexafluoropropylen og tetrafluoroethylene) pulverpartikler for å danne mikrobioreaktorer definert som flytende klinkekuler (LM). Begge 3D-systemene opprettholder det gassøse in vitro kulturmiljøet. De opprettholder også COCs 3D-organisasjon ved å forhindre deres flating og påfølgende forstyrrelse av gapkryss, og dermed bevare det funksjonelle forholdet mellom oocyte og omkringliggende follikulære celler.

Introduction

Utviklingen av ulike kultursystemer, inkludert tredimensjonale (3D), har som mål å gi optimale forhold for vekst og modning av oocytter isolert fra folliklene selv i de tidligste utviklingsstadiene. Dette er av stor betydning for assisterte reproduktive teknikker (ART), spesielt i lys av det økende antall kvinner som sliter med ufruktbarhet etter kreftbehandling1. Modning av oocytter i in vitro-forhold (IVM) er allerede en veletablert teknikk som hovedsakelig brukes til in vitro embryogenerering med det formål å reproduksjonav husdyr 2. Men i de fleste pattedyrarter, selv om høye forekomster av modning av cumulus-oocyte komplekser (COCer) kan oppnås (område 60 til 90 %)3, er deres utviklingskompetanse fortsatt utilstrekkelig til behovene. Dette skyldes at utviklingen av zygotene oppnådd på en slik måte, selv opp til blastocyststadiet er lav, og etter overføring til surrogatdyr reduseres deres levedyktighet til sikt. Derfor er det behov for å øke utviklingskompetansen til embryoer hentet fra oocytter som ble utsatt for IVM-prosedyren4. Derfor blir nyemodningsmedier 5 utviklet og ulike perioder med in vitrokultur testes6,7 sammen med tilskudd av kulturmedier med ulike vekstfaktorerog molekyler 8,9.

Det første trinnet i et komplett IVM-system er å skape optimale forhold for bærekraftig vekst av oocytter under in vitro-kulturen. Oocyte veksten er en av de spesifikke indikatorene på oocyte evne til å gjenoppta meiosis10,11. I tillegg må et passende oocyte in vitro kultursystem være i stand til å støtte sin kjernefysiske modning og cytoplasmatisk differensiering12. Morfologien til cumulus-oocyte-komplekset er en annen viktig indikator som brukes i ART-klinikker for å velge den beste oocytten for påfølgende trinn av in vitro befruktning (IVF) prosedyre hos mennesker og husdyr12,13. Blant morfologiske egenskaper av COCs vurdert er: oocyte diameter, dens cytoplasma granulering og den første polare kroppen integritet14,15. Dessuten er oocyte utviklingspotensialet korrelert med utseendet og komprimeringen av cumulus celler og antall lag rundt oocyte. Svært viktig for riktig oocyte in vitro kultursystem er også vedlikehold av oocyte-cumulus celler riktig interaksjoner og cytoskeleton stabilitet16,,17,,18,19. Så langt har in vitro oocyte vekst innen menneskelige COCer blitt demonstrert20. Bruken av ku-COCer resulterte også med levendefødte. Disse ble isolert fra umodne eggstokksekkene og deretter dyrket i 14 dager til oocytten var tilstrekkelig stor til å gjennomgå IVF-prosedyren21. På samme måte ga COCer isolert fra bavian antral follikler, utsatt for IVM etter in vitro kultur oocytes i stand til å reinitiere meiose til metaphase II-scenen med en normal vises spindelstruktur22. Men i denne studien prøvde forfatterne ikke å befrukte dem. Likevel indikerer slike resultater at en lignende prosedyre kan brukes ikke bare på disse spesielle pattedyrarter, men også til menneskelige cumulus-oocyte komplekser hentet fra follikler hva som bør tillate å få oocytes av god kvalitet egnet for en vellykket IVF teknikk.

