Summary
Présenté ici sont deux protocoles pour l’encapsulation des ovocytes porcins dans les conditions de culture 3D. Dans le premier, les complexes cumulus-oocytes (COC) sont encapsulés dans des perles de fibrine-alginate. Dans la seconde, ils sont enfermés avec des particules de poudre d’éthylène fluoré (microbioréacteurs). Les deux systèmes assurent des conditions optimales pour maintenir leur organisation 3D.
Abstract
En biologie de la reproduction, la révolution biotechnologique qui a commencé avec l’insémination artificielle et la technologie de transfert d’embryons a conduit au développement de techniques de procréation assistée telles que la maturation in vitro des ovocytes (IVM), la fécondation in vitro (FIV) et le clonage d’animaux domestiques par transfert nucléaire de cellules somatiques. IVM est la méthode particulièrement importante. C’est la technologie de plate-forme pour la fourniture d’ovocytes matures et de bonne qualité pour des applications telles que la réduction de l’intervalle de génération chez les espèces commercialement importantes ou en voie de disparition, la recherche sur la reproduction humaine in vitro, et la production d’animaux transgéniques pour les thérapies cellulaires. Le terme qualité des ovocytes inclut sa compétence pour compléter la maturation, être fécondé, ce qui entraîne une progéniture en bonne santé. Cela signifie que les ovocytes de bonne qualité sont primordiaux pour la fécondation réussie, y compris les procédures de FIV. Cela pose de nombreuses difficultés pour développer une méthode de culture fiable qui soutiendrait la croissance non seulement des ovocytes humains, mais aussi d’autres espèces de grands mammifères. La première étape de l’IVM est la culture in vitro des ovocytes. Ce travail décrit deux protocoles pour la culture 3D des ovocytes porcins. Dans le premier, les complexes cumulus-oocytes de modèle 3D (COC) sont encapsulés dans un réseau d’interpénétration de perles fibrine-alginate, dans lequel un mélange de fibrin et d’alginate sont gélifiés simultanément. Dans le second, les COC sont suspendus dans une goutte de particules moyennes et encapsulées avec du propylène fluoré (FEP; un copolymère d’hexafluoropropylène et de tétrafluoroéthylène) pour former des microbioréacteurs définis sous le nom de marbres liquides (LM). Les deux systèmes 3D maintiennent l’environnement gazeux de culture in vitro. Ils maintiennent également l’organisation des COC 3D en empêchant leur aplatissement et la perturbation conséquente des jonctions d’écart, préservant ainsi la relation fonctionnelle entre les ovocytes, et les cellules folliculaires environnantes.
Introduction
Le développement de divers systèmes culturels, y compris les systèmes tridimensionnels (3D), vise à fournir des conditions optimales pour la croissance et la maturation des ovocytes isolés des follicules, même aux premiers stades de développement. Ceci est d’une grande importance pour les techniques de procréation assistée (TAR), en particulier compte tenu du nombre croissant de femmes qui sont aux prises avec l’infertilité après le traitement du cancer1. La maturation des ovocytes dans des affections in vitro (IVM) est déjà une technique bien établie principalement utilisée pour la génération d’embryons in vitro aux fins de la reproduction du bétail2. Toutefois, chez la plupart des espèces de mammifères, même si des taux élevés de maturation des complexes cumulus-ovocytes (COC) peuvent être atteints (gamme 60 à 90 %)3, leur compétence en développement est encore insuffisante pour répondre aux besoins. C’est parce que le développement des zygotes obtenus de telle manière même jusqu’au stade blastocyste est faible et après le transfert dans les animaux de substitution leur viabilité à terme est réduite. Par conséquent, il est nécessaire d’accroître la compétence développementale des embryons obtenus à partir d’ovocytes soumis à la procédure IVM4. Par conséquent, de nouveaux supports de maturation5 sont en cours d’élaboration et diverses périodes de culture in vitro sont testées6,7 avec la supplémentation des médias de culture avec divers facteurs de croissance et molécules8,9.
