Summary
Presentert her er to protokoller for innkapsling av svinoocytter i 3D kulturforhold. I den første, cumulus-oocyte komplekser (COCs) er innkapslet i fibrin-alginat perler. I den andre er de omsluttet av fluorerte etylenpropylenpulverpartikler (mikrobioreaktorer). Begge systemene sikrer optimale forhold for å opprettholde sin 3D-organisasjon.
Abstract
I reproduktiv biologi førte bioteknologirevolusjonen som begynte med kunstig inseminasjon og embryooverføringsteknologi til utvikling av assisterte reproduksjonsteknikker som oocyte in vitro modning (IVM), in vitro befruktning (IVF) og kloning av husdyr ved kjernefysisk overføring fra somatisk celle. IVM er metoden spesielt av betydning. Det er plattformteknologien for levering av modne, god kvalitet oocytes for applikasjoner som reduksjon av generasjonsintervallet i kommersielt viktige eller truede arter, forskning om in vitro menneskelig reproduksjon, og produksjon av transgene dyr for celleterapi. Begrepet oocyte kvalitet inkluderer sin kompetanse til å fullføre modning, befruktes, og dermed resulterer i sunne avkom. Dette betyr at oocytes av god kvalitet er avgjørende for vellykket befruktning inkludert IVF prosedyrer. Dette utgjør mange vanskeligheter med å utvikle en pålitelig kulturmetode som ville støtte vekst ikke bare av menneskelige oocytter, men også av andre store pattedyrarter. Det første trinnet i IVM er in vitro kulturen av oocytes. Dette arbeidet beskriver to protokoller for 3D-kulturen av svinoocytter. I den første, 3D-modellen cumulus-oocyte komplekser (COCs) er innkapslet i en fibrin-alginat perle interpenetrating nettverk, der en blanding av fibrin og alginat er gelled samtidig. I den andre er COCer suspendert i en dråpe medium og innkapslet med fluorisert etylenpropylen (FEP; en komolymer av hexafluoropropylen og tetrafluoroethylene) pulverpartikler for å danne mikrobioreaktorer definert som flytende klinkekuler (LM). Begge 3D-systemene opprettholder det gassøse in vitro kulturmiljøet. De opprettholder også COCs 3D-organisasjon ved å forhindre deres flating og påfølgende forstyrrelse av gapkryss, og dermed bevare det funksjonelle forholdet mellom oocyte og omkringliggende follikulære celler.
Introduction
Utviklingen av ulike kultursystemer, inkludert tredimensjonale (3D), har som mål å gi optimale forhold for vekst og modning av oocytter isolert fra folliklene selv i de tidligste utviklingsstadiene. Dette er av stor betydning for assisterte reproduktive teknikker (ART), spesielt i lys av det økende antall kvinner som sliter med ufruktbarhet etter kreftbehandling1. Modning av oocytter i in vitro-forhold (IVM) er allerede en veletablert teknikk som hovedsakelig brukes til in vitro embryogenerering med det formål å reproduksjonav husdyr 2. Men i de fleste pattedyrarter, selv om høye forekomster av modning av cumulus-oocyte komplekser (COCer) kan oppnås (område 60 til 90 %)3, er deres utviklingskompetanse fortsatt utilstrekkelig til behovene. Dette skyldes at utviklingen av zygotene oppnådd på en slik måte, selv opp til blastocyststadiet er lav, og etter overføring til surrogatdyr reduseres deres levedyktighet til sikt. Derfor er det behov for å øke utviklingskompetansen til embryoer hentet fra oocytter som ble utsatt for IVM-prosedyren4. Derfor blir nyemodningsmedier 5 utviklet og ulike perioder med in vitrokultur testes6,7 sammen med tilskudd av kulturmedier med ulike vekstfaktorerog molekyler 8,9.
