Summary
Aquí se presentan dos protocolos para la encapsulación de ovocitos porcinos en condiciones de cultivo 3D. En el primero, los complejos cúmulos-oocitos (COC) se encapsulan en perlas de fibrina-alginato. En el segundo, se encierran con partículas fluoradas de etileno propileno propileno (microbiorreos). Ambos sistemas garantizan condiciones óptimas para mantener su organización 3D.
Abstract
En biología reproductiva, la revolución biotecnológica que comenzó con la inseminación artificial y la tecnología de transferencia de embriones condujo al desarrollo de técnicas de reproducción asistida como la maduración in vitro de ovocitos (IVM), la fertilización in vitro (FIV) y la clonación de animales domésticos mediante transferencia nuclear desde células somáticas. El IVM es el método particularmente importante. Es la tecnología de plataforma para el suministro de ovocitos maduros y de buena calidad para aplicaciones tales como la reducción del intervalo de generación en especies de importancia comercial o en peligro de extinción, la investigación relativa a la reproducción humana in vitro y la producción de animales transgénicos para terapias celulares. El término calidad de los ovocitos incluye su competencia para completar la maduración, ser fertilizado, dando lugar a una descendencia sana. Esto significa que los ovocitos de buena calidad son primordiales para una fertilización exitosa, incluidos los procedimientos de FIV. Esto plantea muchas dificultades para desarrollar un método de cultivo confiable que apoyaría el crecimiento no sólo de ovocitos humanos, sino también de otras especies de mamíferos grandes. El primer paso en IVM es el cultivo in vitro de ovocitos. Este trabajo describe dos protocolos para el cultivo 3D de ovocitos porcinos. En el primero, los complejos de cúmulos-oocitos (COC) modelo 3D se encapsulan en una red de interpenetración de perlas de fibrina-alginato, en la que una mezcla de fibrina y alginato se gelifican simultáneamente. En el segundo, los COC se suspenden en una gota de medio y se encapsulan con microbiolenos de etileno fluorado (FEP; un copolímero de hexafluoropropileno y tetrafluoroetileno) partículas en polvo para formar microbioctores de forma definidas como líquidos de mármol (LM). Ambos sistemas 3D mantienen el ambiente de cultivo in vitro gaseoso. También mantienen la organización 3D de LOS COC evitando su aplanamiento y la consiguiente interrupción de las uniones de separación, preservando así la relación funcional entre el ócito y las células foliculares circundantes.
Introduction
El desarrollo de varios sistemas de cultivo, incluidos los tridimensionales (3D), tiene como objetivo proporcionar condiciones óptimas para el crecimiento y la maduración de ovocitos aislados de los folículos incluso en las primeras etapas de desarrollo. Esto es de gran importancia para las técnicas de reproducción asistida (TAR), especialmente en vista del creciente número de mujeres que están luchando con la infertilidad después del tratamiento oncológico1. La maduración de ovocitos en condiciones in vitro (IVM) es ya una técnica bien establecida utilizada principalmente para la generación in vitro de embriones con fines de reproducción ganadera2. Sin embargo, en la mayoría de las especies de mamíferos, incluso si se pueden alcanzar altas tasas de maduración de los complejos cúmulos-oocitos (COC) (rango 60 a 90 %)3, su competencia en desarrollo sigue siendo inadecuada para las necesidades. Esto se debe a que el desarrollo de los cigotos obtenidos de tal manera incluso hasta la etapa del blastocisto es bajo y después de la transferencia a animales sustitutos se reduce su viabilidad al término. Por consiguiente, es necesario aumentar la competencia de desarrollo de los embriones obtenidos a partir de ovocitos sometidos al procedimiento4de la IVM. Por lo tanto, nuevos medios de maduración5 están siendo ideados y varios períodos de cultivo in vitro se prueban6,7 junto con la suplementación de medios de cultivo con varios factores de crecimiento y moléculas8,9.
