Summary
ここでは、3D培養条件でのブタ卵母細胞のカプセル化のための2つのプロトコルを示します。第1に、cumulus-oocyte複合体(COC)はフィブリンアルギン酸ビーズにカプセル化される。第2に、フッ素化エチレンプロピレン粉末粒子(マイクロバイオリアクター)で封入される。両システムは、3D組織を維持するために最適な条件を保証します。
Abstract
生殖生物学では、人工授精と胚移植技術から始まったバイオテクノロジー革命は、卵母細胞体中体育(IVM)、体外受精(IVF)、体細胞からの核移動による家畜のクローニングなどの補助生殖技術の開発につながった。IVMは特に重要な方法です。商業的に重要な種や絶滅危惧種の生成間隔の短縮、ヒトの生体内再生に関する研究、細胞療法用トランスジェニック動物の生産など、用途向けの成熟した良質の卵母細胞を供給するプラットフォーム技術です。卵母細胞の品質という用語は、成熟を完了する能力を含み、受精させ、それによって健康な子孫を生じる。これは、IVF手順を含む受精を成功させるためには、良質の卵母細胞が最も重要であることを意味する。これは、ヒトの卵母細胞だけでなく、他の大型哺乳類種の成長を支える信頼性の高い培養方法を開発するのに多くの困難をもたらす。IVMの最初のステップは、卵母細胞のインビトロ培養です。この研究は、ブタ卵母細胞の3D培養のための2つのプロトコルを記述する。第1に、3Dモデルの積雲卵母細胞複合体(COC)は、フィブリンとアルギン酸の混合物を同時にゲル化するフィブリン-アルギン酸ビーズ補間ネットワークにカプセル化される。第2の1では、COCは培地の滴下に懸濁され、フッ素化エチレンプロピレン(FEP;ヘキサフルオロプロピレンとテトラフルオロエチレンの共重合体)粉末粒子を封入し、液体大理石(LM)と定義されるマイクロバイオリアクターを形成する。両3Dシステムは、気体インビトロ培養環境を維持します。また、平坦化とギャップ接合の崩壊を防止することでCOCs3D組織を維持し、卵母細胞と周囲の卵胞細胞との機能的関係を維持します。
Introduction
三次元(3D)を含む様々な培養システムの開発は、発達の初期段階であっても卵胞から分離された卵子の成長と成熟のための最適な条件を提供することを目的としています。これは、特に癌治療後に不妊症に苦しんでいる女性の増加を考慮して、生殖補助技術(ART)にとって非常に重要である1。インビトロ条件下での卵母細胞の成熟(IVM)は、家畜再生を目的として主にインビトロ胚生成に主に使用される確立された技術である2。しかし、ほとんどの哺乳類種では、cumulus-oocyte複合体(COC)の成熟率が高くても(範囲は60〜90%)3であり、その発達3能力は依然としてニーズに不十分である。これは、このような方法で得られた接合体の発達が、胚盤胞期までも低く、代理動物への移管後に、その生存率が期間に低下するためである。その結果、IVM手順4を行った卵母細胞から得られる胚の発達能力を高める必要がある。したがって、新しい成熟培地5が考案され、インビトロ培養の様々な期間が、種々の成長因子および分子8、9を有する培養培地の補充と共に86、7に9試験される。67
完全なIVMシステムの最初のステップは、インビトロ培養中に卵母細胞の持続可能な成長のための最適な条件を作成することです。卵母細胞の成長は、卵母細胞が重症10,11,11を再開する能力の特定の指標の1つである。さらに、適切な卵母細胞の体液培養系は、その核成熟および細胞質分化12を支持することができる必要がある。積雲卵母細胞複合体の形態は、ヒトおよび家畜12、13,13における体外受精(IVF)処置の後続のステップのための最良の卵母細胞を選択するためにARTクリニックで使用されるもう一つの重要な指標である。考慮されるCOCsの形態学的特徴の中には、卵母細胞径、その細胞質顆粒化および第1極体の完全性14、15,15がある。また、卵母細胞の発達ポテンシャルは、cumulus細胞の外観と圧縮と、卵母細胞を取り囲むそれらの層の数と相関している。