Summary
Hier worden twee protocollen gepresenteerd voor de inkapseling van varkensocyten in 3D-kweekomstandigheden. In de eerste worden cumulus-eicellencomplexen (COC's) ingekapseld in fibrin-alginaatkralen. In de tweede zijn ze ingesloten met gefluoreerde ethyleenpropyleenpoederdeeltjes (microbioreactoren). Beide systemen zorgen voor optimale omstandigheden om hun 3D-organisatie te onderhouden.
Abstract
In de reproductieve biologie leidde de biotechnologierevolutie die begon met kunstmatige inseminatie en embryotransfertechnologie tot de ontwikkeling van geassisteerde voortplantingstechnieken zoals eicel in vitro rijping (IVM), in vitro fertilisatie (IVF) en klonen van huisdieren door nucleaire overdracht van somatische cel. IVM is de methode in het bijzonder van betekenis. Het is het platform technologie voor de levering van volwassen, goede kwaliteit eicellen voor toepassingen zoals vermindering van de generatie interval in commercieel belangrijke of bedreigde soorten, onderzoek met betrekking tot in vitro menselijke voortplanting, en de productie van transgene dieren voor celtherapieën. De term eicelkwaliteit omvat haar competentie om rijping te voltooien, te bevruchten, wat resulteert in gezonde nakomelingen. Dit betekent dat eicellen van goede kwaliteit van het grootste belang zijn voor een succesvolle bevruchting, waaronder IVF-procedures. Dit levert veel problemen op om een betrouwbare cultuurmethode te ontwikkelen die niet alleen de groei van menselijke eicellen, maar ook van andere grote zoogdiersoorten zou ondersteunen. De eerste stap in IVM is de in vitro cultuur van eicellen. Dit werk beschrijft twee protocollen voor de 3D-cultuur van varkensocyten. In het eerste, 3D-model cumulus-eicellen complexen (COCs) zijn ingekapseld in een fibrin-alginaat kraal tussendoordtreting netwerk, waarin een mengsel van fibrine en alginaat gelijktijdig worden gelled. In de tweede worden COC's opgehangen in een druppel medium en ingekapseld met gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP; een copolymeer van hexafluoropropyleen en tetrafluorethyleen) poederdeeltjes om microbiobioreactoren te vormen gedefinieerd als Vloeibare Knikkers (LM). Beide 3D-systemen onderhouden de gasvormige in vitro cultuuromgeving. Ze handhaven ook COCs 3D organisatie door het voorkomen van hun afvlakking en de daaruit voortvloeiende verstoring van de kloof knooppunten, waardoor het behoud van de functionele relatie tussen de eicellen, en de omliggende folliculaire cellen.
Introduction
De ontwikkeling van verschillende cultuursystemen, waaronder driedimensionale (3D) systemen, heeft tot doel optimale omstandigheden te bieden voor de groei en rijping van eicellen geïsoleerd van de follikels, zelfs in de vroegste stadia van ontwikkeling. Dit is van groot belang voor geassisteerde voortplantingstechnieken (ART), vooral met het oog op het toenemende aantal vrouwen die worstelen met onvruchtbaarheid na de behandeling van kanker1. Rijping van eicellen in in vitro omstandigheden (IVM) is al een gevestigde techniek die voornamelijk wordt gebruikt voor de productie van in vitro embryo's voor de voortplanting van vee2. Bij de meeste zoogdiersoorten kan echter, zelfs als er hoge rijpingspercentages van cumulus-eicellencomplexen (COC's) kunnen worden bereikt (bereik 60 tot 90 %)3, hun ontwikkelingsbevoegdheid nog steeds niet aan de behoeften voldoen. Dit komt omdat de ontwikkeling van de zygotes verkregen op een zodanige wijze zelfs tot de blastocyst stadium is laag en na de overdracht in surrogaat dieren hun levensvatbaarheid tot termijn wordt verminderd. Daarom is het nodig de ontwikkelingsbevoegdheid van embryo's die zijn verkregen uit eicellen die onder de IVM-procedure4zijn onderworpen , te vergroten . Daarom worden nieuwe rijpingsmedia5 ontwikkeld en verschillende perioden van in vitrocultuur worden getest6,7 samen met suppletie van cultuurmedia met verschillende groeifactoren en moleculen8,9.
