Summary
Presenteras här är två protokoll för inkapsling av porcin oocytes i 3D-kultur villkor. I den första, cumulus-oocyte komplex (COCs) är inkapslade i fibrin-algininate pärlor. I den andra är de inneslutna med fluorerade etylenpropylenpulverpartiklar (mikrobioreaktorer). Båda systemen säkerställer optimala förutsättningar för att behålla sin 3D-organisation.
Abstract
Inom reproduktionsbiologin ledde den biotekniska revolution som började med artificiell insemination och embryoöverföringsteknik till att det blev så att man kunde utveckla assisterad reproduktionsteknik som oocyte in vitro-mognad (IVM), provrörsbefruktning (IVF) och kloning av tamdjur genom kärnvapenöverföring från somatisk cell. IVM är metoden särskilt av betydelse. Det är plattformstekniken för leverans av mogna, högkvalitativa oocyter för tillämpningar som minskning av generationsintervallet i kommersiellt viktiga eller hotade arter, forskning om human reproduktion in vitro, och produktion av transgena djur för cellterapier. Termen oocyte kvalitet omfattar dess kompetens att slutföra mognad, befruktas, vilket resulterar i friska avkomma. Detta innebär att äggceller av god kvalitet är av största vikt för framgångsrik befruktning inklusive IVF förfaranden. Detta medför många svårigheter att utveckla en tillförlitlig odlingsmetod som skulle stödja tillväxten inte bara av mänskliga oocyter utan också av andra stora däggdjursarter. Det första steget i IVM är in vitro-kulturen av oocyter. Detta arbete beskriver två protokoll för 3D-kulturen av porcina oocytes. I den första, 3D-modell cumulus-oocyte komplex (COCs) är inkapslade i en fibrin-alginate bead interpenetrating nätverk, där en blandning av fibrin och alginat är gelled samtidigt. I den andra är COCs upphängda i en droppe medium och inkapslade med fluorerad etylenpropylen (FEP; en copolymer av hexafluorpropen och tetrafluoreten) pulverpartiklar för att bilda mikrobioreaktorer som definieras som Liquid Marbles (LM). Båda 3D-systemen upprätthåller den gasformiga in vitro-kulturens miljö. De upprätthåller också COCs 3D-organisation genom att förhindra deras utplaning och därav följande störningar av gap korsningar, och därmed bevara funktionella förhållandet mellan äggcell, och omgivande follikulära celler.
Introduction
Utvecklingen av olika kultursystem, inklusive tredimensionella (3D) sådana, syftar till att ge optimala förutsättningar för tillväxt och mognad av äggceller isolerade från folliklar även i tidigaste utvecklingsstadier. Detta är av stor betydelse för assisterad reproduktionsteknik (ART), särskilt med tanke på det ökande antalet kvinnor som kämpar med infertilitet efter cancerbehandling1. Mognad av oocyter i in vitro-förhållanden (IVM) är redan en väletablerad teknik som huvudsakligen används för embryogenerering in vitro för ändamålet med boskapsreproduktion2. Hos de flesta däggdjursarter, även om höga mognadstal av komplex av cumulus-oocyte (COCs) kan uppnås (intervall 60 till 90 %)3, är deras utvecklingskompetens dock fortfarande otillräcklig för behoven. Detta beror på att utvecklingen av zygoterna som erhålls på ett sådant sätt även upp till blastocyststadiet är låg och efter överföringen in i surrogatdjur deras livskraft att sikta minskas. Följaktligen finns det ett behov av att öka utvecklingskompetensen hos embryon som erhållits från oocyter som utsattes för IVM-förfarandet4. Därför är nya mognad media5 håller på att utformas och olika perioder av in vitro-kultur testas6,7 tillsammans med tillskott av kultur medier med olika tillväxtfaktorer och molekyler8,9.