適切な卵母細胞のインビトロ培養システムにとって非常に重要なのは、卵母細胞-cumulus細胞の適切な相互作用および細胞骨格安定性16、17、18、1917,18,19の維持である。16これまでのところ、ヒトCOC内のインビトロ卵母細胞の成長は20.牛のCOCの使用はまた、出生をもたらした。これらは、未熟な卵巣卵胞から単離され、その後、卵母細胞がIVF手順21を受けるのに十分な大きさになるまで14日間培養した。同様に、ヒヒのアンタル卵胞から分離されたCOCは、インビトロ培養後にIVMを行い、正常に現れる紡錘構造22を有する転移II段階に微細化を生じることができる卵母細胞を得た。しかし、この研究では、著者はそれらを受精しようとしませんでした。それにもかかわらず、このような結果は、これらの特定の哺乳類種だけでなく、正常なIVF技術に適した良質の卵母細胞を得ることを可能にする必要がある卵胞から得られるヒト積雲卵母細胞複合体にも同様の手順を適用できることを示している。
上記の結果は、卵母細胞を2次元(2D)系で培養した従来のIVMプロトコルの適用で得られた。2D培養システムにおけるルーチン手順は、卵母細胞をカバーし、適切な培養培地の一滴に浸漬し、鉱物油23、24,24を用いた。インビトロ卵母細胞培養中のオイルオーバーレイは液体の蒸発を防ぐ役割を果たし、培養中の適切なpHおよび浸透圧の維持を保証するものと仮定されます。このような2D培養システムは、成熟豚卵母細胞25の87%までも得ることができるが、ミネラルオイルオーバーレイが適切な卵母細胞の開発26に必要な脂質溶性物質の実質的な拡散を引き起こすことが証明されている。さらに、卵母細胞培養中にステロイド(プロゲステロンおよびエストロゲン)が鉱油に拡散するため、核成熟の遅れ及び豚卵母細胞の発達能力の低下が観察された。これは、少数のザイゴテを得ることをもたらし、さらに、胚盤胞の段階への発達能力が低く、レシピエント動物27に移された後の生存率が低いことを特徴とする。そこで、IVM処置後に受け取った卵母細胞に由来する胚の発達能力を高める試みがなされており、特に3次元(3D)系を用いて、Cと共に培養した卵母細胞の細胞質および核成熟度の両方を達成するための最適な条件を作り出す。さまざまな革新的な3Dインビトロ培養システムは、過去20年間で開発されました28,,29.これらは、細胞の自然な空間的組織を維持し、伝統的な2D培養では達成できない培養料理の平坦化を避けるために設計されました。培養されたCOCsの構造的および機能的活動は、それらの適切なアーキテクチャの維持と、様々な区画30間のギャップ接合を介した妨げのない通信によって保証することができる。積雲-卵母細胞複合体の3Dインビトロ培養に対するバイオスキャフォールドの適合性は、細胞外マトリックス(ECM;コラーゲンおよびヒアルロン酸)31または不活性ポリマー(アルギン酸)31の様々な成分などの天然生体材料を用いて評価されている。いくつかの種でテストされたこれらの試みは、卵母細胞の明治と完全な能力の達成の面で有望な結果をもたらしました33,,34,,35.しかし、これまで、豚を含む大型家畜から分離されたCOCs成熟に適した3Dシステムは開発されていない。
この研究は、ブタCOCの3D培養に使用できる2つのプロトコルを説明しています。第1のプロトコルは、フィブリンアルギン酸ビーズ(FAB)におけるカプセル化について説明する。FABは、同期ゲル化プロセスを経たアルギン酸溶液とフィブリン溶液を同時に混合することによって形成することができる。この組み合わせは、両方のコンポーネントがマトリックスの剛性に寄与するため、動的な機械的環境を提供します。同様の溶液は、マウス卵巣卵胞培養および成熟36のために以前に使用されてきた。提示されたプロトコルの場合、アルギン酸フィブリンネットワークの早期劣化を避けるために、適切に高濃度の塩化カルシウム溶液が使用され、迅速かつ安定したゲル化プロセスを確保する。動的な機械環境は、COCが存在し、サイズが増加する自然な卵胞内環境で、これらと同様の条件を作成します。