De eerste stap van elk compleet IVM-systeem is het creëren van optimale voorwaarden voor duurzame groei van eicellen tijdens de in vitro cultuur. De eicelgroei is een van de specifieke indicatoren van het vermogen van de eicel om meiose10,11te hervatten . Bovendien moet een passend eicel in vitrocultuursysteem in staat zijn zijn nucleaire rijping en cytoplasmatische differentiatie te ondersteunen12. De morfologie van het cumulus-eicelcomplex is een andere belangrijke indicator die in ART-klinieken wordt gebruikt om de beste eicel te selecteren voor latere stappen van in vitro fertilisatie (IVF) procedure bij mensen en vee12,13. Onder morfologische kenmerken van COCs beschouwd zijn: de eiceldiameter, de cytoplasma granulatie en de eerste poollichaam integriteit14,15. Bovendien is het oocyte ontwikkelingspotentieel gecorreleerd aan het uiterlijk en de verdichting van cumuluscellen en het aantal van hun lagen rond de eicel. Zeer belangrijk voor de juiste eicel in vitro cultuur systeem is ook het behoud van eicel-cumulus cellen juiste interacties en cytoskeleton stabiliteit16,17,18,19. Tot nu toe is in vitro oocyte groei binnen menselijke COC's aangetoond20. Het gebruik van koe COCs resulteerde ook in levende geboorten. Deze werden geïsoleerd van onrijpe eierstokzakjes en vervolgens gekweekt voor 14 dagen tot de eicel was voldoende groot om de IVF-procedure21ondergaan . Op dezelfde manier leverden COC's geïsoleerd van bavianenanonielen, onderworpen aan IVM na in vitrocultuur, eicellen op die meiose konden herinitieren in het stadium van de metafase II met een normaal verschijnende spindelstructuur22. Echter, in deze studie de auteurs niet proberen om ze te bevruchten. Niettemin wijzen dergelijke resultaten erop dat een soortgelijke procedure niet alleen kan worden toegepast op deze specifieke zoogdiersoorten, maar ook op menselijke cumulus-eicellencomplexen verkregen uit follikels die het mogelijk zouden moeten maken om eicellen van goede kwaliteit te verkrijgen die geschikt zijn voor een succesvolle IVF-techniek.
De hierboven beschreven resultaten werden verkregen met de toepassing van conventionele IVM-protocollen waarbij eicellen werden gekweekt in tweedimensionale (2D) systemen. De routineprocedure in 2D-kweeksystemen omvat eicellen, ondergedompeld in een druppel van een geschikte cultuurmedia, met minerale olie23,24. Aangenomen wordt dat een olieoverlay tijdens de in vitro oocytecultuur dient om vloeibare verdamping te voorkomen, waardoor het behoud van een goede pH en osmotische druk in de cultuur wordt gewaarborgd. Hoewel een dergelijk 2D-kweeksysteem het mogelijk maakt om, zelfs tot 87% van de rijpe varkensoocyten25,te verkrijgen, is bewezen dat de overlay van minerale olie een aanzienlijke verspreiding van lipoïde oplosbare materialen veroorzaakt die nodig zijn voor een goede ontwikkeling van eicellen26. Bovendien, als gevolg van steroïden (progesteron en oestrogenen) diffusie in de minerale olie tijdens eicelcultuur, een vertraging van nucleaire rijping en vermindering van de ontwikkelingscompetentie prestatie van varkens eicellen werd waargenomen. Dit kan leiden tot het verkrijgen van een klein aantal zygotes, die bovendien worden gekenmerkt door een lage ontwikkelingscapaciteit tot het stadium van de blastocyst en door een slechte levensvatbaarheid na overdracht in ontvangende dieren27. Daarom wordt getracht de ontwikkelingsbevoegdheid van embryo's die zijn afgeleid van eicellen die na de IVM-procedure zijn ontvangen, te vergroten door optimale voorwaarden te scheppen voor het bereiken van zowel cytoplasmatische als nucleaire rijpheid van eicellen die samen met CCs als complexen worden gekweekt, met name met behulp van driedimensionale (3D)-systemen. In de afgelopen tweedecennia,zijn verschillende innovatieve 3D-in-vitrocultuursystemenontwikkeld. Deze werden ontworpen om de natuurlijke ruimtelijke organisatie van cellen te behouden en om te voorkomen dat hun afvlakking in cultuurgerechten wat niet kan worden bereikt in de traditionele 2D-culturen. De structurele en functionele activiteit van gekweekte COC's kan worden gewaarborgd door het behoud van hun goede architectuur en ongestoorde communicatie via gap-junctions tussen verschillende compartimenten30. De geschiktheid van bio-steigers voor 3D in vitro cultuur van cumulus-eicellen complexen is geëvalueerd met behulp van natuurlijke biomaterialen, zoals verschillende componenten van de extracellulaire matrix (ECM; collageen en hyaluronzuur)31 of inerte polymeren (alginaat)32. Deze pogingen getest in verschillende soorten bracht veelbelovende resultaten in termen van eicel meiose hervatting en het bereiken van hun volledige competentie33,34,35. Tot nu toe is er echter geen 3D-systeem ontwikkeld dat geschikt is voor coc's, geïsoleerd van grote huisdieren, waaronder varkens, is ontwikkeld.