Det første trinnet i et komplett IVM-system er å skape optimale forhold for bærekraftig vekst av oocytter under in vitro-kulturen. Oocyte veksten er en av de spesifikke indikatorene på oocyte evne til å gjenoppta meiosis10,11. I tillegg må et passende oocyte in vitro kultursystem være i stand til å støtte sin kjernefysiske modning og cytoplasmatisk differensiering12. Morfologien til cumulus-oocyte-komplekset er en annen viktig indikator som brukes i ART-klinikker for å velge den beste oocytten for påfølgende trinn av in vitro befruktning (IVF) prosedyre hos mennesker og husdyr12,13. Blant morfologiske egenskaper av COCs vurdert er: oocyte diameter, dens cytoplasma granulering og den første polare kroppen integritet14,15. Dessuten er oocyte utviklingspotensialet korrelert med utseendet og komprimeringen av cumulus celler og antall lag rundt oocyte. Svært viktig for riktig oocyte in vitro kultursystem er også vedlikehold av oocyte-cumulus celler riktig interaksjoner og cytoskeleton stabilitet16,,17,,18,19. Så langt har in vitro oocyte vekst innen menneskelige COCer blitt demonstrert20. Bruken av ku-COCer resulterte også med levendefødte. Disse ble isolert fra umodne eggstokksekkene og deretter dyrket i 14 dager til oocytten var tilstrekkelig stor til å gjennomgå IVF-prosedyren21. På samme måte ga COCer isolert fra bavian antral follikler, utsatt for IVM etter in vitro kultur oocytes i stand til å reinitiere meiose til metaphase II-scenen med en normal vises spindelstruktur22. Men i denne studien prøvde forfatterne ikke å befrukte dem. Likevel indikerer slike resultater at en lignende prosedyre kan brukes ikke bare på disse spesielle pattedyrarter, men også til menneskelige cumulus-oocyte komplekser hentet fra follikler hva som bør tillate å få oocytes av god kvalitet egnet for en vellykket IVF teknikk.
De ovenfor beskrevne resultatene ble oppnådd ved bruk av konvensjonelle IVM-protokoller der oocytter ble dyrket i todimensjonale (2D) systemer. Rutineprosedyren i 2D kultursystemer dekker oocytes, nedsenket i en dråpe av en passende kultur media, med mineralolje23,24. Det antas at et oljeoverlegg under in vitro oocyte kultur tjener til å forhindre flytende fordampning, og dermed sikre vedlikehold av riktig pH og osmotisk trykk i kulturen. Selv om et slikt 2D-kultursystem gjør det mulig å oppnå, selv opptil 87% av modne grisoocytes25,har det blitt bevist at mineraloljeoverlegget forårsaker betydelig diffusjon av lipidløselige materialer som er nødvendige for riktig oocytes utvikling26. I tillegg, på grunn av steroider (progesteron og østrogener) diffusjon i mineralolje under oocyte kultur, en forsinkelse av kjernefysisk modning og reduksjon i utviklingskompetanse oppnåelse av gris oocytes ble observert. Dette kan føre til å oppnå et lite antall zygotes, som i tillegg er preget av lav utviklingskapasitet til stadium av blastocyst og ved dårlig levedyktighet etter overføring til mottaker dyr27. Derfor gjøres det forsøk på å øke utviklingskompetansen til embryoer avledet fra oocytter mottatt etter IVM-prosedyren, ved å skape optimale forhold for å oppnå både cytoplasmatisk og kjernefysisk modenhet av oocytes dyrket sammen med CCer som komplekser, spesielt ved hjelp av tredimensjonale (3D) systemer. Ulike innovative 3D in vitro kultursystemer har blitt utviklet i de siste totiårene 28,29. Disse ble designet for å opprettholde den naturlige romlige organiseringen av celler og for å unngå deres utflating i kulturretter hva som ikke kan oppnås i de tradisjonelle 2D-kulturene. Den strukturelle og funksjonelle aktiviteten til kultiverte COCer kan sikres ved vedlikehold av riktig arkitektur og uforstyrret kommunikasjon gjennom gap-veikryss mellom ulike rom30. Egnetheten av bio-stillas for 3D in vitro kultur av cumulus-oocyte komplekser har blitt evaluert ved hjelp av naturlige biomaterialer som ulike komponenter i den ekstra cellulære matrisen (ECM; kollagen og hyaluronsyre)31 eller inert polymerer (alginat)32. Disse forsøkene testet i flere arter ga lovende resultater i form av oocyte meiosis gjenopptakelse og oppnåelse av sin fulle kompetanse33,34,35. Men så langt er det utviklet ikke noe 3D-system egnet for COCer-modning isolert fra store husdyr, inkludert griser.