El primer paso de cualquier sistema completo de IVM es crear condiciones óptimas para el crecimiento sostenible de ovocitos durante el cultivo in vitro. El crecimiento de los ovocitos es uno de los indicadores específicos de la capacidad del ócito para reanudar la meiosis10,11. Además, un sistema de cultivo in vitro de ovocitos adecuado debe ser capaz de apoyar su maduración nuclear y su diferenciación citoplasma12. La morfología del complejo cúmulo- ovocitos es otro indicador importante utilizado en las clínicas de TAR para seleccionar el mejor ócito para los pasos posteriores del procedimiento de fertilización in vitro (FIV) en humanos y ganado12,,13. Entre las características morfológicas de los COC considerados se encuentran: el diámetro de los óocitos, su granulación del citoplasma y la primera integridad del cuerpo polar14,15. Además, el potencial de desarrollo de ovocitos está correlacionado con la aparición y compactación de células cúmulos y el número de sus capas que rodean el ovocitos. Muy importante para el sistema de cultivo in vitro de ovocitos adecuado es también el mantenimiento de las células ovocitos-cúmulos interacciones adecuadas y la estabilidad del citoesqueleto16,17,18,19. Hasta ahora, el crecimiento de ovocitos in vitro dentro de los COC humanos ha demostrado20. El uso de COC de vaca también resultó con nacimientos vivos. Estos fueron aislados de los folículos ováricos inmaduros y luego cultivados durante 14 días hasta que el ócito fue lo suficientemente grande como para someterse al procedimiento de FIV21. Del mismo modo, los COC aislados de los folículos antrales de babuino, sometidos a IVM después del cultivo in vitro, producen ovocitos capaces de reiniciar la meiosis a la etapa metafásica II con una estructura de husillo normal que aparece22. Sin embargo, en este estudio los autores no trataron de fertilizarlos. Sin embargo, tales resultados indican que un procedimiento similar podría aplicarse no sólo a estas especies particulares de mamíferos, sino también a los complejos humanos de cúmulos-ovocitos obtenidos a partir de folículos lo que debería permitir obtener ovocitos de buena calidad adecuados para una técnica exitosa de FIV.
Los resultados descritos anteriormente se obtuvieron con la aplicación de protocolos IVM convencionales durante los cuales los ovocitos se cultivaron en sistemas bidimensionales (2D). El procedimiento rutinario en los sistemas de cultivo 2D abarca los ovocitos, inmersos en una gota de un medio de cultivo adecuado, con aceite mineral23,,24. Se supone que una recubrimiento de aceite durante el cultivo de ovocitos in vitro sirve para prevenir la evaporación del líquido, asegurando así el mantenimiento del pH adecuado y la presión osmótica en el cultivo. Aunque este sistema de cultivo 2D permite obtener, incluso hasta el 87% de los ovocitos de cerdo maduros25,se ha demostrado que la recubrimiento de aceite mineral provoca una difusión sustancial de materiales solubles en lípidos que son necesarios para el desarrollo adecuado de ovocitos26. Además, debido a los esteroides (progesterona y estrógenos) difusión en el aceite mineral durante el cultivo de ovocitos, se observó un retraso de la maduración nuclear y la reducción en el logro de la competencia de desarrollo de ovocitos de cerdo. Esto puede dar lugar a la obtención de un pequeño número de cigotos, que además se caracterizan por una baja capacidad de desarrollo a la etapa del blastocisto y por una mala viabilidad después de la transferencia a los animales receptores27. Por lo tanto, se intenta aumentar la competencia de desarrollo de los embriones derivados de los ovocitos recibidos después del procedimiento IVM, creando condiciones óptimas para lograr tanto la madurez citoplasmática como nuclear de los ovocitos cultivados junto con los CC como complejos, especialmente utilizando sistemas tridimensionales (3D). En las últimas dos décadas se han desarrollado varios sistemas innovadores de cultivo in vitro 3D en las últimas dosdécadas, 28y29. Estos fueron diseñados para mantener la organización espacial natural de las células y evitar su aplanamiento en los platos de cultivo lo que no se puede lograr en las culturas 2D tradicionales. La actividad estructural y funcional de los COC cultivados puede garantizarse mediante el mantenimiento de su arquitectura adecuada y la comunicación sin interrupciones a través de cruces entre varios compartimentos30. La idoneidad de los bioestirios para el cultivo in vitro 3D de complejos cúmulos-oocitos se ha evaluado utilizando biomateriales naturales como varios componentes de la matriz extracelular (ECM; colágeno y ácido hialurónico)31 o polímeros inertes (alginato)32. Estos intentos probados en varias especies trajeron resultados prometedores en términos de la reanudación de la meiosis de ovocitos y el logro de su plena competencia33,,34,,35. Sin embargo, hasta ahora no se ha desarrollado ningún sistema 3D adecuado para la maduración de LOS COC aislado de grandes animales domésticos, incluidos los cerdos.