La première étape de tout système ivm complet est de créer des conditions optimales pour une croissance durable des ovocytes pendant la culture in vitro. La croissance des ovocytes est l’un des indicateurs spécifiques de la capacité de l’ovocyte à reprendre la méiose10,11. En outre, un système de culture in vitro approprié d’ovocytes doit être capable de soutenir sa maturation nucléaire et sa différenciation cytoplasmique12. La morphologie du complexe cumulus-oocytes est un autre indicateur important utilisé dans les cliniques de TAR pour sélectionner le meilleur ovocyte pour les étapes suivantes de la fécondation in vitro (FIV) procédure chez l’homme et le bétail12,13. Parmi les caractéristiques morphologiques des COC considérées sont: le diamètre des ovocytes, sa granulation de cytoplasme et la première intégrité du corps polaire14,15. En outre, le potentiel de développement des ovocytes est corrélé à l’apparence et au compactage des cellules cumulus et au nombre de leurs couches entourant les ovocytes. Très important pour le système approprié de culture in vitro d’ovocytes est également le maintien des cellules d’ovocyte-cumulus interactions appropriées et la stabilité de cytosquelette16,17,18,19. Jusqu’à présent, la croissance in vitro des ovocytes au sein des COC humains a été démontrée20. L’utilisation de COC de vache a également entraîné des naissances vivantes. Ceux-ci ont été isolés des follicules ovariens immatures et ensuite cultivés pendant 14 jours jusqu’à ce que l’ovocyte était suffisamment grand pour subir la procédure de FIV21. De même, les COC isolés des follicules antrals de babouin, soumis à l’IVM après la culture in vitro ont produit des ovocytes capables de réinitier la méiose au stade de la métaphase II avec une structure normale de fuseau apparaissant22. Cependant, dans cette étude, les auteurs n’ont pas essayé de les fertiliser. Néanmoins, de tels résultats indiquent qu’une procédure similaire pourrait être appliquée non seulement à ces espèces particulières de mammifères, mais aussi aux cumulus-oocytes humains obtenus à partir de follicules ce qui devrait permettre d’obtenir des ovocytes de bonne qualité adaptés à une technique de FIV réussie.
Les résultats décrits ci-dessus ont été obtenus avec l’application des protocoles conventionnels d’IVM pendant lesquels les ovocytes ont été cultivés dans les systèmes bidimensionnels (2D). La procédure de routine dans les systèmes de culture 2D couvre les ovocytes, immergés dans une goutte d’un milieu de culture approprié, avec de l’huile minérale23,24. On suppose qu’une superposition d’huile pendant la culture in vitro des ovocytes sert à prévenir l’évaporation des liquides, assurant ainsi le maintien d’un pH approprié et d’une pression osmotique dans la culture. Bien qu’un tel système de culture 2D permette d’obtenir, même jusqu’à 87% des ovocytes de porc matures25, il a été prouvé que la superposition d’huile minérale provoque une diffusion substantielle de matières liposolubles qui sont nécessaires pour le développement approprié des ovocytes26. En outre, en raison des stéroïdes (progestérone et oestrogènes) la diffusion dans l’huile minérale pendant la culture d’ovocytes, un retard de maturation nucléaire et la réduction de la réalisation de compétence développementale des ovocytes de porc a été observée. Cela peut entraîner l’obtention d’un petit nombre de zygotes, qui sont en outre caractérisés par une faible capacité de développement au stade du blastocyste et par une faible viabilité après transfert dans les animaux receveurs27. Par conséquent, des tentatives sont faites pour accroître la compétence développementale des embryons dérivés des ovocytes reçus après la procédure ivm, en créant des conditions optimales pour atteindre la maturité cytoplasmique et nucléaire des ovocytes cultivés avec des CC comme complexes, en particulier en utilisant des systèmes tridimensionnels (3D). Divers systèmes innovants de culture in vitro 3D ont été développés au cours des deux dernières décennies28,29. Ceux-ci ont été conçus pour maintenir l’organisation spatiale naturelle des cellules et pour éviter leur aplatissement dans les plats de culture ce qui ne peut pas être réalisé dans les cultures 2D traditionnelles. L’activité structurelle et fonctionnelle des COC cultivés peut être assurée par le maintien de leur architecture appropriée et la communication non perturbée par des jonctions d’écart entre les différents compartiments30. La pertinence des bio-échafaudages pour la culture in vitro 3D des complexes cumulus–oocytes a été évaluée à l’aide de biomatériaux naturels tels que divers composants de la matrice extracellulaire (ECM; collagène et acide hyaluronique)31 ou polymères inertes (alginate)32. Ces tentatives testées chez plusieurs espèces ont apporté des résultats prometteurs en termes de reprise de la méiose oocyte et la réalisation de leur pleine compétence33,34,35. Toutefois, jusqu’à présent, aucun système 3D adapté à la maturation des COC isolés des grands animaux domestiques, y compris les porcs, n’a été mis au point.