Dit werk beschrijft twee protocollen die kunnen worden gebruikt voor de 3D-cultuur van varkens COC's. Het eerste protocol beschrijft inkapseling bij fibrin-alginaatkralen (FAB). FAB kan worden gevormd door gelijktijdig een alginaat en fibrinoplossing te mengen, die een synchrone gelatieproces ondergaan. Deze combinatie zorgt voor een dynamische mechanische omgeving omdat beide componenten bijdragen aan matrixstijfheid. Een soortgelijke oplossing is eerder gebruikt voor de muizenzakzak follikel cultuur en rijping36. In het geval van het gepresenteerde protocol worden, om voortijdige afbraak van het alginaatfibrinnetwerk te voorkomen, op passende wijze hogere concentraties calciumchlorideoplossing gebruikt, waardoor een snel en stabiel gelatieproces wordt gewaarborgd. De dynamische mechanische omgeving creëert soortgelijke omstandigheden in de natuurlijke intra-folliculaire omgeving waarin COC's zich bevinden en in omvang toenemen. Bovendien toont het werk representatieve resultaten van COC 3D-kweeksystemen, waarin deze worden opgeschort in een druppel medium en ingekapseld met gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP; een copolymeer van hexafluoropropyleen en tetrafluorethyleen) poederdeeltjes, om microbioreactoren te vormen (Knikkers, LM). LM zijn een vorm van 3D bioreactor waarvan eerder is aangetoond dat het onder andere de groei van levende micro-organismen37, tumorsferoïden38 en embryonale stamcellen39ondersteunt. LMs zijn ook met succes gebruikt voor schapen eicelcultuur40. In de meeste experimenten met LMs werden bioreactoren bereid met polytetrafluorethyleen (PTFE) poederbed met een deeltjesgrootte van 1 μm41. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van FEP, dat qua samenstelling en eigenschappen sterk lijkt op de fluoropolymeren PTFE. Maar FEP is gemakkelijker vormbaar en zachter dan PTFE en wat vooral belangrijk is, het is zeer transparant.
Beide 3D-systemen onderhouden de gasvormige in vitro cultuuromgeving. Ze handhaven ook COCs 3D organisatie door het voorkomen van hun afvlakking en de daaruit voortvloeiende verstoring van de kloof knooppunten, het behoud van hun functionele relatie tussen de eicellen en de omliggende folliculaire cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende procedures werden goedgekeurd door het Comité voor dierenwelzijn van het Instituut voor Zoölogie en Biomedisch Onderzoek van de Jagiellonian University.
1. Isolatie van varkenstcumulus-eicellen
- Voor het verzamelen van materiaal voor de isolatie van eierstokken, accijnzen varkensstokken uit prepubertale gelten (ongeveer 6-7 maanden oud, met een gewicht van 70 tot 80 kg) in een lokaal slachthuis. Kies ongeveer 20 varkensstokken uit 10 dieren voor COC isolatie in elk experiment.
OPMERKING: Ervan uitgaande dat elke eierstok 3-5 follikels oplevert, varieert het totale aantal follikels van 60 tot 100. - Plaats eierstokken in een thermoskan met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7.4; 38 °C) met 1% AAS. Zorg ervoor dat het experimentele materiaal binnen 1 uur naar het laboratorium wordt getransporteerd, waar het twee maal wordt gespoeld met steriele PBS met antibiotica.
- Breng ze na het spoelen van de eierstokken over op het bekerglas gevuld met HM-medium en bewaar ze in een couveuse bij 38 °C voor de tijd van alle manipulaties.
LET OP: Voor optimale resultaten tijdens de behandeling van eicellen, alle procedures in DMEM/F12 medium (handling medium, HM) uitvoeren met de toevoeging van 2,5% antibioticum/antimycotische oplossing (AAS) en 10% foetaal runderserum (FBS) en de pH op CO2-niveau in het milieu, op een verwarmingstafel met temperatuurregeling (38 °C) en onder de laminaire stroomkap om bacteriële verontreiniging te minimaliseren. - Van grote varkenszakjes (6-8 mm in diameter) verzamelen folliculaire vloeistof (FF) door aspiratie en centrifugatie op 100 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Filtreer daarna de supernatant met steriele spuit bevestigd aan 0,2 μm mem mem mem poriefilters en klik bevriezen bij -80 ° C.
OPMERKING: Gebruik een insulinespuit (u- 40) om folliculaire vloeistof te aspiratie. - Zorg ervoor dat alleen gezonde, middelgrote follikels (4-6 mm in diameter) worden geselecteerd voor COC isolatie42.
OPMERKING: COC's van graad I, die een intacte en ronde eicel bezitten met homogeen ooplasma en meerlaagse (ten minste 3-4) compacte cumulus worden geschikt geacht voor verdere 3D IVM-procedure43. - Om COC's te isoleren, breng je 2-3 eierstokken over naar een steriel petrischaaltje met een diameter van 10 cm gevuld met HM. CoC's isoleren van middelgrote follikels door een van de onderstaande procedures te volgen.