さらに、この研究は、これらが培地の滴下に懸濁され、フッ素化エチレンプロピレン(FEP;ヘキサフルオロプロピレンとテトラフルオロエチレンの共重合体)粉末粒子で封入されたCOC3D培養システムの代表的な結果を示し、マイクロバイオリアクター(液体マーブル、LM)を形成する。LMは、以前に支持することが示された3Dバイオリアクターの形態であり、とりわけ、生きている微生物37、腫瘍スフェロイド38 および胚性幹細胞39の増殖。また、羊の卵母細胞培養40にも使用されています。LMsを用いたほとんどの実験では、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)粉末ベッドを1μm41の粒子サイズで作製したバイオリアクターを作製した。提示されたプロトコルは、フルオロポリマーPTFEと組成および特性において非常に類似しているFEPを使用する。しかし、FEPはPTFEよりも簡単に形成でき、柔らかく、特に重要なのは、非常に透明です。
両3Dシステムは、気体インビトロ培養環境を維持します。また、卵母細胞と周囲の濾胞細胞との機能的関係を維持しながら、平坦化とギャップ接合の崩壊を防ぐことでCOC 3D組織を維持します。
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Protocol
以下の手続きは、ジャギエロン大学動物生物学・生物医学研究所の動物福祉委員会によって承認されました。
1. ブタクムルス-卵母細胞複合体の分離
- 卵巣卵胞の分離のための材料を収集するために、地元の食肉処理場で、産前の歯石(約6〜7ヶ月、体重70〜80kg)からのブタ卵巣を切除する。各実験でCOCを分離するために10匹の動物から約20匹の豚の卵巣を選択してください。
注:各卵巣が3〜5個の卵胞を生み出すと仮定すると、卵胞の総数は60から100まで変化します。 - 1%のAASを含む無菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS;pH 7.4;38°C)を有する魔法瓶に卵巣を入れる。実験材料が1時間以内に実験室に輸送され、そこで抗生物質を含む滅菌PBSで2回すすがるようにしてください。
- 卵巣をすすいた後、HM培地で満たされたビーカーに移し、すべての操作の時間のために38°Cのインキュベーターに保管します。
注:卵母細胞の取り扱い中に最適な結果を得るには、2.5%の抗生物質/抗ミクサ溶液(AAS)と10%の牛血清(FBS)を加えてDMEM/F12培地(ハンドリング媒体、HM)のすべての手順を実行し、温度制御(38°C)を備えた加熱テーブルで、環境中のCO2 レベルでpHを制御します。 - 大きな豚卵胞(直径6〜8mm)から、室温で10分間100 x g で、吸引と遠心分離によって濾胞液(FF)を収集します。その後、0.2μmの膜細孔フィルターに付着した滅菌シリンジを用いて上清をろ過し、-80°Cで凍結をスナップする。
注:卵胞液の吸引にインスリン注射器(u- 40)を使用してください。 - COCs分離42には、健康で中型の卵胞(直径4~6mm)のみが選択されていることを確認してください。
注:グレードIのCOCsは、均質な卵形と多層(少なくとも3〜4)コンパクト積雲を有する無傷で丸い卵母細胞を有し、さらに3D IVM手順43に適していると考えられる。 - COCを分離するには、2〜3個の卵巣を、HMで満たされた直径10cmのペトリ皿に移し、以下の手順のいずれかに従って中型卵胞からCOCを分離する。
- 無菌の外科用ブレード15Cで突出した卵巣卵胞の表面を静かに切断する。これにより、CCsと一緒に濾胞液がペトリ皿に流れ出ます。
- 使い捨て注射器に取り付けられた5/8インチのサイズを有する28 G針を使用して濾胞内容を吸引し、ペトリ皿に移す。
注:卵巣組織の残骸を捨てる。分離の後続の段階は、実体顕微鏡下で行われます。
- 3-5 60 mm IVF ペトリ料理を準備します。
- HMの1mLを中央のウェルに加え、外輪に3~4滴(1滴あたり50μL)を入れる。