Ce travail décrit deux protocoles qui peuvent être utilisés pour la culture 3D des COC porcins. Le premier protocole décrit l’encapsulation dans les perles fibrine-alginate (FAB). FAB peut être formé par mélange simultané d’une solution d’alginate et de fibrine, qui subissent un processus synchrone de gelation. Cette combinaison offre un environnement mécanique dynamique car les deux composants contribuent à la rigidité de la matrice. Une solution similaire a été utilisée précédemment pour la culture des follicules ovariens de souris et la maturation36. Dans le cas du protocole présenté, pour éviter la dégradation prématurée du réseau alginate-fibrine, des concentrations appropriées plus élevées de solution de chlorure de calcium sont utilisées, assurant un processus de gelation rapide et stable. L’environnement mécanique dynamique crée des conditions similaires à celles-ci dans l’environnement intra-folliculaire naturel dans lequel les COC résident et augmentent en taille. En outre, les travaux montrent les résultats représentatifs des systèmes de culture 3D des COC, dans lesquels ceux-ci sont suspendus dans une goutte de milieu et encapsulés avec du propylène d’éthylène fluoré (FEP; un copolymère de particules en poudre d’hexafluoropropylène et de tétrafluoroéthylène), pour former des microbioréacteurs (Billes liquides, LM). LM sont une forme de bioréacteur 3D qui ont été précédemment montrés pour soutenir, entre autres, la croissance des micro-organismes vivants37, sphéroïdes tumorales38 et cellules souches embryonnaires39. LMs ont également été utilisés avec succès pour la culture ooccytes demoutons 40. Dans la plupart des expériences utilisant des LM, les bioréacteurs ont été préparés à l’aide de polytétrafluoroéthylène (PTFE) lit en poudre avec une taille de particules de 1 μm41. Le protocole présenté utilise fep, qui est très similaire dans la composition et les propriétés aux fluoropolymères PTFE. Mais fep est plus facilement formable et plus doux que PTFE et ce qui est particulièrement important, il est très transparent.
Les deux systèmes 3D maintiennent l’environnement gazeux de culture in vitro. Ils maintiennent également l’organisation des COC 3D en empêchant leur aplatissement et la perturbation conséquente des jonctions d’écart, préservant leur relation fonctionnelle entre les ovocytes et les cellules folliculaires environnantes.
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Protocol
Les procédures suivantes ont été approuvées par le Comité du bien-être animal de l’Institut de zoologie et de recherche biomédicale de l’Université Jagiellonian.
1. Isolement des complexes de cumulus-ovocytes porcins
- Pour recueillir du matériel pour l’isolement des follicules ovariens, exciser les ovaires porcins des dorures prépubères (environ 6-7 mois, pesant 70 à 80 kg) dans un abattoir local. Choisissez environ 20 ovaires de porc de 10 animaux pour l’isolement des COC dans chaque expérience.
REMARQUE : En supposant que chaque ovaire donne 3 à 5 follicules, le nombre total de follicules varie de 60 à 100. - Placer les ovaires dans un thermos avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS; pH 7,4; 38 °C) contenant 1% d’AAS. Assurez-vous que le matériel expérimental est transporté au laboratoire dans un délai de 1 h où il est rincé deux fois avec des PBS stériles contenant des antibiotiques.
- Après le rinçage des ovaires, transférez-les dans le bécher rempli de milieu HM et rangez-les dans un incubateur à 38 °C pour le temps de toutes les manipulations.
REMARQUE : Pour obtenir des résultats optimaux lors de la manipulation des ovocytes, effectuer toutes les procédures en milieu DMEM/F12 (support de manutention, HM) avec l’ajout d’une solution antibiotique/antimycotique (AAS) de 2,5 % et de sérum bovin foetal (FBS) et contrôler le pH au niveau co2 dans l’environnement, sur une table chauffante avec contrôle de la température (38 °C) et sous le capot de débit laminaire pour minimiser la contamination bactérienne. - À partir de grands follicules porcins (6-8 mm de diamètre) recueillir le liquide folliculaire (FF) par aspiration et centrifugation à 100 x g pendant 10 min à température ambiante. Après cela, filtrer le supernatant à l’aide de seringues stériles fixées à 0,2 μm de filtres à membrane et casser le gel à -80 ° C.
REMARQUE : Utilisez une seringue à insuline (u- 40) à l’aspiration du liquide folliculaire. - Assurez-vous que seuls les follicules sains de taille moyenne (4-6 mm de diamètre) sont sélectionnés pour l’isolement des COC42.
NOTE : Les COC de grade I, possédant un ovocyte intact et rond avec ooplasme homogène et cumulus compacts multicouches (au moins 3-4) sont considérés comme appropriés pour d’autres procédures 3D IVM43. - Pour isoler les COC, transférer 2 à 3 ovaires dans une boîte de Pétri stérile de 10 cm de diamètre remplie de HM. Isoler les COC des follicules de taille moyenne en suivant l’une des procédures ci-dessous.
