Summary
Hier werden zwei Protokolle für die Verkapselung von Schweineeioozyten unter 3D-Kulturbedingungen vorgestellt. In der ersten werden Cumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) in Fibrin-Alginat-Perlen eingekapselt. In der zweiten werden sie mit fluorierten Ethylenpropylenpulverpartikeln (Mikrobioreaktoren) umschlossen. Beide Systeme sorgen für optimale Bedingungen, um ihre 3D-Organisation aufrechtzuerhalten.
Abstract
In der Reproduktionsbiologie führte die biotechnologische Revolution, die mit künstlicher Befruchtung und Embryotransfertechnologie begann, zur Entwicklung von Techniken der assistierten Reproduktion wie Eizellen-In-vitro-Reifung (IVM), In-vitro-Fertilisation (IVF) und Klonen von Haustieren durch nuklearen Transfer aus somatomatischen Zellen. IVM ist die Methode von besonderer Bedeutung. Es ist die Plattformtechnologie für die Lieferung von ausgereiften, qualitativ hochwertigen Eizellen für Anwendungen wie die Verringerung des Erzeugungsintervalls bei kommerziell wichtigen oder gefährdeten Arten, die Forschung zur in vitro menschlichen Fortpflanzung und die Produktion von transgenen Tieren für Zelltherapien. Der Begriff Eizellenqualität umfasst seine Kompetenz, die Reifung abzuschließen, zu befruchten und so zu gesunden Nachkommen zu führen. Dies bedeutet, dass Eizellen von guter Qualität für eine erfolgreiche Befruchtung einschließlich IVF-Verfahren von größter Bedeutung sind. Dies wirft viele Schwierigkeiten auf, eine zuverlässige Kulturmethode zu entwickeln, die das Wachstum nicht nur menschlicher Eizellen, sondern auch anderer großer Säugetierarten unterstützen würde. Der erste Schritt in IVM ist die In-vitro-Kultur der Eizellen. Diese Arbeit beschreibt zwei Protokolle für die 3D-Kultur von Schweineeioozyten. Im ersten, 3D-Modell Cumulus-Oocyte-Komplexe (COCs) sind in einem Fibrin-Alginat-Perle-Intervenieren-Netzwerk gekapselt, in dem eine Mischung aus Fibrin und Alginat gleichzeitig gegelt werden. Im zweiten werden COCs in einem Tropfen von Medium suspendiert und mit fluoriertem Ethylenpropylen (FEP; einem Copolymer aus Hexafluorpropylen und Tetrafluorethylen) Pulverpartikeln zu Mikrobioreaktoren, die als Flüssigmarmore (LM) definiert sind, verkapselt. Beide 3D-Systeme erhalten die gasförmige In-vitro-Kulturumgebung. Sie erhalten auch die COCs 3D-Organisation, indem sie ihre Abflachung und die daraus resultierende Störung von Spaltknoten verhindern und so die funktionelle Beziehung zwischen der Eizelle und den umgebenden Follikelzellen erhalten.
Introduction
Die Entwicklung verschiedener Kultursysteme, einschließlich dreidimensionaler (3D) Systeme, zielt darauf ab, optimale Bedingungen für das Wachstum und die Reifung von Eizellen zu schaffen, die von den Follikel isoliert sind, selbst in frühesten Entwicklungsstadien. Dies ist von großer Bedeutung für assistierte Reproduktionstechniken (ART), insbesondere angesichts der steigenden Zahl von Frauen, die nach der Krebsbehandlung mit Unfruchtbarkeit zu kämpfen haben1. Die Reifung von Eizellen in In-vitro-Bedingungen (IVM) ist bereits eine etablierte Technik, die hauptsächlich für die In-vitro-Embryoerzeugung zum Zwecke der Reproduktion von Nutztieren verwendet wird2. Doch selbst wenn bei den meisten Säugetierarten hohe Reiferaten von Cumulus-Oozyten-Komplexen (COCs) erreicht werden können (Bereich 60 bis 90 %)3,ist ihre Entwicklungskompetenz immer noch unzureichend für die Bedürfnisse. Dies liegt daran, dass die Entwicklung der zygoten, die so bis zum Blastozystenstadium erhalten werden, gering ist und nach der Übertragung in Ersatztiere ihre Lebensfähigkeit auf Term reduziert wird. Folglich ist es notwendig, die Entwicklungskompetenz von Embryonen aus Eizellen zu erhöhen, die dem IVM-Verfahren unterzogen wurden4. Daher werden neue Reifungsmedien5 entwickelt und verschiedene Perioden der In-vitro-Kultur getestet6,7 zusammen mit der Supplementierung von Kulturmedien mit verschiedenen Wachstumsfaktoren und Molekülen8,9.