Det första steget i alla kompletta IVM-system är att skapa optimala förutsättningar för hållbar tillväxt av äggceller under in vitro-kulturen. Ocyttillväxten är en av de specifika indikatorerna på äggcellens förmåga att återuppta meiosis10,11. Dessutom måste ett lämpligt oocyte in vitro-odlingssystem kunna stödja dess kärnmognad och cytoplasmatiska differentiering12. Morfologin i cumulus-oocyte komplexet är en annan viktig indikator som används i ART kliniker för att välja ut den bästa äggcell för efterföljande steg av in vitro-fertilisering (IVF) förfarande hos människor och boskap12,13. Bland morfologiska egenskaper COCs beaktas är: den oocyte diameter, dess cytoplasma granulation och den första polarkroppen integritet14,15. Förutom, den oocyte utvecklingspotential är korrelerad till utseende och kompaktering av cumulus celler och antalet av deras lager som omger äggcellen. Mycket viktigt för lämplig oocyte in vitro-odling systemet är också upprätthållandet av oocyt–cumulus celler korrekt interaktioner och cytoskelett stabilitet16,17,18,19. Hittills har in vitro-oocytetillväxt inom humana COCs visats20. Användningen av ko COCs resulterade också med levande födda. Dessa isolerades från omogna äggstocksfolliklar och sedan odlade i 14 dagar tills äggcellen var tillräckligt stor för att genomgåIVF-förfarandet 21. På samma sätt gav COCs isolerade från babian antrala folliklar, utsätts ivm efter in vitro-kultur äggceller som kan återitiera meios till metafas II-stadiet med en normal visas spindel struktur22. Men i denna studie författarna inte försöka befrukta dem. Icke desto mindre tyder sådana resultat på att ett liknande förfarande skulle kunna tillämpas inte bara på dessa särskilda däggdjursarter utan även på humana cumulus-oocytekomplex som erhållits från folliklar vad som borde göra det möjligt att erhålla oocyter av god kvalitet som lämpar sig för en framgångsrik IVF-teknik.
De ovan beskrivna resultaten erhölls med tillämpning av konventionella IVM protokoll under vilka äggceller var odlade i tvådimensionella (2D) system. Rutinförfarandet i 2D-odlingssystem täcker oocyter, nedsänkt i en droppe av en lämplig kultur media, med mineralolja23,24. Det antas att en olja overlay under in vitro-oocyte kultur tjänar till att förhindra vätskeavdunstning, vilket säkerställer upprätthållandet av korrekt pH och osmotiska trycket i kulturen. Även om en sådan 2D-odling system gör det möjligt att erhålla, även upp till 87% av mogna gris oocyter25, har det bevisats att mineraloljan overlay orsakar betydande diffusion av lipidlösliga material som är nödvändiga för korrekt oocyter utveckling26. Dessutom, på grund av steroider (progesteron och östrogener) diffusion i mineraloljan under äggcell kultur, en försening av nukleära mognad och minskning av utvecklingsmässiga kompetens uppnåendet av gris oocytes observerades. Detta kan resultera i att få ett litet antal zygoter, som dessutom kännetecknas av låg utvecklingskapacitet till scenen i blastocyst och av dålig livskraft efter överföring till mottagande djur27. Därför görs försök att öka utvecklingsmässiga kompetensen hos embryon som härrör från äggceller som mottagits efter IVM förfarande, genom att skapa optimala förutsättningar för att uppnå både cytoplasmatiska och nukleära mognad av äggceller odlade tillsammans med CCs som komplex, särskilt med hjälp av tredimensionella (3D) system. Olika innovativa 3D in vitro-kultur system har utvecklats under de senaste två decennierna28,29. Dessa var utformade för att upprätthålla den naturliga rumsliga organisationen av celler och för att undvika att de plattas i kulturrätter vad som inte kan uppnås i de traditionella 2D-kulturerna. Den strukturella och funktionella aktiviteten hos odlade COCs kan säkerställas genom upprätthållandet av deras rätta arkitektur och ostörda kommunikation genom gap-korsningar mellan olikafack 30. Bio-byggnadsställningars lämplighet för 3D in vitro-odling av cumulus–oocytekomplex har utvärderats med hjälp av naturliga biomaterial som olika komponenter i den extracellulära matrisen (ECM; kollagen och hyaluronsyra)31 eller inerta polymerer (alginat)32. Dessa försök som testades i flera arter förde lovande resultat i form av oocyte meios återupptagande och uppnåendet av deras fulla kompetens33,34,35. Hittills har dock inget 3D-system som är lämpligt för KOL-mognad som isolerats från stora husdjur, inklusive svin, utvecklats.