Este trabajo describe dos protocolos que se pueden utilizar para la cultura 3D de COC porcinos. El primer protocolo describe la encapsulación en perlas de fibrina-alginato (FAB). FAB se puede formar mezclando simultáneamente una solución de alginato y fibrina, que se someten a un proceso de gelización síncrona. Esta combinación proporciona un entorno mecánico dinámico porque ambos componentes contribuyen a la rigidez de la matriz. Una solución similar se ha utilizado previamente para el cultivo de folículo ovárico ratón y la maduración36. En el caso del protocolo presentado, para evitar la degradación prematura de la red de alginato-fibrina, se utilizan concentraciones apropiadamente más altas de solución de cloruro de calcio, asegurando un proceso de gelación rápido y estable. El entorno mecánico dinámico crea condiciones similares a estas en el entorno intrafolicular natural en el que residen los COC y aumentan de tamaño. Además, el trabajo muestra resultados representativos de los sistemas de cultivo 3D de COC, en los que estos se suspenden en una gota de medio y encapsulan con etileno propileno fluorado (FEP; un copolímero de hexafluoropropileno y tetrafluoroetileno) partículas de polvo, para formar microbioreactores (Marble líquido, LM). Lm son una forma de biorreactor 3D que se ha demostrado previamente para apoyar, entre otros, el crecimiento de microorganismos vivos37,esferoides tumorales38 y células madre embrionarias39. Los LMs también se han utilizado con éxito para el cultivo de ovocitos de oveja40. En la mayoría de los experimentos con LMs, los biorreactores se prepararon utilizando lecho de polvo de politetrafluoroetileno (PTFE) con un tamaño de partícula de 1 m41. El protocolo presentado utiliza FEP, que es muy similar en composición y propiedades a los fluoropolímeros PTFE. Pero FEP es más fácilmente formable y más suave que el PTFE y lo que es especialmente importante, es altamente transparente.
Ambos sistemas 3D mantienen el ambiente de cultivo in vitro gaseoso. También mantienen la organización 3D de LOS COC evitando su aplanamiento y la consiguiente interrupción de las uniones de separación, preservando su relación funcional entre el ócito y las células foliculares circundantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los siguientes procedimientos fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal en el Instituto de Zoología e Investigación Biomédica de la Universidad Jagiellonian.
1. Aislamiento de complejos cúmulos-oocitos porcinos
- Para recoger material para el aislamiento de folículos ováricos, los ovarios porcinos especiales de doradas prepúberes (aproximadamente 6-7 meses de edad, con un peso de 70 a 80 kg) en un matadero local. Elija aproximadamente 20 ovarios de cerdo de 10 animales para el aislamiento de COCs en cada experimento.
NOTA: Suponiendo que cada ovario produzca de 3 a 5 folículos, el número total de folículos varía de 60 a 100. - Colocar los ovarios en un termo con solución salina estéril tamponada por fosfato (PBS; pH 7,4; 38 oC) que contenga 1% de AAS. Asegúrese de que el material experimental se transporta al laboratorio dentro de 1 h, donde se enjuaga dos veces con antibióticos estériles que contienen PBS.
- Después de enjuagar los ovarios, transferirlos al vaso de precipitados llenos de hm medium y almacenarlos en una incubadora a 38oC durante el tiempo de todas las manipulaciones.
NOTA: Para obtener resultados óptimos durante la manipulación de ovocitos, lleve a cabo todos los procedimientos en el medio DMEM/F12 (medio de manipulación, HM) con la adición de una solución antibiótica/antimicótica (AAS) del 2,5% y un 10% de suero bovino fetal (FBS) y controle el pH al nivel de CO2 en el medio ambiente, en una mesa de calentamiento con control de temperatura (38 oC) y bajo el flujo de laminas. - A partir de grandes folículos porcinos (6-8 mm de diámetro) recoger líquido folicular (FF) por aspiración y centrifugación a 100 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Después de eso, filtre el sobrenadante utilizando jeringa estéril unida a filtros de poro de membrana de 0,2 m y congele a presión a -80oC.
NOTA: Utilice una jeringa de insulina (u- 40) para aspirar líquido folicular. - Asegúrese de que, sólo se seleccionan folículos sanos y de tamaño medio (4-6 mm de diámetro) para el aislamiento de COC42.
NOTA: Los CPC de grado I, que poseen un ovcito intacto y redondo con ooplasmo homogéneo y cúmulos compactos multicapa (al menos 3-4) se consideran adecuados para el procedimiento 3D IVM43. - Para aislar los COC, transfiera 2-3 ovarios a una placa estéril de 10 cm de diámetro de Petri llena de HM. Aísle los COC de los folículos de tamaño medio siguiendo uno de los procedimientos siguientes.