Der erste Schritt eines vollständigen IVM-Systems besteht darin, optimale Bedingungen für ein nachhaltiges Wachstum von Eizellen während der In-vitro-Kultur zu schaffen. Das Eizellenwachstum ist einer der spezifischen Indikatoren für die Fähigkeit der Oozyte, die Meiose wieder aufzunehmen10,11. Darüber hinaus muss ein geeignetes In-vitro-Kultursystem der Oozyten in der Lage sein, seine kernnukleare Reifung und zytoplasmatische Differenzierung zu unterstützen12. Die Morphologie des Cumulus-Oozyten-Komplexes ist ein weiterer wichtiger Indikator, der in ART-Kliniken verwendet wird, um die beste Oozyte für nachfolgende Schritte der In-vitro-Fertilisation (IVF) beim Menschen und Vieh auszuwählen12,13. Zu den morphologischen Merkmalen der untersuchten COCs gehören: der Oozytendurchmesser, seine Zytoplasmagranulation und die erste polare Körperintegrität14,15. Außerdem ist das Eizellenentwicklungspotential mit dem Aussehen und der Verdichtung von Cumuluszellen und der Anzahl ihrer Schichten, die die Oozyte umgeben, korreliert. Sehr wichtig für das geeignete In-vitro-Kultursystem der Oozyten ist auch die Aufrechterhaltung der oozyten-kumulus-Zellen und der Zytoskelettstabilität16,17,18,19. Bisher wurde das In-vitro-Oozytenwachstum innerhalb menschlicher COCs20nachgewiesen. Der Einsatz von Kuh-COCs führte auch zu Lebendgeburten. Diese wurden aus unreifen Eierstockfollikel isoliert und dann 14 Tage lang kultiviert, bis die Oozyte ausreichend groß war, um sich dem IVF-Verfahren zu unterziehen21. In ähnlicher Weise ergaben COCs, die von Pavian-Antralefollikel isoliert wurden und IVM nach In-vitro-Kultur unterworfen waren, Oozyten, die in der Lage waren, die Meiose mit einer normal erscheinenden Spindelstruktur wieder in die Metaphase II zu führen22. In dieser Studie versuchten die Autoren jedoch nicht, sie zu befruchten. Dennoch deuten solche Ergebnisse darauf hin, dass ein ähnliches Verfahren nicht nur auf diese speziellen Säugetierarten angewendet werden könnte, sondern auch auf menschliche Cumulus-Oozyten-Komplexe, die aus Follikel gewonnen werden, was es ermöglichen sollte, Eizellen von guter Qualität zu erhalten, die für eine erfolgreiche IVF-Technik geeignet sind.
Die oben beschriebenen Ergebnisse wurden mit der Anwendung konventioneller IVM-Protokolle erzielt, bei denen Eizellen in zweidimensionalen (2D) Systemen kultiviert wurden. Das Routineverfahren in 2D-Kultursystemen deckt Eizellen, eingetaucht in einen Tropfen eines geeigneten Kulturmediums, mit Mineralöl23,24ab. Es wird angenommen, dass eine Ölüberlagerung während der In-vitro-Oozytenkultur dazu dient, flüssigkeitsverdunstung zu verhindern und so die Aufrechterhaltung des richtigen pH-Werts und des osmotischen Drucks in der Kultur zu gewährleisten. Obwohl ein solches 2D-Kultursystem es ermöglicht, sogar bis zu 87% der reifen Schweineoozyten25zu erhalten, ist es erwiesen, dass die Mineralöl-Overlay verursacht erhebliche Diffusion von lipidlöslichen Materialien, die für die richtige Eizellen Entwicklung notwendig sind26. Zusätzlich, wegen Steroiden (Progesteron und Östrogene) Diffusion in das Mineralöl während der Oozytenkultur, eine Verzögerung der nuklearen Reifung und Verringerung der Entwicklungskompetenz Leistung von Schweineoozyten beobachtet wurde. Dies kann zu einer geringen Anzahl von Zygoten führen, die zusätzlich durch geringe Entwicklungskapazität bis zum Stadium der Blastozyste und durch schlechte Lebensfähigkeit nach dem Transfer in Empfängertiere gekennzeichnet sind27. Daher wird versucht, die Entwicklungskompetenz von Embryonen, die aus Eizellen stammen, die nach dem IVM-Verfahren gewonnen werden, zu erhöhen, indem optimale Bedingungen geschaffen werden, um sowohl zytoplasmatische als auch nukleare Reife von Eizellen zu erreichen, die zusammen mit CCs als Komplexe kultiviert werden, insbesondere mit dreidimensionalen (3D) Systemen. Verschiedene innovative 3D-In-vitro-Kultursysteme wurden in den letzten zwei Jahrzehnten entwickelt28,29. Diese wurden entwickelt, um die natürliche räumliche Organisation von Zellen zu erhalten und ihre Abflachung in Kulturgerichten zu vermeiden, was in den traditionellen 2D-Kulturen nicht erreicht werden kann. Die strukturelle und funktionale Aktivität kultivierter COCs kann durch die Aufrechterhaltung ihrer richtigen Architektur und eine ungestörte Kommunikation durch Spaltverbindungen zwischen verschiedenen Kompartimenten sichergestellt werden30. Die Eignung von Biogerüsten für die 3D-In-vitro-Kultur von Cumulus-Oozyten-Komplexen wurde mit natürlichen Biomaterialien wie verschiedenen Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM; Kollagen und Hyaluronsäure)31 oder inerten Polymeren (Alginat)32bewertet. Diese Versuche, die an mehreren Arten getestet wurden, brachten vielversprechende Ergebnisse in Bezug auf Dieoozyten-Meiose-Wiederaufnahme und die Erreichung ihrer vollen Kompetenz33,34,35. Bisher wurde jedoch kein 3D-System entwickelt, das für die von großen Haustieren isolierte COC-Reifung geeignet ist.