Detta arbete beskriver två protokoll som kan användas för 3D-kulturen av porcine COCs. Det första protokollet beskriver inkapsling i fibrin-alginatpärlor (FAB). FAB kan bildas genom samtidig blandning av en alginat- och fibrinlösning, som genomgår en synkron gelationsprocess. Denna kombination ger en dynamisk mekanisk miljö eftersom båda komponenterna bidrar till matrisstyvhet. En liknande lösning har använts tidigare för mus äggstocksfollikel kultur och mognad36. När det gäller det presenterade protokollet, för att undvika för tidig nedbrytning av alginat-fibrinnätverket, används lämpligt högre koncentrationer av kalciumkloridlösning, vilket garanterar en snabb och stabil gelationsprocess. Den dynamiska mekaniska miljön skapar förhållanden som liknar dessa i den naturliga intra-follicular miljö där COCs bor och öka i storlek. Dessutom visar arbetet representativa resultat av COCs 3D-odlingssystem, där dessa är suspenderade i en droppe medium och inkapslade med fluorerad etylenpropen (FEP; en samofer av hexafluorpropen och tetrafluoreten) pulverpartiklar, för att bilda mikrobioreaktorer (Liquid Marbles, LM). LM är en form av 3D bioreaktor som tidigare har visat sig stödja, bland andra, tillväxt av levande mikroorganismer37, tumör sfäroider38 och embryonala stamceller39. LMs har också framgångsrikt använts för får oocyte kultur40. I de flesta experiment med hjälp av 1:ler framställdes bioreaktorer med hjälp av polytetrafluoreten (PTFE) pulverbädd med partikelstorlek på 1 μm41. Det presenterade protokollet använder FEP, som är mycket lik i sammansättning och egenskaper till fluorpolymererna PTFE. Men FEP är lättare formbar och mjukare än PTFE och vad som är särskilt viktigt, det är mycket transparent.
Båda 3D-systemen upprätthåller den gasformiga in vitro-kulturens miljö. De upprätthåller också COCs 3D-organisation genom att förhindra deras tillplattande och därav följande störningar av gap korsningar, bevara deras funktionella relation mellan äggcellen och omgivande follikulära celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande förfaranden godkändes av djurskyddskommittén vid Institutet för zoologi och biomedicinsk forskning vid Jagiellonian University.
1. Isolering av komplex av svin cumulus-oocyte
- För att samla in material för isolering av äggstocksfolliklar, punktskatteosedoarries från prepubertala gylter (cirka 6-7 månaders ålder, väger 70 till 80 kg) på ett lokalt slakteri. Välj cirka 20 grisovaries från 10 djur för COCs isolering i varje experiment.
NOTERA: Om man antar att varje äggstock ger 3–5 folliklar, varierar det totala antalet folliklar från 60 till 100. - Placera äggstockar i en termos med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS; pH 7.4; 38 °C) som innehåller 1% AAS. Se till att försöksmaterialet transporteras till laboratoriet inom 1 h där det sköljs två gånger med steril PBS innehållande antibiotika.
- Efter sköljning av äggstockarna, överför dem till bägaren fylld med HM medium och förvara i en inkubator vid 38 °C för tiden för alla manipulationer.
OBS: För optimalt resultat under oocytehantering, utför alla procedurer i DMEM/F12-medium (hanteringsmedium, HM) med tillägg av 2,5% antibiotika/antimykotisk lösning (AAS) och 10% fetalt bovint serum (FBS) och kontrollera pH-värdet vid CO2-nivån i miljön, på ett värmebord med temperaturkontroll (38 °C) och under laminärflödeshuven för att minimera bakteriell kontaminering. - Från stora svin folliklar (6-8 mm i diameter) samla follikulär vätska (FF) genom aspiration och centrifugation vid 100 x g för 10 min vid rumstemperatur. Därefter filtrerar du supernatanten med hjälp av steril spruta som är fäst vid 0,2 μm membran porfilter och snäpper frysa vid -80 ° C.
OBS: Använd en insulinspruta (u- 40) till aspiration av follikulär vätska. - Se till att, endast friska, medelstora folliklar (4-6 mm i diameter) väljs för COCs isolering42.
OBS: COCs av grad I, som har en intakt och rund oocyte med homogen ooplasm och flerskiktade (minst 3-4) kompakta cumulus anses lämpliga för ytterligare 3D IVM förfarande43. - För att isolera COCs, överför 2-3 äggstockar till en steril 10 cm diameter Petri skålen fylld med HM. Isolera COCs från medelstora folliklar genom att följa en av förfarandena nedan.
- Skär försiktigt ytan av de utskjutande äggstocksfollarna med ett sterilt kirurgiskt blad 15C. Detta kommer att orsaka follikulär vätska tillsammans med COCs att flöda ut i Petri-skålen.