- Corte suavemente la superficie de los folículos ováricos salientes con una hoja quirúrgica estéril 15C. Esto hará que el líquido folicular junto con los COC fluyan hacia la placa Petri.
- Aspirar el contenido folicular con aguja de 28 G con un tamaño de 5/8" unido a una jeringa desechable y transferirlo al plato Petri.
NOTA: Deseche los restos de tejido ovárico. Las etapas posteriores de aislamiento se llevan a cabo bajo un estereomicroscopio.
- Preparar platos de Petri de 3-5 60 mm de FIV.
- Añadir 1 ml de HM a los pozos centrales y colocar una 3-4 gotas de HM (50 ml por gota) en sus anillos exteriores.
- A continuación, utilizando una micropipeta de policarbonato, mueva los COC no dañados a las gotas de HM en los anillos exteriores para enjuagarlos brevemente durante 3-4 veces.
- Al final, transfiera individualmente al pozo central. Almacene estas placas de FIV en una incubadora para otros procedimientos.
- Después de que se recojan los COC, realice el paso de selección final asignándolos aleatoriamente en dos protocolos de encapsulación IVM diferentes enumerados a continuación.
2. Encapsulación en perlas de hidrogel de fibrina-alginato
- Preparar 1 ml de trombina de 50 UI/ml en solución salina tamponada Tris (TBS; pH 7.4) con 100 mM de CaCl2 en un tubo de microcentrífuga estéril de 2,0 ml.
- Preparar la solución en stock de fibrinógeno (50 mg/ml en TBS) y mantenerla congelada.
NOTA: Para evitar el aglutinamiento al disolver el fibrinógeno en TBS, caliente los TBS a 37 oC.- El día del procedimiento, descongelarlo lentamente sobre hielo y justo antes de que el uso lleve a temperatura ambiente.
- Justo antes de usar mezclar en una proporción de 1:1 0.5% solución de alginato y 50 mg/ml de solución de fibrinógeno para obtener finalmente 2 ml (FA). En un tubo de microcentrífuga estéril, vórtice suavemente la mezcla. Evite hacer burbujas.
- Para preparar "cámaras de incubación", aplique tiras delgadas de películas de parafina en los portaobjetos de vidrio.
NOTA: Limpie las diapositivas con un 70 % de EtOH antes de su uso. Una cámara de incubación se forma con dos toboganes. Para separarlos, coloque espaciadores de 3 mm en uno de ellos. - Pipeta de 7,5 litros de la mezcla FA en este portaobjetos de vidrio recubierto de película de parafina, que también tiene espaciadores de separación. En un lugar de diapositivas 8-10 gotas, dispuestas en dos filas.
- Transfiera, utilizando una micropipeta, 3-5 COC junto con un volumen mínimo (hasta 5 ml) de medio de maduración (MM), y colóquelos precisamente en el centro de la caída de FA. Este procedimiento requiere buenas habilidades manuales y precisión.
NOTA: El medio de maduración (MM) consiste en DMEM/F12, complementado con 10 UI/ml de PMSG, 10 UI/ml de hCG, 10% FBS y 50% de líquido folicular porcino (FF) recogidos en el paso 1.4. - Añadir 7,5 l de trombina/Ca2+ solución en cada gota de FA, sólo para cubrirlos. No hay necesidad de mezclarlos porque el gel se forma casi instantáneamente.
- Cubra la cámara de incubación aplicando el segundo portaobjetos de vidrio previamente preparado en las cápsulas FA. Con un movimiento muy cuidadoso pero firme, gire la cámara al revés y colóquela en un plato Petri de 100 mm forrado con papel de filtro húmedo para evitar el secado.
- A continuación, transfiera el plato de Petri a la incubadora de 5% deCO2 (38 oC) durante unos 5-7 min. Después de esto, las cápsulas de FA se nublarán debido a la gelificación simultánea de fibrina y alginato.
- Transfiera las cápsulas de FA en 96 placas de pozo (una cápsula por pozo) que contengan 100 l de MM por pozo.
NOTA: Para no dañar las cápsulas de FA formadas, realice este paso cuidadosamente con el uso de fórceps quirúrgicos. - Cada 2 días reemplace la mitad del MM (50 l) por uno fresco y preequilibrado. Imagen coC utilizando un microscopio de luz invertido (a 10x aumento).