Diese Arbeit beschreibt zwei Protokolle, die für die 3D-Kultur von Schweine-COCs verwendet werden können. Das erste Protokoll beschreibt die Verkapselung in Fibrin-Alginat-Perlen (FAB). FAB kann durch gleichzeitiges Mischen einer Alginat- und Fibrinlösung gebildet werden, die einem synchronen Gelationsprozess unterzogen wird. Diese Kombination bietet eine dynamische mechanische Umgebung, da beide Komponenten zur Matrixsteifigkeit beitragen. Eine ähnliche Lösung wurde bereits für die Eierstockfollikelkultur und Reifung der Maus verwendet36. Im Falle des vorgelegten Protokolls werden zur Vermeidung eines vorzeitigen Abbaus des Alginat-Fibrin-Netzwerks entsprechend höhere Konzentrationen von Calciumchloridlösung verwendet, um einen schnellen und stabilen Gelationsprozess zu gewährleisten. Die dynamische mechanische Umgebung schafft ähnliche Bedingungen in der natürlichen intrafollikulären Umgebung, in der sich COCs befinden und die größer werden. Darüber hinaus zeigt die Arbeit repräsentative Ergebnisse von COCs 3D-Kultursystemen, in denen diese in einem Tropfen von Medium suspendiert und mit fluoriertem Ethylenpropylen (FEP; einem Copolymer von Hexafluorpropylen und Tetrafluorethylen) Pulverpartikeln verkapselt sind, um Mikrobioreaktoren (Liquid Marbles, LM) zu bilden. LM sind eine Form von 3D-Bioreaktor, die zuvor gezeigt haben, dass unter anderem das Wachstum von lebenden Mikroorganismen37, Tumorspheroide38 und embryonale Stammzellen39unterstützen. LMs wurden auch erfolgreich für Schaf-Eizellenkultur40verwendet. In den meisten Experimenten mit LMs wurden Bioreaktoren mit Polytetrafluorethylen (PTFE) Pulverbett mit einer Partikelgröße von 1 m41hergestellt. Das vorgestellte Protokoll verwendet FEP, das in Zusammensetzung und Eigenschaften den Fluorpolymeren PTFE sehr ähnlich ist. Aber FEP ist leichter formbar und weicher als PTFE und was besonders wichtig ist, ist es hochtransparent.
Beide 3D-Systeme erhalten die gasförmige In-vitro-Kulturumgebung. Sie erhalten auch die COCs 3D-Organisation, indem sie ihre Abflachung und daraus resultierende Störung von Spaltknoten verhindern und ihre funktionelle Beziehung zwischen der Eizelle und den umgebenden Follikelzellen erhalten.
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Protocol
Die folgenden Verfahren wurden vom Tierschutzausschuss am Institut für Zoologie und biomedizinische Forschung der Jagiellonen-Universität genehmigt.
1. Isolierung von Schweine-Cumulus-Oozyten-Komplexen
- Um Material für die Isolierung von Eierstockfollikel zu sammeln, werden in einem örtlichen Schlachthof Schweineeierstöcke aus präpubertären Golden (ca. 6-7 Monate mit einem Gewicht von 70 bis 80 kg) gesammelt. Wählen Sie in jedem Experiment etwa 20 Schweineeierstöcke aus 10 Tieren für die COCs-Isolierung aus.
HINWEIS: Unter der Annahme, dass jeder Eierstock 3–5 Follikel ergibt, variiert die Gesamtzahl der Follikel zwischen 60 und 100. - Eierstöcke in eine Thermoskanne mit steriler Phosphat-gepufferter Salin (PBS; pH 7,4; 38 °C) mit 1% AAS legen. Stellen Sie sicher, dass das Versuchsmaterial innerhalb von 1 h ins Labor transportiert wird, wo es zweimal mit sterilen PBS mit Antibiotika abspült wird.
- Nach dem Spülen der Eierstöcke auf das mit HM-Medium gefüllte Becherglas übertragen und für die Zeit aller Manipulationen bei 38 °C in einem Inkubator lagern.
HINWEIS: Für optimale Ergebnisse bei der Verarbeitung von Eizellen führen Sie alle Verfahren im DMEM/F12-Medium (Handlingmedium, HM) mit der Zugabe von 2,5 % Antibiotika/Antimykotiklösung (AAS) und 10 % fetalem Rinderserum (FBS) durch und kontrollieren Sie den pH-Wert aufCO2-Niveau in der Umgebung, auf einem Heiztisch mit Temperaturregelung (38 °C) und unter der laminaren Fließhaube, um die bakterielle Kontamination zu minimieren. - Aus großen Schweinefollikel (6-8 mm Durchmesser) follikelische Flüssigkeit (FF) durch Aspiration und Zentrifugation bei 100 x g für 10 min bei Raumtemperatur sammeln. Danach filtern Sie den Überstand mit einer sterilen Spritze, die an 0,2 m Membranporenfiltern befestigt ist, und fangen Sie bei -80 °C ein.
HINWEIS: Verwenden Sie eine Insulinspritze (u- 40) zur Aspiration von Follikelflüssigkeit. - Stellen Sie sicher, dass nur gesunde, mittelgroße Follikel (4-6 mm Durchmesser) für die COCs-Isolierung42ausgewählt werden.
HINWEIS: COCs der Klasse I, die eine intakte und runde Oozyte mit homogenem Ooplasma und mehrschichtigem (mindestens 3-4) kompakten Cumulus besitzen, gelten als geeignet für das weitere 3D-IVM-Verfahren43. - Um COCs zu isolieren, übertragen Sie 2-3 Eierstöcke auf eine sterile Petrischale mit 10 cm Durchmesser, gefüllt mit HM. Isolieren Sie COCs von mittelgroßen Follikel, indem Sie eines der folgenden Verfahren befolgen.