- 次いで、ポリカーボネートマイクロピペットを使用して、損傷していないCOCを外輪のHMの滴に移動させ、3〜4回短時間リンスします。
- 最後に、中央の井戸に個別に転送します。さらなる手順のために、このIVFプレートをインキュベーターに保管してください。
- COCを収集した後、以下にリストされている2つの異なるIVMカプセル化プロトコルにランダムに割り当てることで、最終的な選択手順を実行します。
2. フィブリンアルギン酸ヒドロゲルビーズのカプセル化
- トリスバッファー生理生理(TBS;pH 7.4)に50 IU/mLトロンビンの1 mLを2.0 mLの無菌マイクロ遠心チューブに100 mM CaCl2 で調製します。
- フィブリノーゲンストック液(TBS50mg/mL)を準備し、冷凍しておきます。
注:TBSでフィブリノーゲンを溶解する際の凝集を避けるために、TBSを37°Cに加熱してください。- 手順の日に、氷の上でゆっくりと解凍し、使用が室温になる直前に解凍します。
- 使用前に1:1比0.5%アルギン酸溶液と50mg/mLフィブリノーゲン溶液で混合し、最終的に2mL(FA)を得る。滅菌マイクロ遠心分離管で混合物を穏やかに渦巻く。泡を作らないようにしてください。
- 「インキュベーションチャンバー」を準備するには、ガラス顕微鏡スライドにパラフィンフィルムの薄いストリップを適用します。
注:使用前に70%のEtOHでスライドを拭いてください。1つのインキュベーションチャンバーは2つのスライドで形成される。それらを分離するには、それらの1つに3ミリメートルのスペーサーを配置します。 - このパラフィンフィルムコーティングガラススライドにFA混合物のピペット7.5 μL滴、また分離スペーサーを有する。1つのスライドの場所に8-10滴、2行に配置。
- マイクロピペットを使用した3~5コマを最小量(最大5μL)の成熟培地(MM)と共に転送し、FAドロップの中心に正確に配置します。この手順は、優れた手技と精度が必要です。
注:成熟培地(MM)は、ステップ1.4で収集された10 IU / mL PMSG、10 IU / mL hCG、10%FBSおよび50%ブタ濾胞液(FF)を補ったDMEM / F12で構成されています。 - 各FAドロップに7.5 μLのトロンビン/Ca2+ ソリューションを追加してカバーします。ゲルはほぼ瞬時に形成されるため、それらを混合する必要はありません。
- 第2の、前に調製したガラススライドをFAカプセルに塗布することによって、インキュベーションチャンバーを覆う。非常に慎重だがしっかりした動きで、チャンバーを逆さまにし、乾燥を避けるために湿ったろ紙が並ぶ100ミリメートルペトリ皿に入れます。
- その後、ペトリ皿を5%CO2イン2キュベーター(38°C)に約5〜7分間移します。この後、FAカプセルはフィブリンとアルギン酸塩の同時ゲル化のために曇りになります。
- FAカプセルを、1ウェルあたり100μL MMを含む96ウェルプレート(ウェルあたり1カプセル)に移します。
注:形成されたFAカプセルを損傷しないように、外科用鉗子を使用してこのステップを慎重に行ってください。 - 2日ごとにMMの半分(50 μL)を新鮮で事前に平衡化されたものに置き換えます。反転光顕微鏡を用いた画像COC(10倍倍)
注:COCs FA培養の培養条件:38°C、5%CO22雰囲気下、相対湿度95%。IVMの4日後、ヒドロゲルはフィブリン成分の進行性の分解のためにほぼ明確に現れる。残りのアルギン酸は、アルギン酸を特異的に分解し、動物細胞に影響を与えない植物由来酵素であるアルギン酸塩・リアーゼによって酵素的に分解されるべきである。- カプセルを含むウェルからMMを取り除き、DMEMに10 IU/mLアルギン酸リアーゼの100 μLを加えます。培養プレートをインキュベーターに25〜30分間放置します。
- 溶解したカプセルからCOCを取り除きます。
注:これはカットピペットチップで行うことができます。 - 新鮮なDMEMで数回の洗い物をした後、PBSを含むIVF皿(1皿あたり5〜10個のカッコ)の内側のリングにCOCを移します。今、さらなる形態学的または生化学的分析のためにそれらを使用してください。