NOTA: Condiciones de cultivo para la cultura FA de COCs: 38oC, bajo una atmósfera de 5% CO2 y humedad relativa 95%. Después de 4 días de IVM, los hidrogeles parecen casi claros debido a la degradación progresiva del componente de fibrina. El alginato restante debe degradarse enzimáticamente - por alginato-liasa, una enzima de origen vegetal que degrada específicamente el alginato y no afecta a las células animales.- Retire el MM de los recipientes que contienen las cápsulas y añada 100 l de liasa de alginato de 10 UI/ml en DMEM. Deje la placa de cultivo en la incubadora durante 25-30 min.
- Retire los COC de las cápsulas disueltas.
NOTA: Esto se puede hacer con una punta de pipeta cortada. - Después de varios lavados en un DMEM fresco, transfiera los COC al anillo interior de un plato de FIV (5-10 COC por plato) que contenga PBS. Ahora, utilícelos para un análisis morfológico o bioquímico.
3. Encapsulación en microbiorrectores superhidroelóbicos de etileno propileno fluorado (FEP).
NOTA: Asegúrese de que todos los procedimientos de IVM se llevan a cabo en la mesa controlada termostáticamente y los COC se mantienen a 38 oC durante todo su manejo.
- Preparar un plato de Petri de 30 mm que contenga 5 g de un tamaño de partícula promedio de lecho en polvo FEP de 1 m.
NOTA: Es importante utilizar polvo FEP fresco. El FEP reutilizado tiende a agregar y forma grumos. - Distribuya una sola gota de MM (30 ml en volumen) que contenga 3-5 COCo aislados en el paso 1.6 sobre el lecho del polvo FEP. Gire suavemente la placa en un movimiento circular para asegurarse de que estas partículas cubrieron completamente la superficie de la gota líquida y las canicas líquidas formadas (LM).
- Recoger LM formado utilizando una pipeta con 1.000 l de punta.
NOTA: Corte la punta de la pipeta en el borde, para acomodarla al diámetro del LM (4-5 mm). El diámetro aproximado de dicha punta preparada debe ser ligeramente mayor que el del LM. - Prepare varios platos de 60 mm de IVF Petri. Añadir 3-4 mL de agua estéril a los anillos exteriores para preparar la cámara de humedad. A continuación, coloque un LM en el pozo central.
NOTA: Este procedimiento requiere buenas habilidades manuales y precisión - si el mármol se coloca descuidadamente o cae incluso desde una altura baja, será destruido. - Incubar mármoles durante 4 días a 38oC en una incubadora de 5 %CO2.
- Cambiar el medio diariamente siguiendo el procedimiento: aplicar 30 ml de MM en cada LM, lo que provocará su propagación porque el contacto con líquido directo interrumpe la hidrofobicidad de los polvos FEP recubiertos. Cuando el contenido de mármol se disuelva, transfiera los COC liberados del biorreactor a una gota de MM fresco en el plato Petri.
NOTA: Para transferir con precisión los COC liberados, utilice una micropipeta de policarbonato. - Después de varios lavados en MM (3-4 veces) para eliminar las partículas FEP, transfiéralas con 30 ml de MM fresco al lecho de polvo FEP. Gire suavemente la placa en un movimiento circular para asegurarse de que las partículas de polvo cubran completamente la superficie de la gota de líquido y formen un nuevo LM.
- A continuación, siga el procedimiento de los pasos 3.3-3.4.
NOTA: El recubrimiento transparente del polvo FEP permite monitorear el contenido de LM usando un microscopio de luz.
- Cambiar el medio diariamente siguiendo el procedimiento: aplicar 30 ml de MM en cada LM, lo que provocará su propagación porque el contacto con líquido directo interrumpe la hidrofobicidad de los polvos FEP recubiertos. Cuando el contenido de mármol se disuelva, transfiera los COC liberados del biorreactor a una gota de MM fresco en el plato Petri.
4. Caracterización de los COC después del procedimiento IVM de 96 horas utilizando dos sistemas 3D
NOTA: Para determinar la eficiencia de los sistemas IVM utilizados, puntúe los COC morfológicamente bajo un microscopio de luz. Además, utilice el etiquetado fluorescente doble con colorantes de calceína AM y homodimer de etidio (EthD-1) para el análisis de la viabilidad de los COC44.
- Examen morfológico de ovocitos después del IVM por microscopía de luz y fluorescencia.
- Lavar los COC (tanto los derivados del cultivo utilizando FAB como los de LM) con 38 oC 1x PBS.