- Schneiden Sie die Oberfläche der hervorstehenden Eierstockfollikel vorsichtig mit einer sterilen chirurgischen Klinge 15C. Dadurch wird die Follikelflüssigkeit zusammen mit COCs in die Petrischale abfließen.
- Den Follikelgehalt mit einer 28 G Nadel mit einer Größe von 5/8" an einer Einwegspritze ansaugen und in die Petrischale übertragen.
HINWEIS: Entsorgen Sie die Überreste von Eierstockgewebe. Nachfolgende Isolationsstadien werden unter einem Stereomikroskop durchgeführt.
- Bereiten Sie 3–5 60 mm IVF Petrischalen zu.
- Fügen Sie 1 ml HM in die zentralen Brunnen und legen Sie einen 3-4 Tropfen HM (50 l pro Tropfen) in ihre äußeren Ringe.
- Dann, mit einer Polycarbonat-Mikropipette, bewegen Sie die unbeschädigten COCs zu Tropfen von HM in den äußeren Ringen, um sie kurz für 3-4 Mal zu spülen.
- Am Ende, übertragen Sie sie einzeln in den zentralen Brunnen. Bewahren Sie diese IVF-Platten für weitere Verfahren in einem Inkubator auf.
- Nachdem COCs gesammelt wurden, führen Sie den endgültigen Auswahlschritt aus, indem Sie sie nach dem Zufallsprinzip zwei verschiedenen IVM-Kapselungsprotokollen zuweisen, die unten aufgeführt sind.
2. Verkapselung in Fibrin-Alginat-Hydrogelperlen
- 1 ml 50 I.E./ml Thrombin in Tris-gepufferter Salin (TBS; pH 7,4) mit 100 ml CaCl2 in einem 2,0 ml sterilen Mikrozentrifugenrohr vorbereiten.
- Bereiten Sie die Fibrinogen-Stammlösung (50 mg/ml in TBS) vor und halten Sie sie gefroren.
HINWEIS: Um Verklumpungen beim Lösen von Fibrinogen in TBS zu vermeiden, erhitzen Sie TBS auf 37 °C.- Am Tag des Eingriffs, tauen Sie es langsam auf Eis und direkt vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur bringen.
- Kurz vor der Verwendung mischen bei einem Verhältnis von 1:1 0,5% Alginatlösung und 50 mg/ml Fibrinogenlösung, um schließlich 2 ml (FA) zu erhalten. In einem sterilen Mikrozentrifugenrohr wirbelt das Gemisch sanft aus. Vermeiden Sie Blasen zu machen.
- Um "Inkubationskammern" vorzubereiten, tragen Sie dünne Streifen von Paraffinfolien auf die Glasmikroskop-Dias auf.
HINWEIS: Wischen Sie die Dias vor Gebrauch mit 70 % EtOH ab. Eine Inkubationskammer wird mit zwei Dias gebildet. Um sie zu trennen, legen Sie 3 mm Abstandshalter auf einen von ihnen. - Pipette 7,5 l Tropfen der FA-Mischung auf diese Paraffinfolie beschichtetGlasrutsche, die auch Trennabstandhalter hat. Auf einem DiaPlatz 8-10 Tropfen, in zwei Reihen angeordnet.
- Übertragen Sie mit einer Mikropipette 3-5 COCs zusammen mit einem Minimalvolumen (bis zu 5 l) reifungsmedium (MM), und legen Sie sie genau in die Mitte des FA-Tropfens. Dieses Verfahren erfordert gute handwerkliche Fähigkeiten und Präzision.
HINWEIS: Das Reifungsmedium (MM) besteht aus DMEM/F12, ergänzt durch 10 I.E./ml PMSG, 10 I.E./ml hCG, 10% FBS und 50% Porcinfollikelflüssigkeit (FF), die in Schritt 1.4 gesammelt werden. - Fügen Sie 7,5 L Thrombin/Ca2+ Lösung auf jedem FA-Tropfen hinzu, nur um sie abzudecken. Es gibt keine Notwendigkeit, sie zu mischen, weil das Gel fast sofort bildet.
- Bedecken Sie die Inkubationskammer, indem Sie die zweite, zuvor vorbereitete Glasrutsche auf die FA-Kapseln auftragen. Mit einer sehr vorsichtigen, aber festen Bewegung, drehen Sie die Kammer auf den Kopf und legen Sie sie in eine 100 mm Petrischale mit feuchtem Filterpapier ausgekleidet, um ein Trocknen zu vermeiden.
- Dann die Petrischale für ca.2 5-7 min auf den 5% CO2-Inkubator (38 °C) übertragen. Danach werden FA-Kapseln trüb wegen der gleichzeitigen Gelation von Fibrin und Alginat.
- Übertragen Sie FA-Kapseln in 96 Brunnenplatten (eine Kapsel pro Brunnen), die 100 l MM pro Brunnen enthalten.
HINWEIS: Um die gebildeten FA-Kapseln nicht zu beschädigen, führen Sie diesen Schritt sorgfältig mit der Verwendung von chirurgischen Zangen durch. - Ersetzen Sie alle 2 Tage die Hälfte des MM (50 l) durch eine frische, vorausgeglichene MM. Bild COCs mit einem invertierten Lichtmikroskop (bei 10-facher Vergrößerung).