- Aspirera follikulärhalten med hjälp av 28 G nål med en storlek på 5/8"fäst på en engångsspruta och överföra den till petriskålen.
OBS: Kassera resterna av äggstocksvävnad. Efterföljande stadier av isolering utförs under ett stereomikroskop.
- Tillaga 3–5 60 mm IVF Petri-rätter.
- Tillsätt 1 mL HM till de centrala brunnarna och placera en 3-4 droppar HM (50 μL per droppe) i sina yttre ringar.
- Sedan, med hjälp av en polykarbonat mikropipette, flytta oskadade COCs till droppar AV HM i de yttre ringarna för att skölja dem kort för 3-4 gånger.
- I slutet, individuellt överföra dem till den centrala brunnen. Förvara denna IVF-plattor i en inkubator för ytterligare förfaranden.
- När COCs har samlats in utför du det slutliga urvalssteget genom att tilldela dem slumpmässigt i två olika IVM-inkapslingsprotokoll som anges nedan.
2. Inkapsling i fibrin-alginat hydrogel pärlor
- Förbered 1 mL av 50 IU/mL trombin i Tris-buffrad saltlösning (TBS; pH 7.4) med 100 mM CaCl2 i ett 2,0 mL sterilt mikrocentrifugrör.
- Bered fibrinogen stamlösning (50 mg/mL i TBS) och håll den frusen.
OBS: För att undvika att klumpa ihop sig vid upplösning av fibrinogen i TBS, värm TBS till 37 °C.- På dagen för förfarandet, tina det långsamt på is och precis innan användningen bringa till rumstemperatur.
- Strax före användning mix på en 1:1 ratio 0,5% alginatlösning och 50 mg/mL fibrinogen lösning för att få slutligen 2 mL (FA). I en steril mikrocentrifug röret försiktigt virvel blandningen. Undvik att göra bubblor.
- För att förbereda "inkubationskammare", applicera tunna remsor av paraffinfilmer på glasmikroskopsglasen.
OBS: Torka av objektglasen med 70 % EtOH före användning. En inkubationskammare bildas med två objektglas. För att separera dem, placera 3 mm distanser på en av dem. - Pipett 7,5 μL droppar av FA blandningen på denna paraffinfilm belagda glas slide, som också har separer distanser. På en bild plats 8-10 droppar, ordnade i två rader.
- Överför, med hjälp av en mikropipette, 3-5 COCs tillsammans med en minsta volym (upp till 5 μL) av mognadsmedium (MM), och placera dem exakt i mitten av FA droppe. Detta förfarande kräver goda manuella färdigheter och precision.
OBS: Mognadsmediet (MM) består av DMEM/F12, kompletterat med 10 IU/mL PMSG, 10 IU/mL hCG, 10 % FBS och 50 % svin follikulär vätska (FF) som samlats in i steg 1.4. - Tillsätt 7,5 μL trombin/Ca2+ lösning på varje FA-droppe, bara för att täcka dem. Det finns ingen anledning att blanda dem eftersom gelen bildar nästan omedelbart.
- Täck inkubationskammaren genom att applicera den andra, tidigare förberedda glasglaset på FA-kapslarna. Med en mycket noggrann men fast rörelse, vänd kammaren upp och ner och placera den i en 100 mm Petriskål fodrad med fuktigt filterpapper för att undvika torkning.
- Därefter överför du petriskålen till inkubatorn för 5 % CO2 (38 °C) i ca 5-7 min. Efter detta kommer FA kapslar blir grumlig på grund av samtidig gelation av fibrin och alginat.
- Överför FA-kapslar till 96 brunnsplattor (en kapsel per brunn) som innehåller 100 μL MM per brunn.
OBS: För att inte skada de bildade FA kapslarna, utför detta steg noggrant med användning av kirurgiska typpor. - Var 2:e dag ersätter hälften av MM (50 μL) med färsk, förjämförd. Bild COCs med hjälp av ett inverterat ljusmikroskop (vid 10x förstoring).
OBS: Odlingsförhållanden för COCs FA kultur: 38 °C, under en 5% CO2 atmosfär och relativ luftfuktighet 95%. Efter 4 dagar av IVM, de hydrogels visas nästan klart på grund av progressiv nedbrytning av fibrin komponenten. Återstående alginat bör brytas ned enzymatiskt - genom alginat-lyas, ett växt-härlett enzym som specifikt försämrar alginat och inte påverkar djurceller.- Ta bort MM från brunnar som innehåller kapslarna och tillsätt 100 μL av 10 IU/mL alginatlyas i DMEM. Låt odlingsplattan vara kvar i inkubatorn i 25-30 min.