3. 超疎水性フッ素化エチレンプロピレン(FEP)マイクロバイオリアクターにカプセル化。
注: すべての IVM 手順がサーモスタット制御テーブルで実行され、取り扱い全体を通して COC が 38 °C に維持されていることを確認してください。
- 5gのFEP粉末のベッド平均粒径を1μm含む30mmペトリ皿を用意します。
注:新鮮なFEPパウダーを使用することが重要です。再使用されたFEPは凝集する傾向があり、塊を形成する。 - ステップ1.6で分離した3~5個のCOCsを含むMM(体積30μL程度)の単一の液滴を、FEP粉末のベッドに分配します。これらの粒子が液体の落下の表面を完全に覆い、液体大理石(LM)を形成するように、円の動きでプレートを穏やかに回転させます。
- 1,000 μL の先端を持つピペットを使用して、形成された LM をピックアップします。
注:エッジでピペットチップを切り取り、LMの直径(4〜5mm)に収めます。このような準備された先端の概径は、LMのそれよりもわずかに大きくする必要があります。 - いくつかの60ミリメートルIVFペトリ料理を準備します。3~4mLの無菌水を外輪に加え、湿度チャンバーを準備します。次に、1 つの LM を中央の井戸に配置します。
注:この手順は、良好な手動スキルと精度を必要とします - 大理石が不注意に配置されているか、低い高さから落ちる場合は、それが破壊されます。 - 5%CO2 インキュベーターで38°Cで4日間のインキュベート大理石。
- 手順に従って毎日培地を変更する:直接液体接触がコーティングされたFEP粉末の疎水性を破壊するので、各LMに30 μLのMMを適用します。大理石の含有量が溶解したら、バイオリアクターから放出されたCOCsをペトリ皿の新鮮なMMの滴に移します。
注:放出されたCOCsを正確に移すには、ポリカーボネートマイクロピペットを使用してください。 - MM(3-4回)で数回の水を流してFEP粒子を除去し、30μLの新鮮なMMをFEPパウダーベッドに移します。粉末粒子が液体の落下の表面を完全に覆い、新しいLMを形成するように、プレートを円運動でそっと回転させます。
- その後、手順 3.3 から 3.4 の手順に従います。
メモ:FEP粉末の透明コーティングは、光顕微鏡を使用してLM含有量を監視することができます。
- 手順に従って毎日培地を変更する:直接液体接触がコーティングされたFEP粉末の疎水性を破壊するので、各LMに30 μLのMMを適用します。大理石の含有量が溶解したら、バイオリアクターから放出されたCOCsをペトリ皿の新鮮なMMの滴に移します。
4. 2つの3Dシステムを用いた96-h IVM手順後のCOCの特性評価
注: 使用する IVM システムの効率を判断するには、IC を光顕微鏡で形態的にスコア付けします。さらに、COCsの生存率44の分析には、カルセインAMおよびエチジウムホモジマー(EthD-1)色素を用いた二重蛍光標識を使用する。
- IVM後の卵母細胞の形態学的検査を光および蛍光顕微鏡による。
- 38 °C 1x PBSでCOC(FABを使用した培養物およびLM由来のもの)を洗浄します。
注:CCsの取り扱いを容易にし、染色手順中にCOCを損傷しないようにするには、96または48ウェルプレートを使用し、その後のウェルにCOCを移すことによって各染色ステップを実行します。 - 1.6 mMカルセインAMの100 μL、37°Cで30〜45分間5.5 mM EthD-1でインキュベートします。 1x PBSで両方の物質を希釈します。
注:これは2色蛍光アッセイなので、暗闇の中でこのステップを実行してください。 - インキュベーション後、COCをPBSで2回洗浄し、蛍光タンパク質および蛍光色素の迅速な光化を防ぐように設計されたアンチフェード実装媒体に浸します(材料表)。
注:マニキュアで乾燥させないようカバーガラスの縁を保護します。 - 共焦点レーザー走査顕微鏡で染色されたサンプルを可視化します。