Dette arbeidet beskriver to protokoller som kan brukes til 3D-kulturen av svine-COCer. Den første protokollen beskriver innkapsling i fibrin-alginate perler (FAB). FAB kan dannes ved samtidig blanding av en alginat og fibrin løsning, som gjennomgår en synkron gelasjonsprosess. Denne kombinasjonen gir et dynamisk mekanisk miljø fordi begge komponentene bidrar til matrisestivhet. En lignende løsning har tidligere blitt brukt for mus ovarian follicle kultur og modning36. I tilfelle av den presenterte protokollen, for å unngå for tidlig nedbrytning av alginat-fibrin-nettverket, brukes passende høyere konsentrasjoner av kalsiumkloridoppløsning, noe som sikrer en rask og stabil gelasjonsprosess. Det dynamiske mekaniske miljøet skaper forhold som ligner på disse i det naturlige intra-follikulære miljøet der COCer bor og øker i størrelse. I tillegg viser arbeidet representative resultater av COCs 3D-kultursystemer, der disse er suspendert i en dråpe medium og innkapslet med fluorisert etylenpropylen (FEP; en copolymer av hexafluoropropylen og tetrafluoroetylen) pulverpartikler, for å danne mikrobioreaktorer (Flytende klinkekuler, LM). LM er en form for 3D bioreaktor som tidligere har vist seg å støtte blant annet vekst av levende mikroorganismer37, tumorsfæroider38 og embryonale stamceller39. LMs har også blitt brukt for sau oocyte kultur40. I de fleste eksperimenter ved hjelp av LMs ble bioreaktorer tilberedt ved hjelp av polytetrafluoretylen (PTFE) pulverseng med partikkelstørrelse på 1 μm41. Den presenterte protokollen bruker FEP, som er svært lik i sammensetning og egenskaper til fluoropolymer ptfe. Men FEP er lettere formbar og mykere enn PTFE og det som er spesielt viktig, det er svært gjennomsiktig.
Begge 3D-systemene opprettholder det gassøse in vitro kulturmiljøet. De opprettholder også COCs 3D-organisasjon ved å forhindre deres flating og påfølgende forstyrrelse av gapkryss, og bevarer deres funksjonelle forhold mellom oocyte og omkringliggende follikulære celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende prosedyrer ble godkjent av dyrevelferdskomiteen ved Institutt for zoologi og biomedisinsk forskning ved Jagiellonian University.
1. Isolering av svin cumulus-oocyte komplekser
- For å samle materiale for isolering av eggstokkfollikler, forbruker svineovaries fra prepubertal gilts (ca 6-7 måneders alder, veier 70 til 80 kg) på et lokalt slakteri. Velg ca 20 gris eggstokkene fra 10 dyr for COCs isolasjon i hvert eksperiment.
MERK: Forutsatt at hver eggstokk gir 3–5 follikler, varierer det totale antallet follikler fra 60 til 100. - Plasser eggstokkene i en termos med steril fosfatbufret saltvann (PBS; pH 7,4; 38 °C) som inneholder 1 % AAS. Sørg for at det eksperimentelle materialet transporteres til laboratoriet innen 1 time hvor det skylles to ganger med steril PBS som inneholder antibiotika.
- Etter skylling eggstokkene, overføre dem til begeret fylt med HM medium og lagre i en inkubator ved 38 ° C for tidspunktet for alle manipulasjoner.
MERK: For optimale resultater under oocytehåndtering, utføre alle prosedyrer i DMEM / F12 medium (håndtering medium, HM) med tillegg av 2,5% antibiotika / antimykotisk løsning (AAS) og 10% fosterbovin serum (FBS) og kontrollere pH på CO2 nivå i miljøet, på et varmebord med temperaturkontroll (38 ° C) og under laminær strømningshette for å minimere bakteriell forurensning. - Fra store svinesekkene (6-8 mm i diameter) samler follikulær væske (FF) ved aspirasjon og sentrifugering ved 100 x g i 10 min ved romtemperatur. Deretter filtrerer du supernatanten ved hjelp av steril sprøyte festet til 0,2 μm membran porefiltre og snap fryse ved -80 ° C.
MERK: Bruk en insulinsprøyte (u- 40) til aspirasjon av follikulær væske. - Sørg for at bare sunne, mellomstore follikler (4-6 mm i diameter) er valgt for COCs isolasjon42.
MERK: CoCer av klasse I, som har en intakt og rund oocyte med homogen ooplasma og flerlags (minst 3-4) kompakte cumulus anses egnet for ytterligere 3D IVM prosedyre43. - For å isolere COCer, overfør 2-3 eggstokkene til en steril 10 cm diameter Petriskål fylt med HM. Isolere COCer fra mellomstore follikler ved å følge en av prosedyrene nedenfor.
- Skjær forsiktig overflaten av de utstående eggstokksekkene med et sterilt kirurgisk blad 15C. Dette vil føre til follikulær væske sammen med COCer å strømme ut i petriskålen.