- Snijd voorzichtig het oppervlak van de uitstekende eierstokzakjes met een steriel chirurgisch mes 15C. Dit zal ervoor zorgen dat de folliculaire vloeistof samen met COC's uit te stromen in de petrischaal.
- Aspirate de folliculaire inhoud met behulp van 28 G naald met een grootte van 5 / 8 "bevestigd aan een wegwerpspuit en breng het in de petrischaal.
OPMERKING: Gooi de resten van eierstokweefsel weg. Latere stadia van isolatie worden uitgevoerd onder een stereomicroscoop.
- Bereid 3-5 60 mm IVF Petri gerechten.
- Voeg 1 mL HM toe aan de centrale putten en plaats een 3-4 druppels HM (50 μL per druppel) in hun buitenste ringen.
- Dan, met behulp van een polycarbonaat micropipet, verplaats de onbeschadigde COCs naar druppels van HM in de buitenste ringen om ze kort te spoelen voor 3-4 keer.
- Aan het einde, individueel overbrengen ze in de centrale put. Bewaar deze IVF-platen in een couveuse voor verdere procedures.
- Nadat COC's zijn verzameld, voert u de laatste selectiestap uit door ze willekeurig toe te wijzen aan twee verschillende IVM-inkapselingsprotocollen die hieronder worden vermeld.
2. Inkapseling bij fibrin-alginaat hydrogelkralen
- Bereid 1 mL van 50 IU/mL-trombin in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS; pH 7.4) met 100 mM CaCl2 in een 2,0 mL steriele microcentrifuge buis.
- Bereid fibrinogen voorraad oplossing (50 mg/mL in TBS) en houd het bevroren.
OPMERKING: Om klonteren bij het oplossen van fibrinogen in tbs te voorkomen, verwarm tbs tot 37 °C.- Op de dag van de procedure ontdooit u het langzaam op ijs en vlak voor het gebruik op kamertemperatuur.
- Net voor gebruik mix op een 1:1 verhouding 0,5% alginaat oplossing en 50 mg/mL fibrinogen oplossing om eindelijk 2 mL (FA). In een steriele microcentrifugebuis voorzichtig vortex het mengsel. Vermijd het maken van bubbels.
- Om "incubatiekamers" voor te bereiden, breng je dunne stroken paraffinefilms aan op de glazen microscoopdia's.
LET OP: Veeg de dia's voor gebruik met 70 % EtOH. Eén incubatiekamer wordt gevormd met twee dia's. Om ze te scheiden, plaats 3 mm afstandhouders op een van hen. - Pipette 7.5 μL druppels van het FA mengsel op deze paraffine film gecoate glazen glijbaan, die ook scheidingsruimters heeft. Op een dia plaats 8-10 druppels, gerangschikt in twee rijen.
- Breng met behulp van een micropipet, 3-5 COC's samen met een minimum volume (tot 5 μL) van rijping medium (MM), en plaats ze precies in het midden van de FA drop. Deze procedure vereist goede handmatige vaardigheden en precisie.
OPMERKING: Het rijpingsmedium (MM) bestaat uit DMEM/F12, aangevuld met 10 IU/mL PMSG, 10 IU/mL hCG, 10% FBS en 50% varkens folliculaire vloeistof (FF) verzameld in stap 1.4. - Voeg 7,5 μL trombine/Ca2+ oplossing toe op elke FA-druppel, om ze te bedekken. Het is niet nodig om ze te mengen omdat de gel zich vrijwel onmiddellijk vormt.
- Bedek de incubatiekamer door de tweede, eerder bereide glazen schuif op de FA-capsules aan te brengen. Met een zeer zorgvuldige maar stevige beweging, draai de kamer ondersteboven en plaats het in een 100 mm petrischaal bekleed met vochtig filterpapier om te voorkomen dat drogen.
- Breng de petrischaal vervolgens ongeveer 5-7 min naar de 5% CO2-incubator (38 °C). Hierna worden FA-capsules troebel als gevolg van gelijktijdige gelatie van fibrine en alginaat.
- Breng FA-capsules over in 96 putplaten (één capsule per put) met 100 μL MM per put.
OPMERKING: Om de gevormde FA capsules niet te beschadigen, voer deze stap zorgvuldig uit met het gebruik van chirurgische tangen. - Elke 2 dagen vervangt de helft van de MM (50 μL) door verse, vooraf geëquilibreerde. Beeld COC's met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop (bij 10x vergroting).