- Coupez doucement la surface des follicules ovariens saillants à l’aide d’une lame chirurgicale stérile 15C. Cela provoquera le liquide folliculaire avec COC à s’écouler dans la boîte de Pétri.
- Apirate le contenu folliculaire à l’aide de l’aiguille de 28 G ayant une taille de 5/8 " attaché à une seringue jetable et le transférer dans la boîte de Pétri.
REMARQUE : Jetez les restes de tissu ovarien. Les étapes ultérieures de l’isolement sont effectuées sous un stéréomicroscope.
- Préparer des boîtes de Pétri fiv de 3 à 5 60 mm.
- Ajouter 1 mL de HM aux puits centraux et placer 3 à 4 gouttes de HM (50 μL par goutte) dans leurs anneaux extérieurs.
- Puis, à l’aide d’une micropipette en polycarbonate, déplacez les COC intacts vers des gouttes de HM dans les anneaux extérieurs pour les rincer brièvement pendant 3-4 fois.
- À la fin, les transférer individuellement dans le puits central. Conservez ces plaques de FIV dans un incubateur pour d’autres procédures.
- Une fois les COC collectés, effectuez l’étape finale de sélection en les attribuant au hasard dans deux protocoles d’encapsulation IVM différents énumérés ci-dessous.
2. Encapsulation dans les perles d’hydrogel fibrine-alginate
- Préparer 1 ml de thrombine de 50 UI/mL dans une solution saline tamponnée par tris (SCT; pH 7,4) avec 100 mM CaCl2 dans un tube de microcentrifuge stérile de 2,0 m L.
- Préparer la solution de stock de fibrinogène (50 mg/mL dans le SCT) et la garder congelée.
REMARQUE : Pour éviter l’agglutination lors de la dissolution du fibrinogène dans le SCT, chauffer le SCT à 37 °C.- Le jour de la procédure, décongeler lentement sur la glace et juste avant que l’utilisation apporte à la température ambiante.
- Juste avant l’utilisation mix à un rapport 1:1 0,5% solution alginate et 50 mg/mL fibrinogène solution pour obtenir enfin 2 mL (FA). Dans un tube stérile de microcentrifuge vortex doucement le mélange. Évitez de faire des bulles.
- Pour préparer des « chambres d’incubation », appliquez de fines bandes de films de paraffine sur les lames de microscope en verre.
REMARQUE : Essuyez les diapositives avec 70 % d’EtOH avant utilisation. Une chambre d’incubation est formée de deux diapositives. Pour les séparer, placez des espaceurs de 3 mm sur l’un d’eux. - Pipette 7,5 μL gouttes du mélange FA sur ce film de paraffine enduit toboggan en verre, qui a également des espaceurs de séparation. Sur un point de diapositive 8-10 gouttes, disposés en deux rangées.
- Transférer, à l’aide d’une micropipette, 3-5 COCs avec un volume minimum (jusqu’à 5 μL) de milieu de maturation (MM), et les placer précisément au centre de la baisse FA. Cette procédure exige de bonnes compétences manuelles et de précision.
REMARQUE : Le milieu de maturation (MM) se compose de DMEM/F12, complété par 10 IU/mL PMSG, 10 IU/mL hCG, 10 % FBS et 50 % de liquide folliculaire porcin (FF) recueillis à l’étape 1.4. - Ajouter 7,5 μL de thrombine/Ca2+ sur chaque goutte FA, juste pour les couvrir. Il n’est pas nécessaire de les mélanger parce que le gel se forme presque instantanément.
- Couvrez la chambre d’incubation en appliquant la deuxième diapositive en verre préalablement préparée aux capsules FA. Avec un mouvement très prudent mais ferme, retourner la chambre à l’envers et la placer dans une boîte de Pétri de 100 mm doublée de papier filtre humide pour éviter le séchage.
- Ensuite, transférer la boîte de Pétri à l’incubateur de CO2 à 5 % (38 °C) pendant environ 5 à 7 min. Après cela, les capsules de FA deviendront nuageuses en raison de la gelation simultanée de fibrine et d’alginate.
- Transférer les capsules FA dans 96 plaques de puits (une capsule par puits) contenant 100 μL MM par puits.
NOTE : Pour ne pas endommager les capsules formées de FA, exécutez cette étape soigneusement avec l’utilisation des forceps chirurgicaux. - Tous les 2 jours, remplacer la moitié du MM (50 μL) par un mm frais prééquilibré. Image COC à l’aide d’un microscope lumineux inversé (à grossissement 10x).