- Aspirer follikulært innhold ved hjelp av 28 G kanyle med en størrelse på 5/8" festet til en engangssprøyte og overfør det til petriskålen.
MERK: Kast restene av eggstokkvev. Etterfølgende stadier av isolasjon utføres under et stereomikroskop.
- Forbered 3–5 60 mm IVF Petri-retter.
- Tilsett 1 ml HM til de sentrale brønnene og plasser en 3-4 dråper HM (50 μL per dråpe) i sine ytre ringer.
- Deretter, ved hjelp av en polykarbonatmikropipette, flytt de uskadede COCene til dråper HM i de ytre ringene for å skylle dem kort i 3-4 ganger.
- På slutten, individuelt overføre dem til den sentrale brønnen. Oppbevar disse IVF-platene i en inkubator for ytterligere prosedyrer.
- Når COCer er samlet inn, utfører du det endelige utvalgstrinnet ved å tilordne dem tilfeldig i to forskjellige IVM-innkapslingsprotokoller som er oppført nedenfor.
2. Innkapsling i fibrin-alginat hydrogel perler
- Forbered 1 ml 50 IE/ml trombin i Tris-bufret saltvann (TBS; pH 7,4) med 100 mM CaCl2 i et 2,0 ml sterilt mikrocentrifugrør.
- Klargjør fibrinogen lagerløsning (50 mg/ml i TBS) og hold den frosset.
MERK: For å unngå klumping ved oppløsning av fibrinogen i TBS, varm TBS til 37 °C.- På prosedyrens dag tiner den sakte på is og rett før bruk bringes til romtemperatur.
- Like før bruk mix på en 1:1 ratio 0,5% alginatløsning og 50 mg / ml fibrinogen løsning for å få endelig 2 ml (FA). I et sterilt mikrocentrifugerør virvler blandingen forsiktig. Unngå å lage bobler.
- For å forberede "inkubasjonskamre", bruk tynne strimler av parafinfilmer på glassmikroskopskliene.
MERK: Tørk av lysbildene med 70 % EtOH før bruk. Ett inkubasjonskammer dannes med to lysbilder. For å skille dem, plasser 3 mm avstandssyr på en av dem. - Pipette 7,5 μL dråper av FA-blandingen på denne parafinfilmbelagte glasslysbildet, som også har skille avstandsslysere. På ett lysbilde sted 8-10 dråper, arrangert i to rader.
- Overfør, ved hjelp av en mikropipette, 3-5 COCer sammen med et minimumsvolum (opptil 5 μL) modningsmedium (MM), og plasser dem nøyaktig i midten av FA-fallet. Denne prosedyren krever gode manuelle ferdigheter og presisjon.
MERK: Modningsmediet (MM) består av DMEM/F12, supplert med 10 IE/ml PMSG, 10 IE/ml hCG, 10 % FBS og 50 % svinefokkvæske (FF) samlet inn i trinn 1,4. - Tilsett 7,5 μL trombin /Ca2+ oppløsning på hver FA-dråpe, bare for å dekke dem. Det er ikke nødvendig å blande dem fordi gelen dannes nesten øyeblikkelig.
- Dekk inkubasjonskammeret ved å påføre den andre, tidligere forberedt glasssklie til FA-kapslene. Med en veldig forsiktig, men fast bevegelse, snu kammeret opp ned og legg det i en 100 mm petriskål foret med fuktig filterpapir for å unngå tørking.
- Deretter overfører du petriskålen til 5% CO2 inkubator (38 °C) i ca. 5-7 min. Etter dette vil FA-kapsler bli overskyet på grunn av samtidig gelering av fibrin og alginat.
- Overfør FA-kapsler til 96 brønnplater (én kapsel per brønn) som inneholder 100 μL MM per brønn.
MERK: For ikke å skade de dannede FA-kapslene, utfør dette trinnet nøye ved bruk av kirurgiske tang. - Hver 2. Bilde-COCer ved hjelp av et invertert lysmikroskop (ved 10x forstørrelse).
MERK: Kulturforhold for COCs FA kultur: 38 °C, under en 5% CO2 atmosfære og relativ fuktighet 95%. Etter 4 dager med IVM virker hydrogelene nesten klare på grunn av progressiv nedbrytning av fibrinkomponenten. Den gjenværende alginaten bør degraderes enzymatisk - ved alginat-lyase, et planteavledet enzym som spesifikt forringer alginat og påvirker ikke dyreceller.- Fjern MM fra brønner som inneholder kapslene og tilsett 100 μL 10 IE/ml alginatlyase i DMEM. La kulturplaten stå i inkubatoren i 25-30 min.