De ovenfor beskrevne resultatene ble oppnådd ved bruk av konvensjonelle IVM-protokoller der oocytter ble dyrket i todimensjonale (2D) systemer. Rutineprosedyren i 2D kultursystemer dekker oocytes, nedsenket i en dråpe av en passende kultur media, med mineralolje23,24. Det antas at et oljeoverlegg under in vitro oocyte kultur tjener til å forhindre flytende fordampning, og dermed sikre vedlikehold av riktig pH og osmotisk trykk i kulturen. Selv om et slikt 2D-kultursystem gjør det mulig å oppnå, selv opptil 87% av modne grisoocytes25,har det blitt bevist at mineraloljeoverlegget forårsaker betydelig diffusjon av lipidløselige materialer som er nødvendige for riktig oocytes utvikling26. I tillegg, på grunn av steroider (progesteron og østrogener) diffusjon i mineralolje under oocyte kultur, en forsinkelse av kjernefysisk modning og reduksjon i utviklingskompetanse oppnåelse av gris oocytes ble observert. Dette kan føre til å oppnå et lite antall zygotes, som i tillegg er preget av lav utviklingskapasitet til stadium av blastocyst og ved dårlig levedyktighet etter overføring til mottaker dyr27. Derfor gjøres det forsøk på å øke utviklingskompetansen til embryoer avledet fra oocytter mottatt etter IVM-prosedyren, ved å skape optimale forhold for å oppnå både cytoplasmatisk og kjernefysisk modenhet av oocytes dyrket sammen med CCer som komplekser, spesielt ved hjelp av tredimensjonale (3D) systemer. Ulike innovative 3D in vitro kultursystemer har blitt utviklet i de siste totiårene 28,29. Disse ble designet for å opprettholde den naturlige romlige organiseringen av celler og for å unngå deres utflating i kulturretter hva som ikke kan oppnås i de tradisjonelle 2D-kulturene. Den strukturelle og funksjonelle aktiviteten til kultiverte COCer kan sikres ved vedlikehold av riktig arkitektur og uforstyrret kommunikasjon gjennom gap-veikryss mellom ulike rom30. Egnetheten av bio-stillas for 3D in vitro kultur av cumulus-oocyte komplekser har blitt evaluert ved hjelp av naturlige biomaterialer som ulike komponenter i den ekstra cellulære matrisen (ECM; kollagen og hyaluronsyre)31 eller inert polymerer (alginat)32. Disse forsøkene testet i flere arter ga lovende resultater i form av oocyte meiosis gjenopptakelse og oppnåelse av sin fulle kompetanse33,34,35. Men så langt er det utviklet ikke noe 3D-system egnet for COCer-modning isolert fra store husdyr, inkludert griser.

Dette arbeidet beskriver to protokoller som kan brukes til 3D-kulturen av svine-COCer. Den første protokollen beskriver innkapsling i fibrin-alginate perler (FAB). FAB kan dannes ved samtidig blanding av en alginat og fibrin løsning, som gjennomgår en synkron gelasjonsprosess. Denne kombinasjonen gir et dynamisk mekanisk miljø fordi begge komponentene bidrar til matrisestivhet. En lignende løsning har tidligere blitt brukt for mus ovarian follicle kultur og modning36. I tilfelle av den presenterte protokollen, for å unngå for tidlig nedbrytning av alginat-fibrin-nettverket, brukes passende høyere konsentrasjoner av kalsiumkloridoppløsning, noe som sikrer en rask og stabil gelasjonsprosess. Det dynamiske mekaniske miljøet skaper forhold som ligner på disse i det naturlige intra-follikulære miljøet der COCer bor og øker i størrelse. I tillegg viser arbeidet representative resultater av COCs 3D-kultursystemer, der disse er suspendert i en dråpe medium og innkapslet med fluorisert etylenpropylen (FEP; en copolymer av hexafluoropropylen og tetrafluoroetylen) pulverpartikler, for å danne mikrobioreaktorer (Flytende klinkekuler, LM). LM er en form for 3D bioreaktor som tidligere har vist seg å støtte blant annet vekst av levende mikroorganismer37, tumorsfæroider38 og embryonale stamceller39. LMs har også blitt brukt for sau oocyte kultur40. I de fleste eksperimenter ved hjelp av LMs ble bioreaktorer tilberedt ved hjelp av polytetrafluoretylen (PTFE) pulverseng med partikkelstørrelse på 1 μm41. Den presenterte protokollen bruker FEP, som er svært lik i sammensetning og egenskaper til fluoropolymer ptfe. Men FEP er lettere formbar og mykere enn PTFE og det som er spesielt viktig, det er svært gjennomsiktig.

Begge 3D-systemene opprettholder det gassøse in vitro kulturmiljøet. De opprettholder også COCs 3D-organisasjon ved å forhindre deres flating og påfølgende forstyrrelse av gapkryss, og bevarer deres funksjonelle forhold mellom oocyte og omkringliggende follikulære celler.