- Ta bort COCs från de upplösta kapslarna.
OBS: Detta kan göras med en avskuren pipettspets. - Efter flera tvättar i en färsk DMEM, överför COCs till den inre ringen av en IVF-maträtt (5-10 COCs per maträtt) som innehåller PBS. Nu, använd dem för ytterligare morfologiska eller biokemiska analys.
3. Inkapsling i super-hydrofoba fluorerade etenpropen (FEP) mikrobioreaktorer.
OBS: Se till att alla IVM-procedurer utförs på termostatstyrd tabell och COCs bibehålls vid 38 °C under hela sin hantering.
- Förbered en 30 mm Petriskål som innehåller 5 g FEP-pulverbäddgenomsnitt partikelstorlek på 1 μm.
OBS: Det är viktigt att använda färskt FEP-pulver. Den åter använda FEP tenderar att aggregera och bildar klumpar. - Fördela en enda droppe MM (~30 μL i volym) som innehåller 3-5 COCs isolerade i steg 1.6 på sängen av FEP-pulvret. Rotera plattan försiktigt i en cirkelrörelse för att vara säker på att dessa partiklar helt täckte ytan av vätskedropp och flytande kulor bildas (LM).
- Plocka upp bildade LM med hjälp av en pipett med 1,000 μL spets.
OBS: Skär pipettens spets vid kanten, för att rymma den till diametern på LM (4-5 mm). Den ungefärliga diametern på sådan förberedd spets bör vara något större än LM:s. - Tillaga flera 60 mm IVF Petri-rätter. Tillsätt 3-4 mL sterilt vatten till de yttre ringarna för att förbereda fuktighetskammaren. Därefter placerar en LM i den centrala brunnen.
OBS: Detta förfarande kräver god manuell kompetens och precision - om marmor placeras slarvigt eller faller även från en låg höjd kommer det att förstöras. - Inkubera kulor i 4 dagar vid 38 °C i 5 % CO2-inkubator.
- Ändra mediet dagligen följande förfarande: applicera 30 μL MM på varje LM, vilket kommer att orsaka deras spridning eftersom direkt flytande kontakt stör hydrofobin hos de belagda FEP-pulveren. När marmorinnehållet löses upp överför du COCs som frigörs från bioreaktorn till en droppe färsk MM i petriskålen.
OBS: För att exakt överföra frisläppta COCs, använd en polykarbonat mikropipette. - Efter flera tvättar i MM (3-4 gånger) för att avlägsna FEP-partiklar, överför dem med 30 μL färsk MM på FEP-puderbädden. Rotera försiktigt plattan i en cirkelrörelse för att säkerställa att pulverpartiklarna helt täckte ytan på vätskedropp och bildar en ny LM.
- Följ sedan proceduren från steg 3.3-3.4.
OBS: Den genomskinliga beläggningen av FEP-pulver gör det möjligt att övervaka LM-innehåll med hjälp av ljusmikroskop.
- Ändra mediet dagligen följande förfarande: applicera 30 μL MM på varje LM, vilket kommer att orsaka deras spridning eftersom direkt flytande kontakt stör hydrofobin hos de belagda FEP-pulveren. När marmorinnehållet löses upp överför du COCs som frigörs från bioreaktorn till en droppe färsk MM i petriskålen.
4. Karakterisering av COCs efter 96-h IVM förfarande med hjälp av två 3D-system
OBS: För att bestämma effektiviteten i de IVM-system som används, poäng COCs morfologiskt under ett ljus mikroskop. Använd dessutom dubbel fluorescerande märkning med kalcein AM och ethidium homodimer (EthD-1) färgämnen för analys av COCs livsduglighet44.
- Morfologisk undersökning av oocyter efter IVM av ljus och fluorescensmikroskopi.
- Tvätta COCs (både de som härrör från kultur med hjälp av FAB och de från LM) med 38 °C 1x PBS.
OBS: För att underlätta hanteringen av COCs och inte skada dem under färgningsproceduren, använd en 96 eller 48 brunnsplatta och utför varje färgningssteg genom att överföra COCs till efterföljande brunnar. - Inkubera dem i 100 μL av 1,6 mM kalcein AM och 5,5 mM EthD-1 för 30–45 min vid 37 °C. Späd båda ämnena i 1x PBS.