OPMERKING: Cultuuromstandigheden voor COC's FA-cultuur: 38 °C, onder een CO2-atmosfeer van 5% en een relatieve luchtvochtigheid van 95%. Na 4 dagen IVM lijken de hydrogels bijna helder als gevolg van progressieve afbraak van de fibrinecomponent. De resterende alginaat moet enzymatisch worden afgebroken - door alginaatlyase, een plantaardig enzym dat specifiek alginaat degradeert en geen dierlijke cellen aantast.- Verwijder MM uit putten die de capsules bevatten en voeg 100 μL 10 IE/mL-alginaatlyase toe in DMEM. Laat de kweekplaat 25-30 minuten in de couveuse staan.
- Verwijder COC's uit de opgeloste capsules.
LET OP: Dit kan met een gesneden pipettip. - Na verschillende wasbeurten in een verse DMEM, overdracht COC's naar de binnenste ring van een IVF-schotel (5-10 COC's per gerecht) met PBS. Gebruik ze nu voor verdere morfologische of biochemische analyse.
3. Inkapseling in superhydrofobe fluorïde ethyleenpropyleen (FEP) microbioreactoren.
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle IVM-procedures worden uitgevoerd op thermostatisch geregelde tafel en COC's worden gehandhaafd op 38 °C tijdens de behandeling.
- Bereid een petrischaal van 30 mm met een FEP-poederbed van 1 μm.
LET OP: Het is belangrijk om vers FEP-poeder te gebruiken. De hergebruikte FEP heeft de neiging om samen te voegen en vormt klonters. - Verdeel een druppel MM (~30 μL in volume) met 3-5 COC's geïsoleerd in stap 1.6 over het bed van het FEP-poeder. Draai de plaat voorzichtig in een cirkelvormige beweging om er zeker van te zijn dat deze deeltjes het oppervlak van de vloeibare druppel en vloeibare knikkers (LM) volledig bedekten.
- Pick-up gevormde LM met behulp van een pipet met 1.000 μL tip.
LET OP: Snijd de pipetpunt aan de rand, om deze tegemoet te komen aan de diameter van de LM (4-5 mm). De geschatte diameter van een dergelijke voorbereide punt moet iets groter zijn dan die van de LM. - Bereid een aantal 60 mm IVF Petri gerechten. Voeg 3-4 mL steriel water toe aan de buitenste ringen om de vochtigheidskamer voor te bereiden. Plaats vervolgens een LM in de centrale put.
OPMERKING: Deze procedure vereist goede handmatige vaardigheden en precisie - als het marmer achteloos wordt geplaatst of zelfs van een lage hoogte valt, wordt het vernietigd. - Incubeer knikkers gedurende 4 dagen bij 38 °C in 5 % CO2-incubator.
- Verander het medium dagelijks na de procedure: breng 30 μL MM toe op elke LM, wat de verspreiding ervan zal veroorzaken omdat direct vloeibaar contact de hydrofobiciteit van de gecoate FEP-poeders verstoort. Wanneer het marmergehalte oplost, breng coc's die vrijkomen uit de bioreactor over naar een druppel verse MM in de petrischaal.
OPMERKING: Gebruik een polycarbonaatmicropipet om de vrijgekomen COC's nauwkeurig over te brengen. - Na verschillende wasbeurten in MM (3-4 keer) om FEP-deeltjes te verwijderen, breng je ze met 30 μL verse MM over op het FEP-poederbed. Draai de plaat voorzichtig in een cirkelvormige beweging om ervoor te zorgen dat de poederdeeltjes het oppervlak van de vloeibare druppel volledig bedekten en een nieuwe LM vormen.
- Volg dan de procedure vanaf stap 3.3-3.4.
OPMERKING: De transparante coating van FEP-poeder maakt het mogelijk om het LM-gehalte te monitoren met behulp van een lichtmicroscoop.
- Verander het medium dagelijks na de procedure: breng 30 μL MM toe op elke LM, wat de verspreiding ervan zal veroorzaken omdat direct vloeibaar contact de hydrofobiciteit van de gecoate FEP-poeders verstoort. Wanneer het marmergehalte oplost, breng coc's die vrijkomen uit de bioreactor over naar een druppel verse MM in de petrischaal.
4. Karakterisering van COC's na 96-h IVM-procedure met behulp van twee 3D-systemen
OPMERKING: Om de efficiëntie van de gebruikte IVM-systemen te bepalen, scoort u COC's morfologisch onder een lichtmicroscoop. Gebruik bovendien dubbele fluorescerende etikettering met calcein AM en ethidium homodimer (EthD-1) kleurstoffen voor analyse van de levensvatbaarheid van COC's44.
- Morfologisch onderzoek van eicellen na de IVM door licht- en fluorescentiemicroscopie.
- Was COC's (beide die afkomstig zijn van cultuur met FAB en die van LM) met 38 °C 1x PBS.
