Summary

Fordøjelse af hele museøjne til multiparameterflow cytometrisk analyse af mononukleare fagocytter

Published: June 17, 2020
doi:

Summary

Denne protokol giver en metode til at fordøje hele øjne i en enkelt celle suspension med henblik på multi-parameter flow cytometrisk analyse med henblik på at identificere specifikke okulære mononukleare phagocytiske populationer, herunder monocytter, mikroglia, makrofager, og dendritiske celler.

Abstract

Det medfødte immunsystem spiller vigtige roller i okulær patofysiologi, herunder uveitis, diabetisk retinopati og aldersrelateret makuladegeneration. Medfødte immunceller, specielt mononukleare fagocytter, udtrykker overlappende celleoverflademarkører, hvilket gør det til en udfordring at identificere disse populationer. Multiparameterflowcytometry giver mulighed for samtidig, kvantitativ analyse af flere celleoverflademarkører for at differentiere monocytter, makrofager, mikroglia og dendritiske celler i museøjne. Denne protokol beskriver enucleation af hele museøjne, okulær dissektion, fordøjelse i en enkelt celle suspension, og farvning af en enkelt celle suspension for myeloid celle markører. Derudover forklarer vi de korrekte metoder til bestemmelse af spændinger ved hjælp af enkeltfarvekontroller og til afgrænselse af positive porte ved hjælp af fluorescens minus en kontrol. Den største begrænsning af multi-parameter flow cytometry er fraværet af vævsarkitektur. Denne begrænsning kan overvindes ved multi-parameter flow cytometry af individuelle okulære rum eller gratis immunofluorescens farvning. Immunfluorescens er imidlertid begrænset af manglende kvantitativ analyse og reduceret antal fluorophorer på de fleste mikroskoper. Vi beskriver brugen af multi-parametrisk flow cytometri til at give meget kvantitativ analyse af mononukleare fagocytter i laser-induceret choroidal neovascularization. Derudover kan multiparameterflowcytometry bruges til identifikation af makrofagundersæt, skæbnetilknytning og cellesortering til transskriptionomik eller proteomiske undersøgelser.

Introduction

Det medfødte immunsystem omfatter flere celletyper, der stimulerer komplementaktivering og inflammation. Medfødte immunceller omfatter naturlige dræberceller (NK), mastceller, basofiler, eosinofiler, neutrofiler og mononukleare fagocytter. Mononukleare fagocytter, som består af monocytter, makrofager og dendritiske celler, har været impliceret i patofysiologien af flere oftalmiske tilstande, herunder uveitis, diabetisk retinopati og aldersrelateret makuladegeneration (AMD)1. I denne protokol vil vi fokusere på identifikation af mononukleare fagocytter ved hjælp af multiparameterflow cytometrisk analyse i en musemodel af neovaskulær AMD2. Denne protokol kan tilpasses til musemodeller af diabetisk retinopati og / eller uveitis, men mere omfattende okulær dissektion anbefales på grund af disse sygdommes systemiske karakter.

Mononukleare fagocytter udtrykker overlappende celleoverflademarkører. Langvarige makrofager i væv og mikroglia stammer fra den erythromyeloide stamfader, der stammer fra æggeblommen3, mens genanvendelse af makrofager og dendritiske celler adskiller sig fra den knoglemarvsafledte makrofaglige cellegenitor4. Musecelleoverflademærker, der er fælles for monocytter, makrofager og dendritiske celler, omfatter CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17og den intracellulære markør Iba18. For at overvinde denne udfordring definerer transskriptionsanalyse af makrofager, monocytter og dendritiske celler fra flere væv CD64 som en makrofaglig celleoverflademarkør6. Makrofager er blevet beskrevet i iris, choroid, ciliary krop, og synsnerven i sunde øjne3. Alternativt er identifikation af dendritiske celler vanskeligere. den mest specifikke metode til identifikation af dendritiske celler kræver skæbnekortlægning ved hjælp af Zbtb46-GFP-reportermusen9. Uafhængigt af denne reporterlinje kan udtryk for CD11c og MHCII i forbindelse med fraværet af CD64 identificerepotentielledendritiske celler 6,10. Dendritiske celler er blevet identificeret i hornhinden, bindehinden, iris, og choroid i normale øjne11. Microglia er specialiserede makrofager placeret i nethinden, beskyttet af blod-nethinde barrieren, og stammer fra æggeblomme sæk stamceller12. Som følge heraf kan nethindemikroglia skelnes fra monocyt-afledte makrofager ved deres dimniveauer af CD45-udtryk13 og høje niveauer af Tmem119, som fås som et flowcytometriantistof antistof14. Ved microglia aktivering, dog CD45 kan up-reguleret15 og Tmem119 kan være ned-reguleret3, der viser kompleksiteten af microglia biologi, og dette er sandsynligvis relevant i både AMD og dens musemodel. Endelig kan monocytter opdeles i mindst to undertyper, herunder klassisk og ikke-klassisk. Klassiske monocytter viser CCR2+Ly6ChøjCX3CR1lavt udtryk, og ikke-klassiske monocytter demonstrere CCR2Ly6ClavCX3CR1høje markører5.