OBS: Eftersom detta är en två-färg fluorescens assay, utför detta steg i mörkret. - Efter inkubationen, tvätta COC två gånger i PBS och sedan sänka ned den i ett antifade monteringsmedium som är utformat för att förhindra snabb fotoblekning av fluorescerande proteiner och fluorescerande färgämnen (Table of Materials).
OBS: Skydda kanterna på täckglas mot torkning med valfritt nagellack. - Visualisera färgade prover under en confocal laser scanning mikroskop.
OBS: För att excitera fluorescensen av båda sonderna (dvs. calcein och ethidium homodimer-1, EthD-1) stämma en argonlaser till 488nm. Den avgivna fluorescensen separeras med ett trippeldikroiskt filter 488/561/633 och mäts sedan vid 505−570 nm för den gröna (kalcein), och vid 630−750 nm för den röda (EthD-1). - Klassificera COCs i fyra kategorier, med hjälp av modifierad klassificering som tillämpas på äggstocksfolliklar i kultur baserat på confocal fluorescens imaging beroende på andelen döda granulosa celler35. V1: COCs med beräknade 100% livskraftiga CCs; V2: COCs med 10% av döda CCs; V3: COCs med 10–50% av döda CCs; V4: COCs med 50% av döda CCs.
OBS: Tekniskt sett är det svårt att bedöma livskraften hos äggcell med den levande-döda analysen; därför bör det uppskattas t.ex.
- Tvätta COCs (både de som härrör från kultur med hjälp av FAB och de från LM) med 38 °C 1x PBS.
- Undersökning av oocytes ultrastructure efter IVM genom transmissionselektronmikroskopi.
- Fix COCs i 100 μL 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natrium cacodylate buffert (pH 7,2, rumstemperatur) för 2 h.
- Sänk ned COC-kol i 100 μL 0,1 M natriumkodyodylatbuffert (över natten vid 4 °C) och skölj i samma buffert.
- Postfix COCs med 1% osmium tetroxid i 0,1 M natrium cacodylate buffert (rumstemperatur) i 1 h.
- Efter färgning i uranylacetat (1 %), dehydrera COCs i en ökande serie av etanol utspädningar (50%, 60%, 70%, 90% och 100%), infiltrera dem över natten vid rumstemperatur, följt av två korta förändringar av harts och slutligen, bädda in dem i LR White.
- Nästa, för att orientera och utvärdera prover, fläcken halvtunna sektioner (1 μm) med metylenblått/azurblåt/azurblå II.
- Slutligen, undersöka ultratunna, dubbelt färgade sektioner på den ultrastrukturella nivån med TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I COCs som använder båda IVM-systemen, granulosacellerna vidhäftade tätt till varandra, och de flesta av de återvunna COCs hade intakta lager av cumulus celler (Figur 1A,B). Dessutom behölls en betydande andel av cumuluscellerna.
De resultat som erhölls från KOL-analys genom lönsamhet bekräftade att båda systemen som tillämpades för inkapsling av porcina oocyter i 3D-in vitro-förhållanden säkerställde optimala tillväxtförhållanden (figur 2). I båda grupperna observerades endast hög-livskraft oocyter, V1 = 13 %, V2 = 87 % för FAB och 10 % V1, respektive 90 % V2 för LM (tabell 1).
Mitokondrier, observerats av transmissionselektronmikroskopi (TEM), var jämnt fördelade i oocyter, deras form efter IVM var skal-liknande45. Endast ett fåtal av dem var avlånga, dessutom var deras klustring sporadiskt observerades (Figur 1C,D). Endoplasmatiskt retikulum observerades, antingen i samband med mitokondrier eller fria i äggcell cytoplasman. Lipiddroppar uppträdde som små mörka runda strukturer och Golgi apparater framkom med dilaterad cisternae (Figur 1C,D).
| V1 | V2 | V3 | V4 | ||||
| % | Nummer | % | Nummer | % | Nummer | % | |
| Fab | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| COCs totalt antal: 144 | 16en | 128miljarder | 0 | 0 | |||
Tabell 1. Resultat på lönsamheten för COCs efter inkapsling med hjälp av fibrin-alginala pärlor (FAB) och mikrobioreaktorer FEP, Liquid Marbles (LM). Resultaten gavs som medeltal. Värden med upphöjda (a, b) skilde sig statistiskt signifikant (p <0,05).