HINWEIS: Kulturbedingungen für COCs FA-Kultur: 38 °C, unter einerCO2-Atmosphäre von 5 % und relativer Luftfeuchtigkeit 95 %. Nach 4 Tagen IVM erscheinen die Hydrogele aufgrund des fortschreitenden Abbaus der Fibrinkomponente fast klar. Das verbleibende Alginat sollte enzymatisch abgebaut werden - durch Alginatlyase, ein pflanzliches Enzym, das Alginat spezifisch abbaut und keine Auswirkungen auf tierische Zellen hat.- Entfernen Sie MM aus Brunnen, die die Kapseln enthalten, und fügen Sie 100 l von 10 I.E./ml Alginatlyase in DMEM hinzu. Lassen Sie die Kulturplatte im Inkubator für 25-30 min.
- Entfernen Sie COCs aus den gelösten Kapseln.
HINWEIS: Dies kann mit einer geschnittenen Pipettenspitze erfolgen. - Nach mehreren Waschungen in einem frischen DMEM, übertragen COCs auf den Innenring einer IVF-Schale (5-10 COCs pro Schale), die PBS enthält. Verwenden Sie sie nun für weitere morphologische oder biochemische Analysen.
3. Verkapselung in superhydrophoben fluorierten Ethylenpropylen (FEP) Mikrobioreaktoren.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle IVM-Verfahren auf thermostatisch gesteuerten Tisch durchgeführt werden und COCs während ihrer gesamten Handhabung bei 38 °C gehalten werden.
- Bereiten Sie eine 30 mm Petrischale mit 5 g FEP-Pulverbett-Durchschnittspartikelgröße von 1 m vor.
HINWEIS: Es ist wichtig, frisches FEP-Pulver zu verwenden. Das wiederverwendete FEP neigt dazu, Klumpen zu aggregieren und bildet Klumpen. - Verteilen Sie ein einzelnes Tröpfchen MM (ca. 30 L in Volumen) mit 3-5 COCs, die in Schritt 1.6 isoliert sind, auf das Bett des FEP-Pulvers. Drehen Sie die Platte sanft in einer kreisförmigen Bewegung, um sicherzustellen, dass diese Partikel vollständig die Oberfläche des Flüssigkeitstropfens und der gebildeten flüssigen Murmeln (LM) bedeckten.
- Nehmen Sie geformte LM mit einer Pipette mit 1.000 l Spitze auf.
HINWEIS: Schneiden Sie die Pipettenspitze an der Kante, um sie auf den Durchmesser des LM (4-5 mm) unterzubringen. Der ungefähre Durchmesser einer solchen vorbereiteten Spitze sollte etwas größer sein als der des LM. - Bereiten Sie mehrere 60 mm IVF Petrischalen zu. Fügen Sie 3-4 ml steriles Wasser zu den äußeren Ringen hinzu, um die Feuchtigkeitskammer vorzubereiten. Als nächstes legen Sie ein LM in den zentralen Brunnen.
HINWEIS: Dieses Verfahren erfordert gute handwerkliche Fähigkeiten und Präzision - wenn der Marmor achtlos platziert wird oder sogar aus einer niedrigen Höhe fällt, wird er zerstört. - Murmeln 4 Tage bei 38 °C in2 5 % CO2-Inkubator inkubieren.
- Ändern Sie das Medium täglich nach dem Verfahren: Wenden Sie 30 l MM auf jedes LM an, was ihre Ausbreitung bewirkt, da der direkte Flüssigkeitskontakt die Hydrophobie der beschichteten FEP-Pulver stört. Wenn sich der Marmorgehalt auflöst, übertragen Sie die aus dem Bioreaktor freigesetzten COCs auf einen Tropfen frisches MM in der Petrischale.
HINWEIS: Um freigesetzte COCs präzise zu übertragen, verwenden Sie eine Polycarbonat-Mikropipette. - Nach mehreren Waschungen in MM (3-4 mal) zur Entfernung von FEP-Partikeln, übertragen Sie sie mit 30 l frischem MM auf das FEP-Pulverbett. Drehen Sie die Platte vorsichtig in einer kreisförmigen Bewegung, um sicherzustellen, dass die Pulverpartikel die Oberfläche des Flüssigkeitstropfens vollständig bedeckt und ein neues LM bilden.
- Folgen Sie dann dem Verfahren aus den Schritten 3.3-3.4.
HINWEIS: Die transparente Beschichtung von FEP-Pulver ermöglicht die Überwachung des LM-Gehalts mit Lichtmikroskop.
- Ändern Sie das Medium täglich nach dem Verfahren: Wenden Sie 30 l MM auf jedes LM an, was ihre Ausbreitung bewirkt, da der direkte Flüssigkeitskontakt die Hydrophobie der beschichteten FEP-Pulver stört. Wenn sich der Marmorgehalt auflöst, übertragen Sie die aus dem Bioreaktor freigesetzten COCs auf einen Tropfen frisches MM in der Petrischale.
4. Charakterisierung von COCs nach 96-h IVM-Verfahren mit zwei 3D-Systemen
HINWEIS: Um die Effizienz der verwendeten IVM-Systeme zu bestimmen, bewerten Sie COCs morphologisch unter einem Lichtmikroskop. Verwenden Sie zusätzlich doppelfluoreszierende Etikettierung mit Calcein AM und Ethidium homodimer (EthD-1) Farbstoffen für die Analyse der COCs-Lebensfähigkeit44.