- Fjern COC-er fra de oppløste kapslene.
MERK: Dette kan gjøres med en kuttpipettespiss. - Etter flere vasker i en frisk DMEM, overføre COCer til den indre ringen av en IVF parabolen (5-10 COCs per tallerken) som inneholder PBS. Nå, bruk dem for videre morfologiske eller biokjemiske analyse.
3. Innkapsling i superhydrofobe fluorerte etylenpropylen (FEP) mikrobioreaktorer.
MERK: Kontroller at alle IVM-prosedyrer utføres på termostatstyrt tabell og at COC-er opprettholdes ved 38 °C gjennom hele håndteringen.
- Forbered en 30 mm petriskål som inneholder 5 g FEP pulver seng gjennomsnittlig partikkelstørrelse på 1 μm.
MERK: Det er viktig å bruke ferskt FEP-pulver. Den gjenbrukede FEP har en tendens til å aggregere og danner klumper. - Fordel en enkelt dråpe MM (~ 30 μL i volum) som inneholder 3-5 COCer isolert i trinn 1,6 på sengen av FEP pulveret. Roter platen forsiktig i en sirkulær bevegelse for å være sikker på at disse partiklene helt dekket overflaten av væskedråpen og flytende klinkekuler dannet (LM).
- Plukk opp dannet LM ved hjelp av en pipette med 1000 μL tupp.
MERK: Kapp pipettespissen på kanten for å få plass til diameteren på LM (4-5 mm). Den omtrentlige diameteren til en slik forberedt spiss bør være litt større enn for LM. - Forbered flere 60 mm IVF Petri retter. Tilsett 3-4 ml sterilt vann til de ytre ringene for å forberede fuktighetskammeret. Deretter plasserer du en LM i den sentrale brønnen.
MERK: Denne prosedyren krever gode manuelle ferdigheter og presisjon - hvis marmoren er plassert uforsiktig eller faller selv fra en lav høyde vil den bli ødelagt. - Inkuber klinkekuler i 4 dager ved 38 °C i 5 % CO2 inkubator.
- Endre mediet daglig etter prosedyren: bruk 30 μL MM på hver LM, noe som vil føre til spredning fordi direkte væskekontakt forstyrrer hydrofobiiteten til de belagte FEP-pulverene. Når marmorinnholdet oppløses, overfører du COCer som frigjøres fra bioreaktoren til en dråpe frisk MM i petriskålen.
MERK: For å overføre utgitte COCer nøyaktig, bruk en mikropipette med polykarbonat. - Etter flere vasker i MM (3-4 ganger) for å fjerne FEP-partikler, overfør dem med 30 μL frisk MM på FEP pulverseng. Roter platen forsiktig i en sirkulær bevegelse for å sikre at pulverpartiklene helt dekket overflaten av væskedråpen og danner en ny LM.
- Følg deretter fremgangsmåten fra trinn 3.3-3.4.
MERK: Det gjennomsiktige belegget av FEP-pulver gjør det mulig å overvåke LM-innhold ved hjelp av lett mikroskop.
- Endre mediet daglig etter prosedyren: bruk 30 μL MM på hver LM, noe som vil føre til spredning fordi direkte væskekontakt forstyrrer hydrofobiiteten til de belagte FEP-pulverene. Når marmorinnholdet oppløses, overfører du COCer som frigjøres fra bioreaktoren til en dråpe frisk MM i petriskålen.
4. Karakterisering av COCer etter 96-h IVM-prosedyre ved hjelp av to 3D-systemer
MERK: For å fastslå effektiviteten til IVM-systemene som brukes, skårer COCer morfologisk under et lett mikroskop. I tillegg bruker du dobbel fluorescerende merking med calcein AM og ethidium homodimer (EthD-1) fargestoffer for analyse av COCs levedyktighet44.
- Morfologisk undersøkelse av oocytter etter IVM ved lys- og fluorescensmikroskopi.
- Vask COCer (både de avledet fra kultur ved hjelp av FAB og de fra LM) med 38 ° C 1x PBS.