Bild 1: Representativa bilder som visar KOL-kolornas morfologi och ultrastruktur efter en 96 h inkapsling. (A) morfologi av COCs inuti FAB - ljusmikroskopi; (B) morfologi av COCs inuti LM - ljus mikroskopi; C: oocyte ultrastruktur (TEM) efter in vitro-kulturen inuti FAB; D: ocyt ultrastructure (TEM) efter in vitro-kulturen inuti LM. O: äggcell; CCs: cumulusceller; ZP: zona pellucida; N: kärna; M: mitokondrier; G: Golgiapparat; ER: endoplasmatiskt retikulum; Lp: lipiddropp; FA: alginat och fibrinfilament; FEP: pulver av koolymer av hexafluorpropylen och tetrafluoreten. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Representativa fluorescerande bilder av COCs efter 96 h av inkapsling. (A,B) De bilder som erhålls för samma COCs efter in vitro-kultur med hjälp av FAB med två filter för att visualisera grön fluorescens eller röd fluorescens för levande eller döda celler respektive (C) sammanfogning av båda. (D,E) De bilder som erhålls för samma COCs efter in vitro-kultur med hjälp av LM med två filter för att visualisera grön fluorescens eller röd fluorescens för levande eller döda celler, respektive och (F) sammanfogning av dem. Skalstång = 50 μm. Vita asterisker indikerar celler som genomgår apoptos. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att upprätthålla in vitro-tillväxt inte bara av äggcellen utan även av cumulusceller som omger den och samtidigt stödja dess mognad är ytterst väsentlig för den framgångsrika assisterade reproduktionstekniken och för att främja förståelsen av somatiska cell/oocyte interaktioner speciellt hos arter som genomgår långvarig follikulär tillväxt såsom människor eller svin. Kontinuerligt förbättrad IVM tekniker blir användbart verktyg för att bevara reproduktiva alternativ i fall av polycystiskt ovariesyndrom (PCOS), prematur äggstockscancer misslyckande, eller slutgiltig infertilitet (oncotherapy). Dessutom, eftersom vissa äggstockscancer dysfunktioner kan orsakas av dysregulated follikulär tillväxt, förstå de molekylära och cellulära mekanismer som styr korrekt utveckling av äggcellsceller kan ge viktig insikt i patofysiologi och rationell behandling av dessa villkor. In vitro-odlingssystem som skulle stödja underhållet av COCs 3D-arkitektur under IVM, kräver ett steg av inkapsling i en matris eller inuti en bioreaktor. Detta arbete beskriver ett protokoll som kan tillämpas för kultur av porcine oocytes. Båda 3D in vitro-odlingssystem som presenteras här för att inducera tillväxt och utveckling av porcine COCs är användarvänliga och möjliggör en effektiv kontroll av både oocyt och cumulus celler överlevnad.
Den första in vitro-odlingsmetoden av COCs med hjälp av deras inkapsling i fibrin-alginate hydrogel pärlor (FAB) presenteras här möjliggör en 3D oocyte tillväxt i en aktivt cell-lyhörd matris miljö. Tidigare publicerade protokoll baserade på alginate hydrogels användes vanligtvis för undersökning av utvecklingen av äggstocksfolliklar isolerade från ett flertal djurarter med mycket lovande resultat32. Intressant, oavsett den slutliga sammansättningen av alginate hydrogel32 eller inkapsling metoden själv46, dessa studier visade att alginate pärla-baserade 3D-kultur system kunde stödja follikulär tillväxt och deras överlevnad.
Alginate hydrogels var skonsam mot folliklar, inte påverkar deras ytterligare överlevnad eller utveckling in vitro. På samma sätt, in vitro kultur protokoll coCs beskrivs för första gången här, är lämplig att generera god kvalitet gris oocytes, som det dokumenterades på både morfologiska och ultrastrukturella nivåer. Förekomsten av fibrinogen i en alginatlösning och deras samtidiga gelering, resulterar i bildandet av ett interpenetrating nätverk som skapar och ytterligare stabiliserar den tredimensionella miljön. På grund av det specifika strukturella stödet inuti en sådan matris, cell-till-cell kontakter och paracrine kommunikation mellan oocyter och cumulus celler upprätthålls på liknande sätt som dessa närvarande in vivo.