- Morphologische Untersuchung von Eizellen nach dem IVM durch Licht- und Fluoreszenzmikroskopie.
- Wasch-COCs (sowohl solche, die aus der Kultur mit FAB abgeleitet wurden, als auch solche von LM) mit 38 °C 1x PBS.
ANMERKUNG: Um den Umgang mit COCs zu erleichtern und sie während des Färbevorgangs nicht zu beschädigen, verwenden Sie eine 96- oder 48-Well-Platte und führen Sie jeden Färbeschritt durch, indem Sie die COCs auf nachfolgende Brunnen übertragen. - Inkubieren Sie sie in 100 l mit 1,6 mM Calcein AM und 5,5 mM EthD-1 für 30–45 min bei 37 °C. Beide Stoffe in 1x PBS verdünnen.
HINWEIS: Da es sich um einen zweifarbigen Fluoreszenz-Assay handelt, führen Sie diesen Schritt im Dunkeln aus. - Nach der Inkubation waschen Sie das COC zweimal in PBS und tauchen Sie es dann in ein Antifade-Montagemedium ein, das entwickelt wurde, um eine schnelle Photobleichung von fluoreszierenden Proteinen und fluoreszierenden Farbstoffen zu verhindern (Materialtabelle).
HINWEIS: Schützen Sie die Ränder des Deckglases vor dem Trocknen mit jedem Nagellack. - Visualisieren Sie gebeizte Proben unter einem konfokalen Laserscanmikroskop.
ANMERKUNG: Um die Fluoreszenz beider Sonden (d. h. Calcein und Ethidium homodimer-1, EthD-1) zu erregen, stimmen Sie einen Argonlaser auf 488nm ab. Die emittierte Fluoreszenz wird durch einen dreifachen dichroitischen Filter 488/561/633 getrennt und dann bei 505-570 nm für den grünen (Calcein) und bei 630-750 nm für den roten (EthD-1) gemessen. - Klassifizieren Sie COCs in vier Kategorien, indem Sie eine modifizierte Klassifizierung verwenden, die auf Eierstockfollikel in der Kultur angewendet wird, die auf konfokaler Fluoreszenzbildgebung basieren, abhängig vom Prozentsatz der toten Granulosazellen35. V1: COCs mit geschätzten 100% lebensfähigen CCs; V2: COCs mit 10 % der toten CCs; V3: COCs mit 10–50% der toten CCs; V4: COCs mit 50% der toten CCs.
ANMERKUNG: Technisch ist es schwierig, die Lebensfähigkeit der Eizelle mit dem lebend toten Assay zu beurteilen; daher sollte sie z. B. durch die Analyse der mitochondrialen Ultrastruktur oder Aktivität geschätzt werden.
- Wasch-COCs (sowohl solche, die aus der Kultur mit FAB abgeleitet wurden, als auch solche von LM) mit 38 °C 1x PBS.
- Untersuchung der Ultrastruktur der Eizellen nach dem IVM durch Transmissionselektronenmikroskopie.
- Fix COCs in 100 l 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer (pH 7,2, Raumtemperatur) für 2 h.
- CoCs in 100 l 0,1 M Natrium-Cakodylate-Puffer (über Nacht bei 4 °C) eintauchen und im selben Puffer ausspülen.
- Postfix-COCs mit 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M Natrium-Cacodylatpuffer (Raumtemperatur) für 1 h.
- Nach der Färbung in Uranylacetat (1 %), dehydrieren COCs in einer zunehmenden Reihe von Ethanolverdünnungen (50%, 60%, 70%, 90% und 100%), infiltrieren sie über Nacht bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei kurzen Harzwechseln und schließlich in LR White einbetten.
- Um als Nächstes Proben zu orientieren und auszuwerten, färben Sie halbdünne Abschnitte (1 m) mit Methylenblau/Azuraum II.
- Schließlich untersuchen Sie ultradünne, doppelt gefärbte Abschnitte auf ultrastruktureller Ebene mit dem TEM.
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Representative Results
Bei COCs, die beide IVM-Systeme verwenden, hafteten die Granulosa-Zellen fest aneinander, und die meisten der zurückgewonnenen COCs hatten intakte Schichten von Cumuluszellen (Abbildung 1A,B). Zusätzlich wurde ein erheblicher Teil der Cumuluszellen beibehalten.
Die Ergebnisse der COCs-Lebensfähigkeitsanalyse bestätigten, dass beide Systeme, die für die Verkapselung von Schweineeioozyten in 3D-In-vitro-Bedingungen angewendet wurden, optimale Wachstumsbedingungen gewährleisteten (Abbildung 2). In beiden Gruppen wurden nur eidestragreiche Eizellen beobachtet, V1 = 13 %, V2 = 87 % für FAB und 10 % V1 bzw. 90 % V2 für LM(Tabelle 1).