På grund af nødvendigheden af den kvantitative analyse af markørudtryk, dvs. Yderligere fordele omfatter identifikation af underpopulationer, evnen til at bruge fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) til at sortere cellepopulationer til transskriptionomic eller proteomic analyse og skæbnekortlægning. Den største ulempe ved multi-parameter flow cytometry er manglen på vævsarkitektur. Dette kan overvindes ved oftalmisk dissektion i de forskellige okulære subcompartments: hornhinde, bindehinde, iris, linse, nethinden, og choroid-sclera kompleks. Derudover kan bekræftende immunfluorescens imaging udføres, men er begrænset af antallet af markører og mangel på robust kvantantitation.

Genom brede forening undersøgelser har knyttet flere komplement gener med AMD16. Komplement aktivering fører til anafylakin produktion, leukocyt rekruttering, og deraf følgende inflammation. I komplementreceptor mangelfulde mus reducerer laserskade mononuklear phagocytrekruttering og laserinduceret choroidal neovascularisering (CNV) område17. Tilsvarende C-C motiv kemokin receptor 2 (CCR2) knockout mus, som er mangelfuld i monocyt rekruttering til vævet, viser både nedsat mononuklear phagocyt rekruttering og laser-induceret CNV område18. Disse data link supplement og mononukleare fagocytter med eksperimentelLE CNV og muligvis neovaskulær AMD. Til støtte for denne forening dysreguleres komplementreceptorer på perifere blodmon monocytter hos patienter med neovaskulær AMD19,20. Disse data viser en stærk sammenhæng mellem AMD og mononukleare fagocytter.

I dette manuskript vil vi bruge den eksperimentelle laserinducerede CNV-model til at karakterisere de mononukleare fagocytpopulationer i museøjet ved hjælp af multiparameterflowcytometri. Laser-induceret CNV er standardmus model af neovaskulær AMD, som viste effekten af den nuværende første linje neovaskulær AMD behandling21. Denne protokol vil beskrive enucleation af museøjne, okulær dissektion, fordøjelse i en enkelt celle suspension, antistof farvning, bestemmelse af laser spændinger ved hjælp af enkelt farve kontrol, og gating strategi ved hjælp af fluorescens minus en (FMO) kontrol. En detaljeret beskrivelse af den laserfremkaldte CNV-model findes i en tidligere publikation22. Ved hjælp af denne protokol definerer vi mikroglia, monocytter, dendritiske celler og makrofagpopulationer. Desuden vil vi bruge MHCII og CD11c til yderligere at definere makrofag delsæt inden for laser induceret CNV model.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee. C57BL/6 mus var gruppehus på en barriere facilitet på Center for Comparative Medicine på Northwestern University (Chicago, IL). Alle dyr blev opstaldet i 12/12 timers lys / mørk cyklus med fri adgang til mad og vand. 1. Indsamling af okulært væv Ofre 10-12 uger gamle C57BL/6J mus af begge køn ved hjælp af reguleret administration af kuldioxid, indtil musen ikke reagerer og ik…

Representative Results

Figur 1 viste ukompenserede frekvens histogrammer for SCC’er og celler til den røde laser: Alexa647, Alexa700 og APC-Cy7. I figur 1A, den magenta linje afbildet toppen af SCC for Alexa647, mens cyan linje viste den påtænkte 0,5 Log forskel. Bemærk, at toppen i Alexa700 og APC-Cy7 var til venstre (mindre lyse) af cyan linje. Bemærk også, at cellerne alle var til venstre for magentalinjen. Alle celler til højre for SCC-toppen blev ikke kompenseret. Specifik…