注:両方のプローブ(すなわち、カルセインおよびエチジウムホモジマー-1、EthD-1)の蛍光を励起するために、アルゴンレーザーを488nmに調整します。放出された蛍光は三重二色フィルタ488/561/633で分離され、緑色の1(カルセイン)の場合は505-570 nm、赤色の場合は630-750 nm(EthD-1)で測定されます。 - COCを4つのカテゴリーに分類し、死んだ顆粒球細胞35の割合に基づいて共焦点蛍光イメージングに基づいて培養中の卵巣卵胞に適用される修飾分類を用いる。 V1: 100% 実行可能な CC が推定されるコク;V2: 死んだ CC の 10% を持つコク;V3: 10~ 50% の死んだ CC を持つコク。V4: 死んだ CC の 50% を持つコク。
注意:技術的には、生死したアッセイで卵母細胞の生存率を評価することは困難です。したがって、ミトコンドリアの超構造または活性を分析することによって、例えば推定されるべきである。
- 38 °C 1x PBSでCOC(FABを使用した培養物およびLM由来のもの)を洗浄します。
- 透過電子顕微鏡によるIVM後の卵母細胞超構造の検討
- COCsを100 μL 2.5%グルタルアルデヒドに0.1 Mのカコチル酸ナトリウムバッファー(pH 7.2、室温)で2時間固定します。
- COCを100 μL 0.1 Mのカコダイレートバッファー(4°Cで一晩)に浸し、同じバッファーにリンスします。
- 1時間の0.1 Mナトリウムカコチル酸緩衝液(室温)に1%オスミウム四酸化された後置COC。
- 酢酸ウラニル(1%)で染色した後、増え続ける一連のエタノール希釈液(50%、60%、70%、90%および100%)でCOCを脱水し、室温で一晩浸潤し、続いて樹脂を2回短く変え、最後にLRホワイトに埋め込む。
- 次に、サンプルの配向と評価を行うために、メチレンブルー/アズルIIで半薄いセクション(1 μm)を染色します。
- 最後に、TEMで超構造レベルで超薄く二重に染色されたセクションを調べます。
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Representative Results
両方のIVMシステムを使用するCOCでは、グラヌローサ細胞が互いに密着し、回収されたCOCのほとんどは積雲細胞の無傷の層を有していた(図1A,B)。さらに、cumulus細胞のかなりの割合を保持した。
COCsの生存率分析から得られた結果から、両システムが3Dインビトロ条件でブタ卵母細胞のカプセル化に適用され、最適な成長条件を保証することが確認された(図2)。両群とも、高生存卵母細胞のみが観察され、V1=13%、V2=87%がFAB、10%V1、LMがそれぞれ90%V2であった(表1)。
ミトコンドリアは、透過型電子顕微鏡(TEM)により観察され、卵母細胞中に均等に分布し、IVM後の形状はシェル状45であった。それらのほんの一部は細長く、さらに、クラスタリングは散発的に観察された(図1C,D)。小胞子は、ミトコンドリアに関連するか、卵母細胞細胞質中で遊離を伴うかのどちらかを観察した。脂質滴は小さな暗い丸い構造として現れ、ゴルジ装置は拡張された水槽で出現した(図1C,D)。
| V1 | V2 | V3 | V4 | ||||
| % | 数 | % | 数 | % | 数 | % | |
| 工場 | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| CO の総数: 144 | 16a | 128b | 0 | 0 | |||
表 1.フィブリンアルギン酸ビーズ(FAB)およびマイクロバイオリアクターFEP、液体大理石(LM)を用いたカプセル化後のCOCの生存可能性に関する結果。 結果は平均で与えられた。上付き文字 (a, b) を持つ値は統計的に有意に異なっています (p <0.05)。