OPMERKING: Om de behandeling van COC's te vergemakkelijken en deze niet te beschadigen tijdens de kleuringsprocedure, gebruikt u een 96 of 48 putplaat en voert u elke kleuringsstap uit door de COC's over te zetten naar volgende putten. - Incubeer ze in 100 μL van 1,6 mM calceine AM en 5,5 mM EthD-1 voor 30-45 min bij 37 °C. Verdun beide stoffen in 1x PBS.
OPMERKING: Omdat dit een fluorescentietest met twee kleuren is, voert u deze stap uit in het donker. - Na incubatie, was het COC twee keer in PBS en dompel het vervolgens onder in een antifade montagemedium ontworpen om snelle fotobleaching van fluorescerende eiwitten en fluorescerende kleurstoffen (Tabel van materialen) te voorkomen.
LET OP: Bescherm de randen van dekglas tegen drogen met elke nagellak. - Visualiseer gekleurde monsters onder een confocale laserscanmicroscoop.
OPMERKING: Om de fluorescentie van beide sondes (d.w.z. calceine en ethidium homodimer-1, EthD-1) een argonlaser af te stemmen op 488nm. De uitgestoten fluorescentie wordt gescheiden door een drievoudig dichroisch filter 488/561/633 en vervolgens gemeten op 505−570 nm voor de groene (calcein), en bij 630−750 nm voor de rode (EthD-1). - Classificeer COC's in vier categorieën, met behulp van gewijzigde classificatie die wordt toegepast op eierstokzakjes in de cultuur op basis van confocale fluorescentie beeldvorming, afhankelijk van het percentage dode granulosacellen35. V1: COC's met naar schatting 100% levensvatbare PC's; V2: COC's met 10% van de dode CD's; V3: COC's met 10-50% van de dode CD's; V4: COC's met 50% van de dode CD's.
OPMERKING: Technisch gezien is het moeilijk om de levensvatbaarheid van de eicel te beoordelen met de levende dode test; daarom moet het worden geschat, bijvoorbeeld door het analyseren van mitochondriale ultrastructuur of activiteit.
- Was COC's (beide die afkomstig zijn van cultuur met FAB en die van LM) met 38 °C 1x PBS.
- Onderzoek van oocyten ultrastructuur na IVM door transmissieelektronenmicroscopie.
- Fix COCs in 100 μL 2,5% glutaraldehyde in 0,1 M natriumcaanoodylaatbuffer (pH 7.2, kamertemperatuur) gedurende 2 uur.
- Dompel COC's onder in 100 μL 0,1 M natriumcaanoodylaatbuffer ('s nachts bij 4 °C) en spoel in dezelfde buffer.
- Postfix COC's met 1% osmiumtetroxide in 0,1 M natriumcaanoodylaatbuffer (kamertemperatuur) gedurende 1 uur.
- Na vlekken in uranylactaat (1 %), uitdrogen coc's in een toenemende reeks ethanolverdunningen (50%, 60%, 70%, 90% en 100%), infiltreren ze 's nachts bij kamertemperatuur, gevolgd door twee korte veranderingen van hars en ten slotte, insluiten ze in LR White.
- Vervolgens, om monsters te oriënteren en te evalueren, vlek semi-dunne secties (1 μm) met methyleenblauw/azuurblauw II.
- Ten slotte, onderzoeken ultradunne, dubbel gekleurde secties op ultrastructureel niveau met de TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In COC's die beide IVM-systemen gebruiken, hechtten de granulosacellen zich stevig aan elkaar en hadden de meeste herstelde COC's intacte lagen cumuluscellen(figuur 1A,B). Bovendien werd een aanzienlijk deel van de cumuluscellen behouden.
De resultaten van de levensvatbaarheidsanalyse van de COC's bevestigden dat beide systemen die werden toegepast voor de inkapseling van varkensocellen in 3D-in-vitro-omstandigheden optimale groeiomstandigheden zorgden (figuur 2). In beide groepen werden alleen vlaarcyten met een hoge levensvatbaarheid waargenomen, V1 = 13 %, V2 = 87 % voor FAB en 10 % V1 en 90 % V2 voor LM , respectievelijk (tabel 1).
Mitochondriën, waargenomen door transmissie elektronenmicroscopie (TEM), werden gelijkmatig verdeeld in eicellen, hun vorm na IVM waren shell-achtige45. Slechts een paar van hen waren langwerpig, bovendien werd hun clustering sporadisch waargenomen (figuur 1C, D). Endoplasmatisch reticulum werd waargenomen, hetzij geassocieerd met mitochondriën of vrij in het eicytaan. Lipide druppels verschenen als kleine donkere ronde structuren en Golgi apparaten werden ontstaan met verwijde stortbak (Figuur 1C, D).
| V1 | V2 | V3 | V4 V4 | ||||
| % | Nummer | % | Nummer | % | Nummer | % | |
| Fab | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| Totaal aantal COC's: 144 | 16a | 128b | 0 | 0 | |||
Tabel 1. Resultaten over de levensvatbaarheid van COC's na inkapseling met fibrin-alginaat kralen (FAB) en microbioreactoren FEP, Liquid Marbles (LM). De resultaten werden gemiddeld gegeven. Waarden met superscripts (a, b) verschilden statistisch significant (p <0,05).