NOTE: Conditions culturelles pour les COC CULTURE FA: 38 °C, sous une atmosphère de CO2 de 5% et une humidité relative 95%. Après 4 jours d’IVM, les hydrogels apparaissent presque clairs en raison de la dégradation progressive du composant de fibrine. L’alginate restant doit être dégradé enzymatiquement - par l’alginate-lyase, une enzyme d’origine végétale qui dégrade spécifiquement l’alginate et n’affecte pas les cellules animales.- Retirer le MM des puits contenant les capsules et ajouter 100 μL de 10 lyase d’alginate d’UI/mL dans DMEM. Laissez la plaque de culture dans l’incubateur pendant 25-30 min.
- Retirer les COC des capsules dissoutes.
REMARQUE : Ceci peut être fait avec une pointe de pipette coupée. - Après plusieurs lavages dans un DMEM frais, transférer les COC dans l’anneau intérieur d’un plat de FIV (5-10 COC par plat) contenant pbs. Maintenant, utilisez-les pour d’autres analyses morphologiques ou biochimiques.
3. Encapsulation dans les microbioréacteurs d’éthylène fluoré (FEP) super-hydrophobes.
REMARQUE : Assurez-vous que toutes les procédures de M IVM sont effectuées sur une table contrôlée par thermostat et que les COC sont maintenus à 38 °C tout au long de leur manipulation.
- Préparer une boîte de Pétri de 30 mm contenant 5 g de poudre fep taille moyenne des particules de 1 μm.
REMARQUE : Il est important d’utiliser de la poudre fep fraîche. Le FEP réutilisé a tendance à s’agréger et forme des amas. - Distribuer une seule gouttelette de MM (~30 μL en volume) contenant 3-5 COC isolés à l’étape 1.6 sur le lit de la poudre FEP. Faites pivoter la plaque doucement dans un mouvement circulaire pour s’assurer que ces particules couvraient complètement la surface de la goutte liquide et des billes liquides formées (LM).
- Ramasser formé LM à l’aide d’une pipette avec 1 000 μL pointe.
REMARQUE : Coupez la pointe de la pipette au bord, pour l’accommoder au diamètre du LM (4-5 mm). Le diamètre approximatif d’une telle pointe préparée doit être légèrement supérieur à celui de la LM. - Préparer plusieurs boîtes de Pétri FIV de 60 mm. Ajouter 3 à 4 mL d’eau stérile aux anneaux extérieurs pour préparer la chambre d’humidité. Ensuite, placez un LM dans le puits central.
NOTE: Cette procédure nécessite de bonnes compétences manuelles et de précision - si le marbre est placé négligemment ou tombe même d’une hauteur basse, il sera détruit. - Incuber les billes pendant 4 jours à 38 °C dans un incubateur de CO2 de 5 %.
- Modifier le milieu quotidiennement suivant la procédure : appliquer 30 μL de MM sur chaque LM, ce qui provoquera leur propagation car le contact liquide direct perturbe l’hydrophobicité des poudres fep enduites. Lorsque la teneur en marbre se dissout, transférez les COC libérés du bioréacteur à une goutte de MM frais dans la boîte de Pétri.
REMARQUE : Pour transférer précisément les COC libérés, utilisez une micropiplette en polycarbonate. - Après plusieurs lavages en MM (3-4 fois) pour enlever les particules FEP, les transférer avec 30 μL de MM frais sur le lit en poudre FEP. Faites pivoter doucement la plaque dans un mouvement circulaire pour s’assurer que les particules de poudre recouvrent complètement la surface de la goutte liquide et forment un nouveau LM.
- Suivez ensuite la procédure des étapes 3.3-3.4.
REMARQUE : Le revêtement transparent de la poudre FEP permet de surveiller la teneur en LM à l’aide du microscope léger.
- Modifier le milieu quotidiennement suivant la procédure : appliquer 30 μL de MM sur chaque LM, ce qui provoquera leur propagation car le contact liquide direct perturbe l’hydrophobicité des poudres fep enduites. Lorsque la teneur en marbre se dissout, transférez les COC libérés du bioréacteur à une goutte de MM frais dans la boîte de Pétri.
4. Caractérisation des COC après la procédure IVM 96-h à l’aide de deux systèmes 3D
REMARQUE : Pour déterminer l’efficacité des systèmes IVM utilisés, marquez les COC morphologiquement au microscope léger. En outre, utilisez l’étiquetage fluorescent double avec calcéine AM et homodimer d’éthidium (EthD-1) colorants pour l’analyse de la viabilité des COC44.
- Examen morphologique des ovocytes après l’IVM par microscopie légère et fluorescence.
- Laver les COC (ceux qui proviennent de la culture utilisant FAB et ceux de LM) avec 38 °C 1x PBS.