図1:96時間のカプセル化後のCCSの形態と超構造を示す代表的な画像。 (A) FAB内部のCOCの形態 - 光顕微鏡;(B) LM内部のCOCsの形態 - 光顕微鏡;C:卵母細胞超構造(TEM)FAB内のインビトロ培養後;D:LM内のインビトロ培養後の卵母細胞超構造(TEM)。O:卵母細胞;CC: 積雲細胞;ZP:ゾナ透明。N: 核;M: ミトコンドリア;G:ゴルジ装置;ER: 小胞子;Lp: 脂質滴;FA:アルギン酸およびフィブリンフィラメント;FEP:ヘキサフルオロプロピレンとテトラフルオロエチレンの共重合体の粉末。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:カプセル 化96時間後のCOCの代表的な蛍光画像。(A,B)IN Vitro培養後に得られた同じCOCに対して得られた画像は、生細胞または死細胞に対する緑色蛍光または赤色蛍光をそれぞれ可視化する2つのフィルターを用いたFABを用いて、両方を(C)結合する。(D,E)インビトロ培養後に同じCOCに対して得られた画像は、生細胞または死細胞に対する緑色蛍光または赤色蛍光をそれぞれ可視化する2つのフィルターを備えたLMを用いて、それらの(F)結合をそれぞれ行った。スケールバー= 50 μm。白いアスタリスクは、細胞がアポトーシスを受けているのを示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
卵母細胞だけでなく、それを取り巻くcumulus細胞の成長を維持し、同時にその成熟を支える能力は、生殖技術の成功と、特にヒトや豚などの長引く濾胞性成長を受けている種における体細胞/卵母細胞相互作用の理解を促進するために非常に不可欠である。継続的に改善されたIVM技術は、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)、早期卵巣不全、または決定的な不妊症(腫瘍療法)の場合に生殖オプションを維持するのに有用なツールになりつつあります。さらに、ある卵巣機能障害は濾胞性の成長の調節不全によって引き起こされる可能性があるため、卵母細胞の適切な発達を制御する分子および細胞のメカニズムを理解することは、これらの状態の病態生理および合理的な治療に関する重要な洞察を提供するかもしれない。IVM中のCOCs 3Dアーキテクチャの維持をサポートするインビトロ培養システムは、マトリックス内またはバイオリアクター内にカプセル化のステップを必要とする。この研究は、ブタ卵母細胞の培養に適用できるプロトコルを記述する。ブタCOCの成長と開発を誘導するためにここに提示された両方の3D in vitro培養システムはユーザーフレンドリーであり、卵母細胞およびcumulus細胞の生存の両方の効果的な制御を可能にする。
ここで提示するフィブリンアルギン酸ヒドロゲルビーズ(FAB)でのカプセル化を用いたCOCの最初のインビトロ培養法は、積極的に細胞応答性マトリックス環境における3D卵母細胞増殖を可能にする。アルギン酸ヒドロゲルに基づいて以前に公開されたプロトコルは、通常、非常に有望な結果を有する多数の動物種から分離された卵巣卵胞の開発の調査に使用された32。興味深いことに、アルギン酸ヒドロゲル32 の最終組成またはカプセル化法自体46に関係なく、これらの研究は、アルギン酸ビーズベースの3D培養システムが濾胞成長およびその生存を支えることができたことを示した。
アルギン酸ヒドロゲルは卵胞に優しく、体外でのさらなる生存または発達に影響を与えませんでした。同様に、ここで初めて説明したCOCsのインビトロ培養プロトコルは、形態学的および超構造レベルの両方で文書化されたように、良好な豚卵母細胞を生成するのに適している。アルギン酸溶液中のフィブリノーゲンの存在と同時ゲル化により、3次元環境を作り出し、さらに安定化させるインターペニングネットワークの形成が生じます。このようなマトリックス内部の特定の構造的支持により、卵母細胞と積雲細胞との間の細胞間接触およびパラクリン通信は、生体内に存在するこれらの場合と同様に維持される。