Discussion

Multiparameterflowcytometri giver mulighed for kvantitativ analyse af flere celletyper i et komplekst væv. I denne rapport beskriver vi flowcytometrisk detektion af mononukleare fagocytpopulationer, herunder monocytter, dendritiske celler og makrofager, efter laserskade i museøjet. Liyanage et al nylig rapporteret en lignende gating strategi til påvisning af neutrofiler, eosinofiler, lymfocytter, DC’er, makrofager, infiltrere makrofager, og monocytter27. Vores gating strategi primært adskiller…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JAL blev støttet af NIH tilskud K08EY030923; CMC blev støttet af et K01-tilskud (5K01AR060169) fra NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases og en Novel Research Grant (637405) fra Lupus Research Alliance.

Materials

0.6 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-120
1.7 ml microcentrifuge tubes Costar 3620
10 ml pipettes Fisher Scientific 431031
15 ml conicals ThermoFisher 339650
1x HBSS, 500 ml Gibco 14025-092
2.5 ml syringe Henke Sass Wolf 7886-1
20% paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15713-S
25 ml pipettes Fisher Scientific 431032
30 G needle Exel 26437
3ml luer lock syringe Fisher Scientific 14955457
41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish Fisher Scientific 08-732-112
50 ml conicals Falcon 352070
96-well, U-bottom assay plate without lid Falcon 353910
Amine reactive beads ThermoFisher A10628
Analysis software FlowJo v 10
Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set BD Biosciences 552845
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
Cell counter Invitrogen AMQAX1000
Cell counter slides Invitrogen C10283
Compensation beads ThermoFisher 01-1111-42
Count beads ThermoFisher 01-1234-42
Curved forceps Fisher Scientific 16-100-123
Digestion enzyme Sigma Aldrich 5401020001
Dissecting microscope National Optical and Scientific Instruments, Inc. DC3-420T
Dissociation tubes Miltenyi Biotec 130-096-334
DNase Roche 10104159001
Electronic dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
FACS Diva software BD Biosciences
Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142
Fine forceps Integra Miltex 17035X
Flow buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Flow cytometer BD Biosciences
Flow tubes Falcon 352008
Hamster anti-mouse CD11c BV421 BD Biosciences 562782
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-123
Live/Dead dye ThermoFisher 65-0866-14
Lysing solution, 10x solution BD Biosciences 555899
Micro titer tube and rack Fisher Scientific 02-681-380
Mouse anti-mouse CD64 PE BioLegend 139304
Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 BD Biosciences 562864
P1000 pipet tips Denville Scientific P2404
P1000 pipettor Gilson FA10006M
P2 pipet tips eppendorf 22491806
P2 pipettor Gilson FA10001M
P20 pipettor Gilson FA10003M
P200 pipet tips Denville Scientific P2401
P200 pipettor Gilson FA10005M
Pipet man Fisher Scientific FB14955202
Rat anti-mouse B220 PECF594 BD Biosciences 562313
Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 BD Biosciences 557657
Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 BD Biosciences 557958
Rat anti-mouse CD19 PE BD Biosciences 553786
Rat anti-mouse CD4 PECF594 BD Biosciences 562314
Rat anti-mouse CD45 FITC ThermoFisher 11-0451-82
Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 BD Biosciences 552848
Rat anti-mouse CD8 PECF594 BD Biosciences 562315
Rat anti-mouse Ly6C BD Biosciences 561085
Rat anti-mouse Ly6G PECF594 BD Biosciences 562700
Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 BioLegend 107622
Rat anti-mouse Siglec F PECF594 BD Biosciences 562757
Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 BD Biosciences 564178
Shaking incubator Labnet 311DS
Spring scissors Fine Science Tools 15024-10
Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh Fisher Scientific 22363547
Sterile water, 500 ml Gibco A12873-01
Swinging bucket centrifuge eppendorf 5910 R
Trypan blue, 0.4% solution Gibco 15250061

References

  1. Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
  2. Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
  3. O’Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
  4. Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
  5. Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
  6. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  7. Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
  8. Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
  9. Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
  10. Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
  11. Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
  12. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  13. O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
  14. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  15. Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
  16. McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
  17. Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
  18. Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
  19. Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
  20. Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
  21. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
  22. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
  23. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
  24. Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
  25. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
  26. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  27. Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
  28. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).

Play Video

Cite This Article
Droho, S., Cuda, C. M., Lavine, J. A. Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes. J. Vis. Exp. (160), e61348, doi:10.3791/61348 (2020).

View Video