NOTA: Para facilitar la manipulación de COC y no dañarlos durante el procedimiento de tinción, utilice una placa de 96 o 48 pozos y realice cada paso de tinción transfiriendo los COC a pozos posteriores. - Incubarlos en 100 l de 1,6 mM de calceína AM y 5,5 mM de EthD-1 durante 30–45 min a 37oC. Diluir ambas sustancias en 1x PBS.
NOTA: Debido a que se trata de un ensayo de fluorescencia de dos colores, realice este paso en la oscuridad. - Después de la incubación, lave el COC dos veces en PBS y luego sumerja en un medio de montaje antifada diseñado para evitar el fotoblanqueo rápido de proteínas fluorescentes y colorantes fluorescentes (Tabla de Materiales).
NOTA: Proteja los bordes del vidrio de la cubierta contra el secado con ningún esmalte de uñas. - Visualice muestras manchadas bajo un microscopio de escaneo láser confocal.
NOTA: Para excitar la fluorescencia de ambas sondas (es decir, calceína y ethidium homodimer-1, EthD-1) afinar un láser de argón a 488 nm. La fluorescencia emitida se separa por un filtro dicroico triple 488/561/633 y luego se mide a 505-570 nm para el verde (calceína), y a 630-750 nm para el rojo (EthD-1). - Clasificar los COC en cuatro categorías, utilizando la clasificación modificada que se aplica a los folículos ováricos en el cultivo a partir de imágenes de fluorescencia confocal dependiendo del porcentaje de células de granulosa muertas35. V1: COCs con CI 100% viables estimados; V2: COCs con 10% de CC muertos; V3: COCs con 10–50% de CC muertos; V4: COCs con 50% de CC muertos.
NOTA: Técnicamente, es difícil evaluar la viabilidad del ovocitos con el ensayo de muertos vivientes; por lo tanto, debe estimarse, por ejemplo, mediante el análisis de la ultraestructura o actividad mitocondrial.
- Lavar los COC (tanto los derivados del cultivo utilizando FAB como los de LM) con 38 oC 1x PBS.
- Examen de la ultraestructura de ovocitos después del IVM mediante microscopía electrónica de transmisión.
- Fijar LOS COC en 100 l 2,5% de glutaraldehído en tampón de cacodilato sódico de 0,1 M (pH 7,2, temperatura ambiente) durante 2 h.
- Sumerja los COC en un tampón de cacodilato sódico de 100 l a 0,1 M (durante la noche a 4 oC) y enjuague en el mismo tampón.
- COCs de postfijo con 1% de tetróxido de osmio en tampón de cacodilato sódico de 0,1 M (temperatura ambiente) durante 1 h.
- Después de la tinción en acetato de uranilo (1 %), deshidratar COCs en una serie creciente de diluciones de etanol (50%, 60%, 70%, 90% y 100%), infiltrarlos durante la noche a temperatura ambiente, seguido de dos breves cambios de resina y, finalmente, incrustarlos en LR Blanco.
- A continuación, para orientar y evaluar las muestras, se pueden manchar las secciones semifinas (1 m) con azul de metileno/azure II.
- Por último, examine las secciones ultrafinas y doblemente teñidas a nivel ultraestructural con el TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En los COC que utilizaban ambos sistemas IVM, las células granulosas se adhirieron firmemente entre sí, y la mayoría de los COC recuperados tenían capas intactas de células cúmulos (Figura 1A,B). Además, se retuvo una proporción sustancial de células cúmulos.
Los resultados obtenidos del análisis de viabilidad de los COC confirmaron que ambos sistemas se aplicaban para la encapsulación de ovocitos porcinos en condiciones in vitro 3D aseguraron condiciones óptimas de crecimiento (Figura 2). En ambos grupos, sólo se observaron ovocitos de alta viabilidad, V1 a 13 %, V2 a 87 % para FAB y 10 % V1, y 90 % V2 para LM, respectivamente (Tabla 1).
Las mitocondrias, observadas por microscopía electrónica de transmisión (TEM), se distribuyeron uniformemente en ovocitos, su forma después de IVM eran similares a una cáscara45. Sólo unos pocos de ellos eran alargados, además, su agrupación se observó esporádicamente (Figura 1C,D). Se observó retículo endoplasmático, ya sea asociado con mitocondrias o libre en el citoplasma de ovocitos. Las gotas de lípidos aparecieron como pequeñas estructuras redondas oscuras y el aparato Golgi emergió con cisternas dilatadas(Figura 1C,D).
| V1 | V2 | V3 | V4 | ||||
| % | Número | % | Número | % | Número | % | |
| Fab | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| Número total de COCs: 144 | 16a | 128b | 0 | 0 | |||
Tabla 1. Resultados sobre la viabilidad de los COC después de la encapsulación utilizando perlas de fibrina-alginato (FAB) y microbiorrectores FEP, Mármoles Líquidos (LM). Los resultados se dieron como promedio. Los valores con superíndices (a, b) diferían estadísticamente significativamente (p <0.05).