MERK: For å lette håndteringen av COCer og ikke skade dem under fargingsprosedyren, bruk en 96 eller 48 brønnplate og utfør hvert fargetrinn ved å overføre COCene til etterfølgende brønner. - Inkuber dem i 100 μL på 1,6 mM calcein AM og 5,5 mM EthD-1 i 30–45 min ved 37 °C. Fortynn begge stoffene i 1x PBS.
MERK: Fordi dette er en tofargers fluorescensanalyse, utfør dette trinnet i mørket. - Etter inkubasjon vasker du COC to ganger i PBS og senker det deretter ned i et antifademonteringsmedium designet for å forhindre rask fotografering av fluorescerende proteiner og fluorescerende fargestoffer (Materialsekk).
MERK: Beskytt kantene på dekkglasset mot tørking med neglelakk. - Visualiser fargede prøver under et konfokal laserskanningsmikroskop.
MERK: For å opphisse fluorescensen til begge sondene (det vil si kalcein og ethidium homodimer-1, EthD-1) tune en argon laser til 488nm. Den avgitte fluorescensen er atskilt med et trippeldiktrofisk filter 488/561/633 og deretter målt ved 505-570 nm for den grønne (kalcein), og ved 630-750 nm for den røde (EthD-1). - Klassifisere COCer i fire kategorier, ved hjelp av modifisert klassifisering som brukes på eggstokkfollikler i kultur basert på konfokal fluorescensavbildning avhengig av prosentandelen av døde granulosaceller35. V1: CoCer med estimerte 100% levedyktige CCer; V2: COCer med 10% av døde CCer; V3: CoCer med 10–50 % av døde CCer; V4: COCer med 50% av døde CCer.
MERK: Teknisk sett er det vanskelig å vurdere levedyktigheten til oocytten med den levende-døde analysen; Derfor bør det anslås f.eks ved å analysere mitokondrie ultrastruktur eller aktivitet.
- Vask COCer (både de avledet fra kultur ved hjelp av FAB og de fra LM) med 38 ° C 1x PBS.
- Undersøkelse av oocytes ultrastruktur etter IVM ved overføring elektron mikroskopi.
- Løs COCer i 100 μL 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkacodylatbuffer (pH 7,2, romtemperatur) i 2 timer.
- Senk COC-ene ned i 100 μL 0,1 M natriumkacodylatbuffer (over natten ved 4 °C) og skyll i samme buffer.
- Postfix COCer med 1% osmium tetroxide i 0,1 M natriumkacodylatbuffer (romtemperatur) i 1 time.
- Etter farging i uranylacetat (1 %), dehydrere COCer i en økende serie av etanol fortynninger (50%, 60%, 70%, 90% og 100%), infiltrere dem over natten ved romtemperatur, etterfulgt av to korte endringer av harpiks og til slutt, bygge dem i LR White.
- Deretter orienterer og evaluerer du prøver, flekker halvtynne seksjoner (1 μm) med metylenblå/asurblå II.
- Til slutt, undersøke ultratynne, dobbeltbeisede seksjoner på ultrastrukturelt nivå med TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I COCer ved hjelp av begge IVM-systemene holdt granulosacellene seg tett til hverandre, og de fleste av de gjenopprettede COCene hadde intakte lag med cumulusceller (figur 1A, B). I tillegg ble en betydelig andel av cumulus-cellene beholdt.
Resultatene fra COCs levedyktighetsanalyse bekreftet at begge systemene søkte om innkapsling av svinoocytter i 3D in vitro-forhold sikret optimale vekstforhold (figur 2). I begge gruppene ble det bare observert oocytter med høy levedyktighet, V1 = 13 %, V2 = 87 % for FAB og 10 % V1 og 90 % V2 for LM (tabell 1).
Mitokondrier, observert ved overføring elektronmikroskopi (TEM), ble jevnt fordelt i oocytter, deres form etter IVM var shell-lignende45. Bare noen få av dem ble langstrakte, dessuten ble deres klynger sporadisk observert (figur 1C, D). Endoplasmatisk reticulum ble observert, enten forbundet med mitokondrier eller fri i oocytt cytoplasma. Lipiddråper dukket opp som små mørke runde strukturer og Golgi apparater ble dukket opp med dilatert sisterne (Figur 1C, D).
| V1 Leilighet | V2 Leilighet | V3 Leilighet | V4 Leilighet | ||||
| % | Nummer | % | Nummer | % | Nummer | % | |
| Fab | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm (andre) | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| Antall cocer totalt: 144 | 16a | 128b.128.128 kl. | 0 | 0 | |||
Tabell 1. Resultater på levedyktigheten til COCer etter innkapsling ved hjelp av fibrin-alginerte perler (FAB) og mikrobioreaktorer FEP, flytende klinkekuler (LM). Resultatene ble gitt som gjennomsnitt. Verdier med hevet skrift (a, b) var statistisk signifikant (p <0,05).