Protocol

Følgende prosedyrer ble godkjent av dyrevelferdskomiteen ved Institutt for zoologi og biomedisinsk forskning ved Jagiellonian University. 1. Isolering av svin cumulus-oocyte komplekser For å samle materiale for isolering av eggstokkfollikler, forbruker svineovaries fra prepubertal gilts (ca 6-7 måneders alder, veier 70 til 80 kg) på et lokalt slakteri. Velg ca 20 gris eggstokkene fra 10 dyr for COCs isolasjon i hvert eksperiment.MERK: Forutsatt at hver eggstokk gir 3–5 foll…

Representative Results

I COCer ved hjelp av begge IVM-systemene holdt granulosacellene seg tett til hverandre, og de fleste av de gjenopprettede COCene hadde intakte lag med cumulusceller (figur 1A, B). I tillegg ble en betydelig andel av cumulus-cellene beholdt. Resultatene fra COCs levedyktighetsanalyse bekreftet at begge systemene søkte om innkapsling av svinoocytter i 3D in vitro-forhold sikret optimale vekstforhold (figur 2). I begge …

Discussion

Evnen til å opprettholde in vitro vekst ikke bare av oocyte, men også av cumulus celler rundt den og samtidig støtte modning er svært viktig for vellykket assistert reproduktive teknologier og for å fremme forståelsen av somatiske celle / oocyte interaksjoner spesielt i arter som gjennomgår langvarig follikulær vekst som mennesker eller griser. Kontinuerlig forbedrede IVM teknikker blir nyttig verktøy for å bevare reproduktive alternativer i tilfeller av polycystisk ovariesyndrom (PCOS), for tidlig ovariesvikt,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne er veldig takknemlige for: dr Waclaw Tworzydlo (Institutt for utviklingsbiologi og virvelløse morfologi, Institutt for zoologi og biomedisinsk forskning, Jagiellonian University) for tekniske fasiliteter i TEM; til Ms. Beata Snakowska (Institutt for endokrinologi, Institutt for zoologi og biomedisinsk forskning, Jagiellonian University) for teknisk assistanse; til Institutt for cellebiologi og avbildning, Institutt for zoologi og biomedisinsk forskning, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japan). Dette arbeidet ble støttet av stipend 2018/29/N/NZ9/00983 fra National Science Centre Poland.

Materials

General
Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml Thermo Fisher 15240062 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)
DMEM/F12 (500ml) Sigma-Aldrich D8062 Handling and Maturation Medium
DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml Thermo Fisher 14190144
FCS (100 ml) Thermo Fisher 16140063 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)
PBS (1x, pH 7.4) 500ml Thermo Fisher 10010023
TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml Cayman Chemicals 600232 1x final concentration. Other brand can be use
Maturation Medium
hCG (1 VIAL of 10 000 U) Sigma-Aldrich CG10
PMSG BioVendor RP1782721000
Fibrin-alginate beads
Alginate Lyase Sigma-Aldrich A1603 (Step 2.11.1)
Thrombin Sigma-Aldrich T9326-150UN (Step 2.1)
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 (Step 2.1)
Fibrinogen (250mg) Sigma-Aldrich F3879 (Step 2.2)
Sodium Alginate Sigma-Aldrich W201502 (Step 2.3) use for alginate solution
Liquid Marble
FEP Dyneon GmbH 3M AdMD A-66670
Morphological examination
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fisher L3224 (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 mounting medium
Ultrastructure examination
Glutaraldehyde solution Sigma-Aldrich G5882 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)
LR White resin Sigma-Aldrich L9774 (Step 4.2.4.)
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 (Step 4.2.5.)
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich O5500 (Step 4.2.3.)
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250 Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)
Uranyl Acetate POCH 868540111 (Step 4.2.4.)
Specific instruments, tools
30 mm Pteri dish TPP 93040
60 mm IVF Petri dish Falcon 353653
Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor RI Life Sciences 8-72-288
Ez-Tip RI Life Sciences 8-72-4155/20
Heating Table SEMIC Other brands can be used
Incubator Panasonic MCO-170AIC-PE Other brands can be used
Sterile petri dish (10 cm) NEST Biotechnology 704002
Sterile syringe filters with 0.2 µm GOOGLAB SCIENTIFIC GB-30-022PES
Thermos Quechua 5602589 Other brands can be used

References

  1. Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
  2. Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
  3. Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
  4. Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
  5. Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
  6. You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
  7. Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
  8. Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
  9. Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
  10. Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
  11. Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
  12. Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
  13. de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
  14. Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
  15. Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
  16. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
  17. Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
  18. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  19. Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
  20. Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
  21. Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
  22. Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
  23. Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
  24. Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
  25. Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
  26. Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
  27. Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
  28. Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
  29. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
  30. Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
  31. Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
  32. Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
  33. Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
  34. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  35. Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
  36. Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
  37. Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
  38. Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
  39. Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
  40. Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  41. Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
  42. Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
  43. Eppig, J. J., O’Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
  44. Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
  45. Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
  46. Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
  47. Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
  48. Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
  49. Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
  50. Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F., Turksen, K. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. , 291-299 (2017).

Play Video

Cite This Article
Gorczyca, G., Wartalski, K., Tabarowski, Z., Duda, M. Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation. J. Vis. Exp. (161), e61325, doi:10.3791/61325 (2020).

View Video