Figura 1: Imágenes representativas que muestran la morfología y la ultraestructura de los COC después de una 96 h de encapsulación. (A) morfología de LOS COC dentro de la FAB - microscopía de luz; (B) morfología de COCs dentro de LM - microscopía de luz; C: ultraestructura de ovocitos (TEM) después del cultivo in vitro dentro de la FAB; D: Ultraestructura de ovocitos (TEM) después del cultivo in vitro dentro de LM. O: ovocitos; CCs: células cúmulos; ZP: zona pellucida; N: núcleo; M: mitocondrias; G: Aparato Golgi; ER: retículo endoplasmático; Lp: gota de lípidos; FA: filamentos de alginato y fibrina; FEP: polvo de copolímero de hexafluoropropileno y tetrafluoroetileno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes fluorescentes representativas de LOS COC después de 96 h de encapsulación. (A,B) Las imágenes obtenidas para los mismos COC después del cultivo in vitro utilizando FAB con dos filtros para visualizar la fluorescencia verde o la fluorescencia roja para las células vivas o muertas respectivamente y (C) fusión de ambos. (D,E) Las imágenes obtenidas para los mismos COC después del cultivo in vitro utilizando LM con dos filtros para visualizar la fluorescencia verde o la fluorescencia roja para las células vivas o muertas, respectivamente y( F) se fusionan de ellas. Barras de escala a 50 m. Los asteriscos blancos indican células sometidas a apoptosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La capacidad de mantener el crecimiento in vitro no sólo del ócito, sino también de las células cúmulos que lo rodean y al mismo tiempo apoyar su maduración es extremadamente esencial para las tecnologías de reproducción asistida exitosas y para promover la comprensión de las interacciones de células/ovocitos somáticos, especialmente en especies sometidas a un crecimiento folicular prolongado como seres humanos o cerdos. Las técnicas de IVM mejoradas continuamente se están convirtiendo en herramientas útiles para preservar las opciones reproductivas en casos de síndrome de ovario policístico (SOP), insuficiencia ovárica prematura o infertilidad definitiva (oncoterapia). Además, dado que ciertas disfunciones ováricas pueden ser causadas por el crecimiento folicular desregulado, la comprensión de los mecanismos moleculares y celulares que controlan el desarrollo adecuado del ovocitos puede proporcionar una visión importante de la fisiopatología y el tratamiento racional de estas condiciones. Los sistemas de cultivo in vitro que soportarían el mantenimiento de la arquitectura 3D de COCs durante el IVM, requieren un paso de encapsulación en una matriz o dentro de un biorreactor. Este trabajo describe un protocolo que se puede aplicar para la cultura de los ovocitos porcinos. Ambos sistemas de cultivo in vitro 3D presentados aquí para inducir el crecimiento y el desarrollo de COC porcino son fáciles de usar y permiten el control efectivo de la supervivencia de las células de ovocitos y cúmulos.
El primer método de cultivo in vitro de COC utilizando su encapsulación en cuentas de hidrogel de fibrina-alginato (FAB) que se presenta aquí permite un crecimiento de ovocitos 3D en un entorno de matriz con capacidad de respuesta celular activa. Los protocolos publicados anteriormente basados en hidrogeles de alginato se utilizaban generalmente para la investigación del desarrollo de folículos ováricos aislados de numerosas especies animales con resultados muy prometedores32. Curiosamente, independientemente de la composición final del hidrogel de alginato32 o el propio método de encapsulación46,estos estudios mostraron que los sistemas de cultivo 3D basados en perlas de alginato eran capaces de apoyar el crecimiento folicular y su supervivencia.
Los hidrogeles de alginato fueron suaves con los folículos, no afectando su posterior supervivencia o desarrollo in vitro. Del mismo modo, el protocolo de cultivo in vitro de los COC descrito por primera vez aquí, es adecuado para generar ovocitos de cerdo de buena calidad, como se documentó tanto a nivel morfológico como ultraestructural. La presencia de fibrinógeno en una solución de alginato y su gelificante simultáneo, da como resultado la formación de una red interpeetrante que crea y estabiliza aún más el entorno tridimensional. Debido al soporte estructural específico dentro de dicha matriz, los contactos de célula a célula y la comunicación paracrina entre ovocitos y células cúmulos se mantienen de forma similar a estos presentes in vivo.