REMARQUE : Pour faciliter la manipulation des COC et non pour les endommager pendant la procédure de coloration, utilisez une plaque de puits 96 ou 48 et effectuez chaque étape de coloration en transférant les COC vers des puits ultérieurs. - Incuber en 100 μL de 1,6 m M de calcein AM et 5,5 mM EthD-1 pendant 30–45 min à 37 °C. Diluer les deux substances dans 1x PBS.
REMARQUE : Étant donné qu’il s’agit d’un test de fluorescence bicolore, effectuez cette étape dans l’obscurité. - Après l’incubation, laver le COC deux fois en PBS, puis l’immerger dans un support de montage antifade conçu pour empêcher le photobleaching rapide des protéines fluorescentes et des colorants fluorescents (Table des matériaux).
REMARQUE : Protégez les bords du verre de couverture contre le séchage avec n’importe quel vernis à ongles. - Visualiser des échantillons tachés sous un microscope à balayage laser confocal.
REMARQUE : Pour exciter la fluorescence des deux sondes (c.-à-d. la calcéine et l’homodimmer-1 d’ethidium, EthD-1) accordent un laser à argon à 488nm. La fluorescence émise est séparée par un triple filtre dichroique 488/561/633, puis mesurée à 505−570 nm pour le filtre vert (calcéine), et à 630−750 nm pour le rouge (EthD-1). - Classez les COC en quatre catégories, en utilisant la classification modifiée qui est appliquée aux follicules ovariens en culture basée sur l’imagerie confocale de fluorescence en fonction du pourcentage de cellules granulosa mortes35. V1 : COC dont les C. sont 100 % viables; V2: COC avec 10% des CC morts; V3 : COC avec 10 à 50 % des CC morts; V4: COC avec 50% des CC morts.
REMARQUE : Techniquement, il est difficile d’évaluer la viabilité de l’ovocyte avec l’essai mort-vivant; par conséquent, il faut l’estimer, par exemple, en analysant l’ultrastructure ou l’activité mitochondriale.
- Laver les COC (ceux qui proviennent de la culture utilisant FAB et ceux de LM) avec 38 °C 1x PBS.
- Examen de l’ultrastructure des ovocytes après l’IVM par microscopie électronique de transmission.
- Fixer les COC dans 100 μL 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M (pH 7,2, température ambiante) pendant 2 h.
- Immerger les COC dans un tampon de cacodylate de sodium de 100 μL de 0,1 M (nuit à 4 °C) et rincer dans le même tampon.
- COC postfixe avec 1% de tétroxide d’osmium dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M (température ambiante) pendant 1 h.
- Après coloration dans l’acétate d’uranyl (1 %), déshydratent les COC dans une série croissante de dilutions d’éthanol (50 %, 60 %, 70 %, 90 % et 100 %), les infiltrent toute la nuit à température ambiante, suivies de deux brefs changements de résine et, enfin, les incorporent dans LR White.
- Ensuite, pour orienter et évaluer les échantillons, tachez les sections semi-minces (1 μm) avec le bleu de méthylène/azur II.
- Enfin, examinez les sections ultrathin, doublement tachées au niveau ultrastructural avec le TEM.
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Representative Results
Dans les COC utilisant les deux systèmes ivm, les cellules granulosas ont adhéré étroitement les unes aux autres, et la plupart des COC récupérés avaient des couches intactes de cellules cumulus (Figure 1A,B). En outre, une proportion importante de cellules cumulus ont été conservées.
Les résultats obtenus à partir de l’analyse de viabilité des COC ont confirmé que les deux systèmes appliqués pour l’encapsulation des ovocytes porcins dans des conditions in vitro 3D assuraient des conditions de croissance optimales (figure 2). Dans les deux groupes, seuls des ovocytes à haute viabilité ont été observés, V1 = 13 %, V2 = 87 % pour FAB et 10 % V1, et 90 % V2 pour LM, respectivement (tableau 1).
Les mitochondries, observées par microscopie électronique de transmission (TEM), ont été réparties uniformément dans les ovocytes, leur forme après IVM étaient shell-like45. Seuls quelques-uns d’entre eux ont été allongés, d’ailleurs, leur regroupement a été observé sporadiquement (Figure 1C,D). Le réticulum endoplasmique a été observé, soit associé aux mitochondries ou libre dans le cytoplasme d’ovocyte. Les gouttelettes lipidiques sont apparues sous forme de petites structures rondes foncées et d’appareils Golgi ont été émergés avec des cisternes dilatées (Figure 1C,D).
| V1 | V2 | V3 | V4 | ||||
| % | Nombre | % | Nombre | % | Nombre | % | |
| Fab | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| Nombre total de COC : 144 | 16a | 128b | 0 | 0 | |||
Tableau 1. Résultats sur la viabilité des COC après encapsulation à l’aide de perles de fibrine-alginate (FAB) et de microbioréacteurs FEP, Marbres liquides (LM). Les résultats ont été donnés en moyenne. Les valeurs avec des superscripts (a, b) différaient statistiquement de manière significative (p <0.05).