Mitochondrien, beobachtet durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), waren gleichmäßig in Eizellen verteilt, ihre Form nach IVM waren schalenartig45. Nur wenige von ihnen waren länsiert, außerdem wurde ihre Clusterbildung sporadisch beobachtet (Abbildung 1C,D). Endoplasmatisches Retikulum wurde beobachtet, entweder mit Mitochondrien assoziiert oder frei im Oozyten-Zytoplasma. Lipidtröpfchen erschienen als kleine dunkle runde Strukturen und Golgi-Apparat emit erweiterten Zisternen entstanden (Abbildung 1C,D).
| V1 | V2 | V3 | V4 | ||||
| % | Anzahl | % | Anzahl | % | Anzahl | % | |
| Fab | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| COCs Gesamtzahl: 144 | 16a | 128b | 0 | 0 | |||
Tabelle 1. Ergebnisse zur Lebensfähigkeit von COCs nach Verkapselung mit Fibrin-Alginat-Perlen (FAB) und Mikrobioreaktoren FEP, Flüssigmaren (LM). Die Ergebnisse wurden als Durchschnitt angegeben. Die Werte mit Hochgestellten (a, b) unterschieden sich statistisch signifikant (p <0.05).
Abbildung 1: Repräsentative Bilder, die die Morphologie und Ultrastruktur von COCs nach einer Verkapselung von 96 h zeigen. (A) Morphologie von COCs in FAB - Lichtmikroskopie; (B) Morphologie von COCs innerhalb von LM - Lichtmikroskopie; C: Oozyten-Ultrastruktur (TEM) nach In-vitro-Kultur innerhalb von FAB; D: Eizellen-Ultrastruktur (TEM) nach In-vitro-Kultur in LM. O: Eizelle; CCs: Cumuluszellen; ZP: zona pellucida; N: Kern; M: Mitochondrien; G: Golgi-Apparat; ER: endoplasmatisches Retikulum; Lp: Lipidtröpfchen; FA: Alginat- und Fibrin-Filamente; FEP: Pulver aus Copolymer aus Hexafluorpropylen und Tetrafluorethylen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative fluoreszierende Bilder von COCs nach 96 h Verkapselung. (A,B) Die Bilder, die für die gleichen COCs nach In-vitro-Kultur mit FAB mit zwei Filtern erhalten wurden, um grüne Fluoreszenz oder rote Fluoreszenz für lebende bzw. abgestorbene Zellen zu visualisieren bzw. (C) verschmelzen von beiden. (D,E) Die Bilder, die für die gleichen COCs nach In-vitro-Kultur mit LM mit zwei Filtern erhalten wurden, um grüne Fluoreszenz oder rote Fluoreszenz für lebende bzw. abgestorbene Zellen zu visualisieren, bzw. (F) verschmelzen von ihnen. Skalenbalken = 50 m. Weiße Sternchen zeigen Zellen an, die einer Apoptose unterzogen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Fähigkeit, das In-vitro-Wachstum nicht nur der Eizelle, sondern auch der sie umgebenden Cumuluszellen aufrechtzuerhalten und gleichzeitig seine Reifung zu unterstützen, ist äußerst wichtig für die erfolgreichen assistierten Reproduktionstechnologien und für die Förderung des Verständnisses somatischer Zell-Oozyten-Wechselwirkungen, insbesondere bei Arten, die einem längeren Follikelwachstum wie Menschen oder Schweinen leben. Kontinuierlich verbesserte IVM-Techniken werden immer nützlicher Werkzeug, um Fortpflanzungsmöglichkeiten in Fällen von polyzystischem Ovarialsyndrom (PCOS), vorzeitigem Eierstockversagen oder definitiver Unfruchtbarkeit (Onkotherapie) zu erhalten. Darüber hinaus, da bestimmte Eierstock-Dysfunktionen durch dysreguliertes follikuläres Wachstum verursacht werden könnten, das Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen, die die richtige Entwicklung der Oozyte steuern, kann wichtige Einblicke in die Pathophysiologie und rationale Behandlung dieser Bedingungen bieten. In-vitro-Kultursysteme, die die Aufrechterhaltung der COCs-3D-Architektur während IVM unterstützen würden, erfordern einen Schritt der Verkapselung in einer Matrix oder innerhalb eines Bioreaktors. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, das für die Kultur der Schweineeizellen angewendet werden kann. Beide hier vorgestellten 3D-In-vitro-Kultursysteme, um das Wachstum und die Entwicklung von Schweine-COCs zu induzieren, sind benutzerfreundlich und ermöglichen eine effektive Kontrolle des Überlebens von Eizellen und Cumuluszellen.
Die erste hier vorgestellte In-vitro-Kulturmethode von COCs, die ihre Verkapselung in Fibrin-Alginat-Hydrogelperlen (FAB) verwenden, ermöglicht ein 3D-Oozytenwachstum in einer aktiv zellresponsiven Matrixumgebung. Zuvor veröffentlichte Protokolle auf Basis von Alginat-Hydrogelen wurden in der Regel für die Untersuchung der Entwicklung von Eierstockfollikel aus zahlreichen Tierarten mit sehr vielversprechenden Ergebnissen32verwendet. Interessanterweise zeigten diese Studien unabhängig von der endgültigen Zusammensetzung des Alginathydrogels32 oder der Verkapselungsmethode selbst46,dass Alginatperlen-basierte 3D-Kultursysteme in der Lage waren, das follikuläre Wachstum und ihr Überleben zu unterstützen.
Alginat-Hydrogele waren sanft auf die Follikel, ohne ihr weiteres Überleben oder entwicklung in vitro zu beeinflussen. In ähnlicher Weise eignet sich das hier erstmals beschriebene In-vitro-Kulturprotokoll von COCs zur Erzeugung hochwertiger Schweineeizellen, da es sowohl auf morphologischer als auch auf ultrastruktureller Ebene dokumentiert wurde. Das Vorhandensein von Fibrinogen in einer Alginatlösung und deren gleichzeitiges Gelieren führt zur Bildung eines durchdringenden Netzwerks, das die dreidimensionale Umgebung schafft und weiter stabilisiert. Aufgrund der spezifischen strukturellen Unterstützung innerhalb einer solchen Matrix werden Zell-zu-Zell-Kontakte und parakrine Kommunikation zwischen Eizellen und Cumuluszellen ähnlich wie diese in vivo beibehalten.