De två mest kritiska stegen i det mognadsprotokoll som beskrivs i detta dokument är överföring av FA-kapslar från inkubationskammare till 96-brunnsplattor som innehåller MM (steg 2.10.) och avlägsnandet av COCs från de upplösta kapslarna efter enzymatisk nedbrytning av återstående alginat, med hjälp av alginatlyas (steg 2.11.). Båda stegen kräver betydande manuell skicklighet och precision för att undvika, i det första fallet förstörelsen av kapslar, i den andra - skador på COCs.
Den viktigaste styrkan i denna metod, förutom att fastställa optimala förhållanden för oocytemognad av ett stort tamdjur, är att under analys med hjälp av TEM, lätt mikroskopi eller konfokalmikroskopi, ingen kapsel avlägsnande är nödvändig. Alginat är inte en barriär vid avbildning. Att lämna COCs i kapslar underlättar manipuleringen under infärgningsproceduren.
Den andra COC in vitro-kulturen som presenteras här är den med användning av LM, som i allmänhet är nonstick droppar som omfattas av mikro-skalade partiklar och erhålls genom att helt enkelt rulla små volymer av en vätska i en mycket hydrofoba pulver47. Tidigare studier med användning av LM för kultur, bland andra fibroblaster48, röda blodkroppar49, organoid av en tumör38, pankreasceller50 eller får oocyter36 har utförts med hjälp av polytetrafluoreten (PTFE) som en hydrofoba polymer för beredning av dropparna. PTFE används ofta på kliniken (t.ex. kardiovaskulära ympkvistar).
I detta arbete presenterar vi för första gången en tillförlitlig metod för mikrobioreaktorer tillverkade av FEP-partiklar för in vitro-kultur av porcina COCs. Användningen av FEP i det presenterade protokollet, som är mycket lik i sammansättning och egenskaper till PTFE, gör beredning av LM mycket lättare. Detta pulver är mjukare än PTFE och vad som är särskilt viktigt, det är transparent. Detta förenklar i sin tur arbetet under bildframställning av strukturer som odlas med dess användning. Den lätthet att bilda LM med hjälp av FEP är en bestämd fördel med denna metod.
Det mest kritiska steget i mognadsprotokollet som beskrivs i detta dokument är att plocka upp och överföra bildade LM i 60 mm IVF Petri-skålen med hjälp av en pipett spets (steg 3.3. och 3.4.). Dessa steg kräver betydande manuell skicklighet och precision för att undvika förstörelse av LM.
Möjligen, den viktigaste begränsningen av 3D oocyte maturation induktion protokollen presenteras här är den relativt stora svårigheten att få korrekt forskningsmaterial som samlats in från djur som inte behandlats med antibiotika, anabola steroider (dvs., nadrolone, boldenon) eller melengestrol acetat som främjar deras snabba tillväxt. Dessa steroider, trots deras användning förbjuds i Europa, är fortfarande allmänt utnyttjas i den industriella boskapsuppfödning under de två sista månaderna av gödningsperioden, som orsakar, bland annat, störd sexuell mognad.
Sammanfattningsvis, både 3D-system som presenteras här upprätthålla den optimala gasformiga in vitro-kulturen miljö. De upprätthåller också COCs 3D-organisation genom att förhindra deras tillplattande och därav följande störningar av gap korsningar, vilket bevarar funktionella förhållandet mellan äggcell, och omgivande follikulära celler, vad som är avgörande för korrekt äggcellsmognad. Således är båda modellerna ett värdefullt verktyg för grundforskning inom reproduktionsbiologi och kan också ha klinisk relevans, vilket leder till förbättrad infertilitetsbehandling. Dessutom kan de också tillämpas för att utveckla nya bioteknikmetoder, liksom för boskap förbättring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är mycket tacksamma för att: dr Waclaw Tworzydlo (Institutionen för utvecklingsbiologi och ryggradslös morfologi, Institutet för zoologi och biomedicinsk forskning, Jagiellonian University) för tekniska anläggningar i TEM; till Ms. Beata Snakowska (Institutionen för endokrinologi, Institutet för zoologi och biomedicinsk forskning, Jagiellonian University) för tekniskt bistånd; till institutionen för cellbiologi och bildbehandling, Institutet för zoologi och biomedicinsk forskning, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japan). Detta arbete stöddes av bidrag 2018/29/N/NZ9/00983 från National Science Centre Poland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
References
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L.
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T.
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D.
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).