Figur 1: Representative bilder som viser morfologi og ultrastruktur av COCer etter en 96-time innkapsling. (A) morfologi av COCer inne FAB - lys mikroskopi; (B)morfologi av COCer inne LM - lys mikroskopi; C: oocyte ultrastructure (TEM) etter in vitro kultur inne FAB; D: oocyte ultrastructure (TEM) etter in vitro kultur inne LM. O: oocyte; CCer: cumulus celler; ZP: zona pellucida; N: kjerne; M: mitokondrier; G: Golgi apparat; ER: endoplasmaisk retikuulum; Lp: lipid dråpe; FA: alginat og fibrin filamenter; FEP: pulver av copolymer av hexafluoropropylen og tetrafluoroetylen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative fluorescerende bilder av COCer etter 96 timer innkapsling. (A, B) Bildene som er oppnådd for de samme COCene etter in vitro-kulturen ved hjelp av FAB med to filtre for å visualisere grønn fluorescens eller rød fluorescens for henholdsvis levende eller døde celler og (C) fusjonere av begge. (D, E) Bildene som er oppnådd for de samme COCene etter in vitro-kulturen ved hjelp av LM med to filtre for å visualisere grønn fluorescens eller rød fluorescens for henholdsvis levende eller døde celler, og (F) fusjonere av dem. Vektstenger = 50 μm. Hvite stjerner indikerer celler som gjennomgår apoptose. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til å opprettholde in vitro vekst ikke bare av oocyte, men også av cumulus celler rundt den og samtidig støtte modning er svært viktig for vellykket assistert reproduktive teknologier og for å fremme forståelsen av somatiske celle / oocyte interaksjoner spesielt i arter som gjennomgår langvarig follikulær vekst som mennesker eller griser. Kontinuerlig forbedrede IVM teknikker blir nyttig verktøy for å bevare reproduktive alternativer i tilfeller av polycystisk ovariesyndrom (PCOS), for tidlig ovariesvikt, eller definitiv infertilitet (onkoterapi). I tillegg, siden visse ovarial dysfunksjoner kan være forårsaket av dysregulert follikulær vekst, forstå molekylære og cellulære mekanismer som styrer riktig utvikling av oocyte kan gi viktig innsikt i patofysiologi og rasjonell behandling av disse forholdene. In vitro kultursystemer som ville støtte vedlikehold av COCs 3D-arkitektur under IVM, krever et trinn av innkapsling i en matrise eller inne i en bioreaktor. Dette arbeidet beskriver en protokoll som kan brukes for kulturen av svin oocytes. Begge 3D in vitro kultursystemer presentert her for å indusere vekst og utvikling av svin COCer er brukervennlige og gir effektiv kontroll av både oocyte og cumulus celler overlevelse.
Den første in vitro kultur metoden for COCs ved hjelp av deres innkapsling i fibrin-alginat hydrogel perler (FAB) presentert her gir en 3D oocyte vekst i en aktivt celle-responsive matrise miljø. Tidligere publiserte protokoller basert på alginathydrogeler ble vanligvis brukt til undersøkelse av utviklingen av eggstokkfollikler isolert fra mange dyrearter med svært lovende resultater32. Interessant, uavhengig av den endelige sammensetningen av alginathydrogel32 eller innkapslingsmetodenselv 46, viste disse studiene at alginat perlebaserte 3D-kultursystemer var i stand til å støtte follikulær vekst og deres overlevelse.
Alginathydrogeler var skånsomme mot folliklene, og påvirket ikke deres videre overlevelse eller utvikling in vitro. På samme måte er in vitro kulturprotokollen til COCer beskrevet for første gang her, egnet til å generere grisoocytter av god kvalitet, som det ble dokumentert på både morfologiske og ultrastrukturelle nivåer. Tilstedeværelsen av fibrinogen i en alginatløsning og deres samtidige gelling, resulterer i dannelsen av et interpenetraterende nettverk som skaper og stabiliserer det tredimensjonale miljøet ytterligere. På grunn av den spesifikke strukturelle støtten inne i en slik matrise, cell-til-celle kontakter og paracrine kommunikasjon mellom oocytes og cumulus celler opprettholdes på samme måte som disse nåværende in vivo.