Figure 1 : Images représentatives montrant la morphologie et l’ultrastructure des COC après 96 h d’encapsulation. (A) morphologie des COC à l’intérieur de FAB - microscopie légère; (B) morphologie des COC à l’intérieur de LM - microscopie légère; C: ultrastructure ovocyte (TEM) après culture in vitro à l’intérieur de FAB; D: ultrastructure d’ovocyte (TEM) après la culture in vitro à l’intérieur de LM. O: ovocyte; CC : cellules cumulus; ZP: zona pellucida; N: noyau; M: mitochondries; G: Appareil Golgi; ER: réticulum endoplasmique; Lp: gouttelettes lipidiques; FA: filaments d’alginate et de fibrine; FEP : poudre de copolymère d’hexafluoropropylène et de tétrafluoroéthylène. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images fluorescentes représentatives des COC après 96 h d’encapsulation. (A,B) Les images obtenues pour les mêmes COC après culture in vitro à l’aide de FAB avec deux filtres pour visualiser la fluorescence verte ou la fluorescence rouge pour les cellules vivantes ou mortes respectivement et (C) fusionnent des deux. (D,E) Les images obtenues pour les mêmes COC après culture in vitro à l’aide de LM avec deux filtres pour visualiser la fluorescence verte ou la fluorescence rouge pour les cellules vivantes ou mortes, respectivement et (F) fusionnent d’entre eux. Barres d’échelle = 50 μm. Les astérisques blancs indiquent des cellules subissant l’apoptose. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La capacité de maintenir la croissance in vitro non seulement des ovocytes, mais aussi des cellules cumulus qui l’entourent et en même temps soutenir sa maturation est extrêmement essentielle pour les technologies de reproduction assistée réussies et pour promouvoir la compréhension des interactions cellules somatiques/ovocytes, en particulier chez les espèces qui subissent une croissance folliculaire prolongée comme les êtres humains ou les porcs. Les techniques d’IVM continuellement améliorées deviennent l’outil utile pour préserver des options de reproduction dans les cas du syndrome ovarien polykystique (SOPK), de l’échec ovarien prématuré, ou de l’infertilité définitive (oncothérapie). En outre, puisque certains dysfonctionnements ovariens pourraient être causés par la croissance folliculaire dysrégulée, la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent le développement approprié de l’ovocyte peut fournir un aperçu important dans la pathophysiologie et le traitement rationnel de ces conditions. Les systèmes de culture in vitro qui soutiendraient le maintien de l’architecture 3D des COC pendant l’IVM, nécessitent une étape d’encapsulation dans une matrice ou à l’intérieur d’un bioréacteur. Ce travail décrit un protocole qui peut être appliqué pour la culture des ovocytes porcins. Les deux systèmes de culture in vitro 3D présentés ici pour induire la croissance et le développement des COC porcins sont conviviaux et permettent le contrôle efficace de la survie des cellules ovocytes et cumulus.
La première méthode de culture in vitro des COC utilisant leur encapsulation dans les perles d’hydrogel fibrine-alginate (FAB) présentée ici permet une croissance des ovocytes 3D dans un environnement matriciel activement sensible aux cellules. Des protocoles précédemment publiés basés sur des hydrogels d’alginate ont été habituellement utilisés pour l’étude du développement des follicules ovariens isolés de nombreuses espèces animales avec des résultats très prometteurs32. Fait intéressant, indépendamment de la composition finale de l’hydrogel alginate32 ou de la méthode d’encapsulation elle-même46, ces études ont montré que les systèmes de culture 3D à base de perles alginate étaient en mesure de soutenir la croissance folliculaire et leur survie.
Les hydrogels d’Alginate étaient doux sur les follicules, n’affectant pas leur survie ou développement ultérieur in vitro. De même, le protocole de culture in vitro des COC décrits pour la première fois ici, est approprié pour générer des ovocytes de porc de bonne qualité, car il a été documenté à la fois aux niveaux morphologiques et ultrastructuraux. La présence de fibrinogène dans une solution d’alginate et leur gélifiant simultané, entraîne la formation d’un réseau interpénétrant qui crée et stabilise davantage l’environnement tridimensionnel. En raison du soutien structurel spécifique à l’intérieur d’une telle matrice, les contacts cellule-cellule et la communication paracrine entre les ovocytes et les cumulus sont maintenus de la même façon que ceux présents in vivo.