この文書で説明する成熟プロトコルにおける2つの最も重要なステップは、インキュベーションチャンバーからMMを含む96ウェルプレートへのFAカプセルの移動(ステップ2.10.)と、残りのアルギン酸の酵素分解後の溶解カプセルからのCOCの除去である(ステップ2.11.両方のステップは、第1の場合、カプセルの破壊、第二の場合の破壊を避けるために重要な手動スキルと精度を必要とします - COCsへの損傷。
この方法の主な強みは、大きな家畜の卵母細胞成熟に最適な条件を確立することに加えて、TEMを用いた分析の際に、光顕微鏡または共焦点顕微鏡検査、カプセル除去が不要である点である。アルギン酸はイメージング時の障壁ではない。カプセルにCOCsを残すことは、染色手順の間に操作を容易にする。
ここで提示される第2のCOC in vitro培養物は、LMを用いたものであり、これは一般的に、微小スケール粒子で覆われた非スティック液滴であり、非常に疎水性の粉末47内で少量の液体を単に転がすことによって得られる。培養のためのLMを用いるこれまでの研究は、とりわけ線維芽細胞48、赤血球49、腫瘍38のオルガノイド、膵臓細胞50 または羊卵母細胞36 を液滴の調製のための疎水性ポリマーとして用いて行われている。PTFEは、診療所(例えば、心血管移植片)で広く使用されている。
本研究では、ブタCOCのインビトロ培養用FEP粒子からなる微生物反応器の信頼性の高い方法を初めて紹介する。提示されたプロトコルでの FEP の使用は、構成と PTFE とプロパティが非常に類似しており、LM の準備がはるかに容易になります。この粉末はPTFEよりも柔らかく、特に重要なのは透明です。これにより、その使用を培養した構造物のイメージング時の作業が簡素化されます。FEPを用いたLMの形成の容易さは、この方法の明確な利点である。
この文書で説明されている成熟プロトコルの最も重要なステップは、ピペットチップを使用して形成されたLMを60 mmのIVFペトリ皿に拾って転送することです(ステップ3.3および3.4.これらのステップは、LMの破壊を避けるために、多大な手作業のスキルと精度を必要とします。
おそらく, ここに提示された 3D 卵母細胞成熟誘導プロトコルの主な制限は、抗生物質で治療されていない動物から収集された適切な研究材料を得る際の比較的大きな困難です, 蛋白同化ステロイド (すなわち, ナドロロン, ボルデノン) または彼らの急速な成長を促進する酢酸小間ロール.これらのステロイド, ヨーロッパで禁止されているその使用にもかかわらず、, まだ広く肥育期間の最後の 2 ヶ月の間に産業家畜の繁殖で利用されています, とりわけ, 性的成熟を乱す.
結論として、ここで提示される両方の3Dシステムは、最適なガスのインビトロ培養環境を維持します。また、平坦化とギャップ接合の崩壊を防ぐことでCOC3D組織を維持し、卵母細胞と周囲の卵胞細胞との間の機能的関係を維持し、適切な卵母細胞成熟に不可欠である。したがって、両方のモデルは生殖生物学の基礎研究のための貴重なツールであり、また、改善された不妊治療につながる臨床関連性を持っている可能性があります。また、新しいバイオテクノロジー手法の開発や、家畜の改良にも応用できます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、TEMの技術施設に関して、ワクロー・ツーィドロ博士(ジャギエロニア大学動物学・生物医学研究所発生生物学・無脊椎動物形態学科)に非常に感謝しています。ベアタ・スナコフスカ氏(ジャギエロン大学動物学生物医学研究所内分泌学科)に技術支援を依頼する。ジャギヨニアン大学動物生物学・生物医学研究所細胞生物学・イメージング学科(日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本)にJEOL JEM 2100HTこの研究は、ポーランド国立科学センターからの助成金2018/29/N/NZ9/00983によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
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