Los dos pasos más críticos en el protocolo de maduración descritos en este documento son la transferencia de cápsulas FA de cámaras de incubación a placas de 96 pocillos que contienen MM (paso 2.10.) y la eliminación de COC de las cápsulas disueltas después de la degradación enzimática del alginato restante, utilizando liasa de alginato (paso 2.11.). Ambos pasos requieren una habilidad manual significativa y precisión para evitar, en el primer caso la destrucción de cápsulas, en el segundo - daños a los COC.
La principal fortaleza de este método, además de establecer condiciones óptimas para la maduración de ovocitos de un animal doméstico grande, es que durante el análisis utilizando TEM, microscopía ligera o microscopía confocal, no es necesaria la eliminación de cápsulas. El alginato no es una barrera al tomar imágenes. Dejar COCs en cápsulas facilita la manipulación durante el procedimiento de tinción.
El segundo cultivo in vitro COC presentado aquí es el que tiene el uso de LM, que generalmente son gotas antiadherentes cubiertas por partículas micro-escamas y obtenidas simplemente rodando pequeños volúmenes de un líquido en un polvo muy hidrófobo47. Estudios previos con el uso de LM para cultivo, entre otros fibroblastos48,glóbulos rojos49,organoides de un tumor38,células pancreáticas50 u ovocitos de oveja36 se han realizado utilizando politetrafluoroetileno (PTFE) como polímero hidrófobo para la preparación de las gotas. El PTFE es ampliamente utilizado en la clínica (por ejemplo, injertos cardiovasculares).
En este trabajo, presentamos, por primera vez, un método fiable para los microbiorres hechos de partículas FEP para el cultivo in vitro de COCs porcinos. El uso de FEP en el protocolo presentado, que es muy similar en composición y propiedades al PTFE, hace que la preparación de LM sea mucho más fácil. Este polvo es más suave que el PTFE y lo que es especialmente importante, es transparente. Esto a su vez simplifica el trabajo durante la toma de imágenes de estructuras cultivadas con su uso. La facilidad de formación de LM usando FEP es una ventaja definitiva de este método.
El paso más crítico en el protocolo de maduración descrito en este documento es recoger y transferir LM formado a una placa IVF Petri de 60 mm utilizando una punta de pipeta (pasos 3.3. y 3.4.). Estos pasos requieren una habilidad y precisión manuales significativas para evitar la destrucción de LM.
Posiblemente, la principal limitación de los protocolos de inducción de óocitos 3D presentados aquí es la dificultad relativamente grande en la obtención de material de investigación adecuado recogido de animales no tratados con antibióticos, esteroides anabólicos (es decir, nadrolone, boldenona) o acetato de melengestrol que promueven su rápido crecimiento. Estos esteroides, a pesar de su uso está prohibido en Europa, todavía se utilizan ampliamente en la cría de ganado industrial durante los últimos dos meses del período de engorde, que causa, entre otros, perturbación de la maduración sexual.
En conclusión, ambos sistemas 3D presentados aquí mantienen el entorno de cultivo in vitro gaseoso óptimo. También mantienen la organización 3D de los COC evitando su aplanamiento y la consiguiente interrupción de las uniones de separación, preservando así la relación funcional entre el ócito y las células foliculares circundantes, lo que es crucial para la maduración adecuada de los ovocitos. Por lo tanto, ambos modelos son una herramienta valiosa para la investigación básica en biología reproductiva y también pueden tener relevancia clínica, lo que conduce a un mejor tratamiento de la infertilidad. Además, también se pueden aplicar para el desarrollo de nuevos métodos biotecnológicos, así como para la mejora del ganado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores están muy agradecidos a: Dr Waclaw Tworzydlo (Departamento de Biología del Desarrollo y Morfología invertebrada, Instituto de Zoología e Investigación Biomédica, Universidad Jaguelónica) para instalaciones técnicas en TEM; a la Sra. Beata Snakowska (Departamento de Endocrinología, Instituto de Zoología e Investigación Biomédica, Universidad Jaguelónica) para la asistencia técnica; al Departamento de Biología Celular e Imagen, Instituto de Zoología e Investigación Biomédica, Universidad Jaguelónica, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokio, Japón). Este trabajo fue apoyado por la subvención 2018/29/N/NZ9/00983 del Centro Nacional de Ciencias de Polonia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
References
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L.
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T.
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D.
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).