De to mest kritiske trinnene i modningsprotokollen som er beskrevet i dette dokumentet er overføring av FA-kapsler fra inkubasjonskamre til 96-brønnplater som inneholder MM (trinn 2.10.) og fjerning av COCer fra oppløste kapsler etter enzymatisk nedbrytning av gjenværende alginat, ved hjelp av alginatlyase (trinn 2.11.). Begge trinnene krever betydelig manuell dyktighet og presisjon for å unngå, i det første tilfellet ødeleggelsen av kapsler, i den andre - skade på COCer.
Hovedstyrken til denne metoden, i tillegg til å etablere optimale forhold for oocyte modning av et stort husdyr, er at under analyse ved hjelp av TEM, lett mikroskopi eller konfokal mikroskopi, er ingen kapselfjerning nødvendig. Alginat er ikke en barriere når avbildning. Å forlate COCer i kapsler letter manipulering under fargingsprosedyren.
Den andre COC in vitro kulturen presentert her er den med bruk av LM, som vanligvis er nonstick dråper dekket av mikroskalerte partikler og oppnås ved ganske enkelt å rulle små mengder væske i et veldig hydrofobt pulver47. Tidligere studier med bruk av LM for kultur, blant annet fibroblaster48, rødeblodlegemer 49, organoid av en svulst38,bukspyttkjertelceller 50 eller saueroocytes 36 har blitt utført ved hjelp av polytetrafluoretylen (PTFE) som hydrofob polymer for fremstilling av dråpene. PTFE er mye brukt i klinikken (f.eks. kardiovaskulære grafts).
I dette arbeidet presenterer vi for første gang en pålitelig metode for mikrobioreaktorer laget av FEP-partikler for in vitro-kulturen av svine-COCer. Bruken av FEP i den presenterte protokollen, som er svært lik i sammensetning og egenskaper til PTFE, gjør utarbeidelsen av LM mye enklere. Dette pulveret er mykere enn PTFE og det som er spesielt viktig, det er gjennomsiktig. Dette forenkler i sin tur arbeidet under avbildning av strukturer dyrket med bruk. Hvor enkelt det er å danne LM ved hjelp av FEP er en klar fordel med denne metoden.
Det mest kritiske trinnet i modningsprotokollen som er beskrevet i dette dokumentet, er å plukke opp og overføre dannet LM til 60 mm IVF petriskål ved hjelp av en pipettespiss (trinn 3.3. og 3.4.). Disse trinnene krever betydelig manuell dyktighet og presisjon for å unngå ødeleggelse av LM.
Muligens, den viktigste begrensningen av 3D oocyte modning induksjon protokoller presentert her er relativt store vanskeligheten med å skaffe riktig forskningsmateriale samlet inn fra dyr ikke behandlet med antibiotika, anabole steroider (det vil si nadrolone, boldenone) eller melengestrol acetat som fremmer deres raske vekst. Disse steroider, til tross for deres bruk blir forbudt i Europa, er fortsatt mye brukt i industriell husdyr avl i løpet av de siste to månedene av fetende perioden, som forårsaker blant annet forstyrret seksuell modning.
Til slutt opprettholder begge 3D-systemene som presenteres her, det optimale gassinnbredende kulturmiljøet. De opprettholder også COCs 3D-organisasjon ved å forhindre deres flating og påfølgende forstyrrelse av gapkryss, og dermed bevare det funksjonelle forholdet mellom oocyte, og omkringliggende follikulære celler, hva som er avgjørende for riktig oocyte modning. Dermed er begge modellene et verdifullt verktøy for grunnleggende forskning i reproduktiv biologi og kan også ha klinisk relevans, noe som fører til forbedret ufruktbarhet behandling. I tillegg kan de også brukes til å utvikle nye bioteknologimetoder, samt for husdyrforbedring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er veldig takknemlige for: dr Waclaw Tworzydlo (Institutt for utviklingsbiologi og virvelløse morfologi, Institutt for zoologi og biomedisinsk forskning, Jagiellonian University) for tekniske fasiliteter i TEM; til Ms. Beata Snakowska (Institutt for endokrinologi, Institutt for zoologi og biomedisinsk forskning, Jagiellonian University) for teknisk assistanse; til Institutt for cellebiologi og avbildning, Institutt for zoologi og biomedisinsk forskning, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japan). Dette arbeidet ble støttet av stipend 2018/29/N/NZ9/00983 fra National Science Centre Poland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
References
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).