Die beiden wichtigsten Schritte im in diesem Dokument beschriebenen Reifungsprotokoll sind die Übertragung von FA-Kapseln aus Inkubationskammern in 96-Well-Platten, die MM enthalten (Schritt 2.10.) und die Entfernung von COCs aus den gelösten Kapseln nach enzymatischer Degradierung des verbleibenden Alginats unter Verwendung von Alginatlyase (Schritt 2.11.). Beide Schritte erfordern erhebliche manuelle Geschicklichkeit und Präzision, um im ersten Fall die Zerstörung von Kapseln zu vermeiden, im zweiten - Schäden an COCs.
Die Hauptstärke dieser Methode besteht neben der Schaffung optimaler Bedingungen für die Eizellenreifung eines großen Haustieres darin, dass bei der Analyse mit TEM, Lichtmikroskopie oder konfokaler Mikroskopie keine Kapselentfernung erforderlich ist. Alginat ist keine Barriere bei der Bildgebung. Das Verlassen von COCs in Kapseln erleichtert die Manipulation während des Färbevorgangs.
Die zweite COC-In-vitro-Kultur, die hier vorgestellt wird, ist die mit der Verwendung von LM, die in der Regel Antihafttröpfchen sind, die von mikroskaligen Partikeln bedeckt und durch einfaches Rollen kleiner Mengen einer Flüssigkeit in einem sehr hydrophoben Pulver gewonnen werden47. Frühere Studien mit der Verwendung von LM für Kultur, unter anderem Fibroblasten48, rote Blutkörperchen49, Organoid eines Tumors38, Bauchspeicheldrüsenzellen50 oder Schafeizellen36 wurden mit Polytetrafluorethylen (PTFE) als hydrophobepolymere zur Herstellung der Tröpfchen durchgeführt. PTFE ist in der Klinik weit verbreitet (z.B. Kardiolartransplantate).
In dieser Arbeit präsentieren wir erstmals eine zuverlässige Methode für Mikrobioreaktoren aus FEP-Partikeln für die In-vitro-Kultur von Schweine-COCs. Die Verwendung von FEP im vorgestellten Protokoll, das in Zusammensetzung und Eigenschaften dem PTFE sehr ähnlich ist, erleichtert die Herstellung von LM erheblich. Dieses Pulver ist weicher als PTFE und was besonders wichtig ist, ist es transparent. Dies wiederum vereinfacht die Arbeit bei der Abbildung von Strukturen, die mit ihrer Verwendung kultiviert werden. Die einfache Formung von LM mit FEP ist ein klarer Vorteil dieser Methode.
Der wichtigste Schritt im in diesem Dokument beschriebenen Reifungsprotokoll ist das Aufnehmen und Übertragen von geformtem LM in 60 mm IVF Petrischale mit einer Pipettenspitze (Schritte 3.3. und 3.4.). Diese Schritte erfordern erhebliche manuelle Fähigkeiten und Präzision, um die Zerstörung von LM zu vermeiden.
Möglicherweise, die Hauptbeschränkung der 3D-Oozyten-Reifung Sinduktionprotokolle hier vorgestellt ist die relativ große Schwierigkeit bei der Beschaffung von richtigen Forschungsmaterial von Tieren nicht mit Antibiotika behandelt gesammelt, anabole Steroide (d.h., Nadrolon, Boldenon) oder Melengestrolacetat, die ihr schnelles Wachstum fördern gesammelt. Diese Steroide, obwohl ihre Verwendung in Europa verboten, sind immer noch weit verbreitet in der industriellen Viehzucht während der letzten zwei Monate der Mastperiode, die unter anderem verursacht gestörte sexuelle Reifung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass beide hier vorgestellten 3D-Systeme die optimale gasförmige In-vitro-Kulturumgebung erhalten. Sie erhalten auch die COCs 3D-Organisation, indem sie ihre Abflachung und die daraus resultierende Störung von Spaltknoten verhindern und so die funktionelle Beziehung zwischen der Eizelle und den umgebenden Follikelzellen erhalten, was für die richtige Eizellenreifung entscheidend ist. Somit sind beide Modelle ein wertvolles Instrument für die Grundlagenforschung in der Reproduktionsbiologie und können auch klinische Relevanz haben, was zu einer verbesserten Behandlung von Unfruchtbarkeit führt. Darüber hinaus können sie auch für die Entwicklung neuartiger biotechnologischer Methoden sowie für die Verbesserung der Tierhaltung eingesetzt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren sind sehr dankbar für: dr Waclaw Tworzydlo (Department of Developmental Biology and Invertebrate Morphology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Jagiellonian University) für technische Einrichtungen in TEM; an Frau Beata Snakowska (Abteilung für Endokrinologie, Institut für Zoologie und Biomedizinische Forschung, Jagiellonen-Universität) für technische Hilfe; an die Abteilung für Zellbiologie und Bildgebung, Institut für Zoologie und Biomedizinische Forschung, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokio, Japan). Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium 2018/29/N/NZ9/00983 vom National Science Centre Poland unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
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