Les deux étapes les plus critiques du protocole de maturation décrites dans ce document sont le transfert des capsules fa des chambres d’incubation dans des plaques de 96 puits contenant du MM (étape 2.10.) et l’élimination des COC des capsules dissoutes après dégradation enzymatique de l’alginate restant, à l’aide de l’alginate lyase (étape 2.11.). Les deux étapes exigent une compétence manuelle significative et la précision pour éviter, dans le premier cas la destruction des capsules, dans la seconde - dommages aux COC.
La principale force de cette méthode, en plus d’établir des conditions optimales pour la maturation des ovocytes d’un grand animal domestique, est que lors de l’analyse utilisant TEM, microscopie légère ou microscopie confocale, aucun retrait de capsule n’est nécessaire. L’alginate n’est pas une barrière lors de l’imagerie. Laisser les COC dans les capsules facilite la manipulation pendant la procédure de coloration.
La deuxième culture in vitro du COC présentée ici est celle qui utilise le LM, qui sont généralement des gouttelettes antiadhésives recouvertes de particules à micro-échelle et obtenues simplement en roulant de petits volumes d’un liquide dans une poudre très hydrophobe47. Des études antérieures avec l’utilisation de LM pour la culture, entre autres fibroblastes48, globules rouges49, organoïde d’une tumeur38, cellules pancréatiques50 ou ovocytes de mouton36 ont été effectuées en utilisant le polytétrafluoroéthylène (PTFE) comme polymère hydrophobe pour la préparation des gouttelettes. PTFE est largement utilisé dans la clinique (par exemple, les greffes cardiovasculaires).
Dans ce travail, nous présentons, pour la première fois, une méthode fiable pour les microbioréacteurs fabriqués à des particules FEP pour la culture in vitro des COC porcins. L’utilisation de FEP dans le protocole présenté, qui est très similaire dans la composition et les propriétés de la PTFE, rend la préparation de LM beaucoup plus facile. Cette poudre est plus douce que PTFE et ce qui est particulièrement important, elle est transparente. Cela simplifie à son tour le travail lors de l’imagerie des structures cultivées avec son utilisation. La facilité de formation de LM à l’aide de FEP est un avantage certain de cette méthode.
L’étape la plus critique du protocole de maturation décrite dans ce document est le ramassage et le transfert de LM formé en boîte de Pétri FIV de 60 mm à l’aide d’une pointe de pipette (étapes 3.3. et 3.4.). Ces étapes nécessitent une compétence manuelle et une précision importantes pour éviter la destruction de LM.
Peut-être, la principale limitation des protocoles d’induction de maturation d’ovocytes 3D présenté ici est la difficulté relativement grande à obtenir le matériel de recherche approprié recueilli des animaux non traités avec des antibiotiques, stéroïdes anabolisants (c.-à-nadrolone, boldenone) ou l’acétate de melengestrol qui favorisent leur croissance rapide. Ces stéroïdes, bien que leur utilisation soit interdite en Europe, sont encore largement utilisés dans l’élevage industriel au cours des deux derniers mois de la période d’engraissement, ce qui provoque, entre autres, la maturation sexuelle perturbée.
En conclusion, les deux systèmes 3D présentés ici maintiennent l’environnement optimal de culture in vitro gazeuse. Ils maintiennent également l’organisation des COC 3D en empêchant leur aplatissement et la perturbation conséquente des jonctions d’écart, préservant ainsi la relation fonctionnelle entre les ovocytes, et les cellules folliculaires environnantes, ce qui est crucial pour la maturation appropriée des ovocytes. Ainsi, les deux modèles sont un outil précieux pour la recherche fondamentale en biologie de la reproduction et peuvent également avoir une pertinence clinique, conduisant à l’amélioration du traitement de l’infertilité. En outre, ils peuvent également être appliqués pour développer de nouvelles méthodes de biotechnologie, ainsi que pour l’amélioration du bétail.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs sont très reconnaissants à : dr Waclaw Tworzydlo (Département de biologie du développement et morphologie des invertébrés, Institut de zoologie et de recherche biomédicale, Université jagiellonne) pour les installations techniques en TEM; à Mme Beata Snakowska (Département d’endocrinologie, Institut de zoologie et de recherche biomédicale, Université Jagiellonian) pour l’assistance technique; au Département de biologie cellulaire et d’imagerie, Institut de zoologie et de recherche biomédicale, Université Jagiellonian, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japon). Ces travaux ont été soutenus par une subvention 2018/29/N/NZ9/00983 du Centre national des sciences pologne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
References
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L.
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T.
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D.
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).