Figuur 1: Representatieve beelden met de morfologie en ultrastructuur van COC's na een inkapseling van 96 uur. aA) morfologie van COC's in FAB - lichte microscopie; bB) morfologie van COC's in LM - lichte microscopie; C: oocyte ultrastructure (TEM) na in vitro cultuur binnen FAB; D: oocyte ultrastructure (TEM) na in vitro cultuur binnen LM. O: eicel; CT's: cumuluscellen; ZP: zona pellucida; N: kern; M: mitochondriën; G: Golgi-apparaat; ER: endoplasmatisch reticulum; Lp: lipide druppel; FA: alginaat en fibrinefilamenten; FEP: poeder van copolymeer van hexafluoropropyleen en tetrafluorethyleen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve fluorescerende beelden van COC's na 96 uur inkapseling. (A,B) De beelden verkregen voor dezelfde COC's na in vitro cultuur met behulp van FAB met twee filters om groene fluorescentie of rode fluorescentie visualiseren voor levende of dode cellen respectievelijk en (C) samenvoegen van beide. (D,E) De beelden verkregen voor dezelfde COC's na in vitro cultuur met behulp van LM met twee filters om groene fluorescentie of rode fluorescentie visualiseren voor levende of dode cellen, respectievelijk en (F) samenvoegen van hen. Schaalbalken = 50 μm. Witte sterretjes wijzen op cellen die apoptose ondergaan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het vermogen om in vitro groei te behouden, niet alleen van de eicel, maar ook van cumuluscellen eromheen en tegelijkertijd de rijping ervan te ondersteunen, is uiterst essentieel voor de succesvolle ondersteunde voortplantingstechnologieën en voor het bevorderen van het begrip van somatische cel/eicelinteracties, vooral bij soorten die langdurige folliculaire groei ondergaan, zoals mensen of varkens. Continu verbeterde IVM-technieken worden nuttig instrument om reproductieve opties te behouden in gevallen van polycysteus ovariaal syndroom (PCOS), voortijdig eierstokfalen, of definitieve onvruchtbaarheid (oncotherapie). Bovendien, aangezien bepaalde ovariale disfuncties kunnen worden veroorzaakt door dysregulated folliculaire groei, inzicht in de moleculaire en cellulaire mechanismen die de juiste ontwikkeling van de eicel controle kan belangrijk inzicht in de pathofysiologie en rationele behandeling van deze voorwaarden. In vitro kweeksystemen die het onderhoud van COC 3D-architectuur tijdens IVM zouden ondersteunen, vereisen een stap van inkapseling in een matrix of in een bioreactor. Dit werk beschrijft een protocol dat kan worden toegepast voor de cultuur van varkensocyten. Beide 3D in vitro kweeksystemen die hier worden gepresenteerd om groei en ontwikkeling van varkens-COC's te stimuleren zijn gebruiksvriendelijk en zorgen voor een effectieve controle van zowel eicel- als cumuluscellen overleving.
De eerste in vitro kweekmethode van COC's met behulp van hun inkapseling in fibrin-alginaat hydrogel kralen (FAB) hier gepresenteerd zorgt voor een 3D oocyte groei in een actief cel-responsieve matrix omgeving. Eerder gepubliceerde protocollen op basis van alginaathydrogels werden meestal gebruikt voor het onderzoek naar de ontwikkeling van eierstokzakjes geïsoleerd van tal van diersoorten met zeer veelbelovende resultaten32. Interessant, ongeacht de uiteindelijke samenstelling van de alginaat hydrogel32 of de inkapseling methode zelf46, deze studies toonden aan dat alginaat kraal-gebaseerde 3D-kweeksystemen in staat waren folliculaire groei en hun overleving te ondersteunen.
Alginaat hydrogels waren zacht voor de follikels, niet van invloed op hun verdere overleving of ontwikkeling in vitro. Ook het in vitro cultuurprotocol van COC's dat hier voor het eerst wordt beschreven, is geschikt om varkensocyten van goede kwaliteit te genereren, zoals het zowel op morfologische als ultrastructurele niveaus is gedocumenteerd. De aanwezigheid van fibrinogen in een alginaatoplossing en hun gelijktijdige gelling resulteert in de vorming van een interdringend netwerk dat de driedimensionale omgeving creëert en verder stabiliseert. Door de specifieke structurele ondersteuning in een dergelijke matrix worden cel-naar-celcontacten en paracrinecommunicatie tussen eicellen en cumuluscellen op dezelfde manier gehandhaafd als deze huidige in vivo.
De twee meest kritieke stappen in het rijpingsprotocol zoals beschreven in dit document zijn de overdracht van FA-capsules van incubatiekamers naar 96-bronplaten met MM (stap 2.10.) en het verwijderen van COC's uit de opgeloste capsules na enzymatische afbraak van de resterende alginaat, met behulp van alginaatlyase (stap 2.11.). Beide stappen vereisen aanzienlijke handmatige vaardigheid en precisie om in het eerste geval de vernietiging van capsules in de tweede - schade aan COC's te voorkomen.
De belangrijkste kracht van deze methode, naast het vaststellen van optimale omstandigheden voor de eicelrijping van een groot huisdier, is dat tijdens analyse met BEHULP van TEM, lichte microscopie of confocale microscopie, geen capsule verwijdering nodig is. Alginate is geen barrière bij beeldvorming. Het verlaten van COC's in capsules vergemakkelijkt manipulatie tijdens de kleuringsprocedure.
De tweede COC in vitro cultuur die hier wordt gepresenteerd is degene met het gebruik van LM, die over het algemeen niet-aangebakende druppels zijn die worden bedekt door micro-geschaalde deeltjes en verkregen door simpelweg kleine hoeveelheden vloeistof in een zeer hydrofoob poeder47te rollen. Eerdere studies met het gebruik van LM voor cultuur, onder andere fibroblasten48, rode bloedcellen49, organoïde van een tumor38, pancreascellen50 of schapenoocyten36 zijn uitgevoerd met behulp van polytetrafluorethyleen (PTFE) als een hydrofobe polymeer voor de voorbereiding van de druppels. PTFE wordt veel gebruikt in de kliniek (bijvoorbeeld cardiovasculaire grafts).
In dit werk presenteren we voor het eerst een betrouwbare methode voor microbioreactoren gemaakt van FEP-deeltjes voor in vitro kweek van varkens-COC's. Het gebruik van FEP in het gepresenteerde protocol, dat qua samenstelling en eigenschappen sterk lijkt op de PTFE, maakt de voorbereiding van LM veel gemakkelijker. Dit poeder is zachter dan PTFE en wat vooral belangrijk is, het is transparant. Dit vereenvoudigt op zijn beurt het werk tijdens de beeldvorming van structuren gekweekt met het gebruik ervan. Het gemak van de vorming van LM met behulp van FEP is een duidelijk voordeel van deze methode.
De meest kritische stap in het rijpingsprotocol beschreven in dit document is het oppakken en overbrengen van gevormde LM in 60 mm IVF Petri schotel met behulp van een pipet tip (stappen 3.3. en 3.4.). Deze stappen vereisen aanzienlijke handmatige vaardigheid en precisie om vernietiging van LM te voorkomen.
Mogelijk, de belangrijkste beperking van de 3D-eicelrijping inductie protocollen hier gepresenteerd is de relatief grote moeite bij het verkrijgen van goede onderzoeksmateriaal verzameld van dieren niet behandeld met antibiotica, anabole steroïden (dat wil zeggen, nadrolone, boldenone) of melengestrol acetaat die hun snelle groei te bevorderen. Deze steroïden, ondanks het gebruik ervan wordt verboden in Europa, worden nog steeds op grote schaal gebruikt in de industriële veeteelt tijdens de laatste twee maanden van de mestperiode, die onder andere, verstoorde seksuele rijping veroorzaakt.
Kortom, beide hier gepresenteerde 3D-systemen behouden de optimale gasvormige in vitro cultuuromgeving. Ze handhaven ook COCs 3D organisatie door het voorkomen van hun afvlakking en de daaruit voortvloeiende verstoring van de kloof knooppunten, waardoor het behoud van de functionele relatie tussen de eicellen, en de omliggende folliculaire cellen, wat cruciaal is voor een goede oocyte rijping. Zo zijn beide modellen een waardevol instrument voor fundamenteel onderzoek in de reproductieve biologie en kunnen ze ook klinische relevantie hebben, wat leidt tot een betere onvruchtbaarheidsbehandeling. Daarnaast kunnen ze ook worden toegepast voor de ontwikkeling van nieuwe biotechnologiemethoden, evenals voor de verbetering van de veestapel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn erg dankbaar voor: dr. Waclaw Tworzydlo (Department of Developmental Biology and Invertebrate Morphology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Jagiellonian University) voor technische faciliteiten in TEM; aan mevrouw Beata Snakowska (Departement Endocrinologie, Instituut voor Zoölogie en Biomedisch Onderzoek, Jagiellonian University) voor technische bijstand; aan de afdeling Celbiologie en Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japan). Dit werk werd ondersteund door subsidie 2018/29/N/NZ9/00983 van National Science Centre Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
References
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L.
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T.
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D.
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).
