Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/61348
Automatic Translation
1, *2, *1
1Department of Ophthalmology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Medicine, Division of Rheumatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה לעכל עיניים שלמות לתוך השעיית תא יחיד לצורך ניתוח ציטומטרי זרימה רב-פרמטרית על מנת לזהות אוכלוסיות פיגוציטיות מונונוקולריות עיניות ספציפיות, כולל מונוציטים, מיקרוגליה, מקרופאגים ותאים דנדריטיים.

Abstract

מערכת החיסון המולדת ממלאת תפקידים חשובים בפתופיזיולוגיה עינית כולל uveitis, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי הקשור לגיל. תאים חיסוניים מולדים, במיוחד פיגוציטים מונונוקולריים, מבטאים סמני פני תא חופפים, מה שהופך את זיהוי אוכלוסיות אלה לאתגר. ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים מאפשרת ניתוח בו-זמני כמותי של סמני משטח תאים מרובים על מנת להבדיל בין מונוציטים, מקרופאגים, מיקרוגליה ותאים דנדריטיים בעיני העכבר. פרוטוקול זה מתאר את ההסתעפות של עיני עכבר שלמות, ניתוח עיני, עיכול להשעיית תא יחיד וכתמים של השעיית התא הבודד עבור סמני תאים מיאלואידיים. בנוסף, אנו מסבירים את השיטות המתאימות לקביעת מתחים באמצעות פקדי צבע יחיד ולתיאור שערים חיוביים באמצעות פלואורסצנטיות מינוס פקד אחד. המגבלה העיקרית של ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים היא היעדר ארכיטקטורת רקמות. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי cytometry זרימה מרובת פרמטרים של תאי עיניים בודדים או כתמי כשל חיסוני חינם. עם זאת, כשל חיסוני מוגבל על ידי חוסר ניתוח כמותי שלה מספר מופחת של פלואורופורים על רוב המיקרוסקופים. אנו מתארים את השימוש בציטומטריית זרימה רב-פרמטרית כדי לספק ניתוח כמותי מאוד של פיגוציטים מונונוקולריים בניאווסקולריזציה כורואידית הנגרמת על ידי לייזר. בנוסף, ניתן להשתמש בציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים לזיהוי ערכות משנה של מקרופאגים, מיפוי גורל ומיון תאים עבור מחקרים תעתיקומיים או פרוטאומיים.

Introduction

מערכת החיסון המולדת כוללת סוגי תאים מרובים המעוררים הפעלה משלימה ודלקת. תאים חיסוניים מולדים כוללים תאי רוצח טבעי (NK), תאי פיטום, בזופילים, אאוזינופילים, נויטרופילים, ופגוציטים מונונוקלריים. פיגוציטים מונונוקלריים, המורכבים ממונוציטים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים, היו מעורבים בפתופיזיולוגיה של תנאים אופטלמולוגיים מרובים כולל uveitis, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD)1. בפרוטוקול זה, נתמקד בזיהוי של phagocytes מונונוקולרי באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה רב פרמטרים במודל העכבר של AMD neovascular2. פרוטוקול זה ניתן להתאמה למודלים של עכברים של רטינופתיה סוכרתית ו/או uveitis, אך ניתוח עיניים נרחב יותר מומלץ בגלל האופי המערכתי של מחלות אלה.

פגוציטים מונונוקולריים מבטאים סמני פני תא חופפים. מקרופאגים ומיקרוגליה של תושבי רקמות לאורך זמן מקורם באקרומניאלואיד שק החלמון3, בעוד מיחזור מקרופאגים ותאים דנדריטיים מבדילים מאבן התא הדנדריטית4שמקורה במח העצם . סמני פני השטח של תאי העכבר המשותפים למונוציטים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים כוללים את CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17, ואת הסמן התאי Iba18. על מנת להתגבר על אתגר זה, ניתוח תמלולומי של מקרופאגים, מונוציטים ותאים דנדריטיים מרקמות מרובות מגדיר את CD64 כסמן משטח תא ספציפי למאקרופג '6. מקרופאגים תוארו הקשתית, choroid, גוף ciliary, ועצב הראייה בעיניים בריאות3. לחלופין, זיהוי תאים דנדריטי קשה יותר; השיטה הספציפית ביותר לזיהוי תאים דנדריטיים דורשת מיפוי גורל באמצעות עכבר הכתב Zbtb46-GFP9. ללא תלות בשורת כתב זו, ביטוי של CD11c ו- MHCII בשילוב עם היעדר CD64 יכול לזהות תאים דנדריטיים פוטנציאליים6,10. תאים דנדריטיים זוהו בקרנית, הלחמית, הקשתית והכורוידים בעיניים רגילות11. Microglia הם מקרופאגים מיוחדים הממוקמים ברשתית, מוגנים על ידי מחסום רשתית הדם, ומופקים מתאי שק חלמון12. כתוצאה מכך, microglia הרשתית ניתן להבדיל מקרופאגים נגזר מונוציט על ידי רמות עמומות שלהם של ביטוי CD4513 ורמות גבוהות של Tmem119, אשר זמין כמו נוגדן cytometry זרימה14. עם זאת, עם הפעלת microglia, CD45 יכול להיות מוסדר עד15 ו Tmem119 עשוי להיות מוסדר למטה3, המדגים את המורכבות של ביולוגיה microglia וזה רלוונטי ככל הנראה הן AMD והן מודל העכבר שלה. לבסוף, ניתן לחלק מונוציטים לשני תת-סוגים לפחות, כולל קלאסי ולא קלאסי. מונוציטים קלאסיים מציגים CCR2+Ly6CגבוהCX3CR1 ביטוינמוך, מונוציטים שאינם קלאסיים להדגים CCR2-Ly6CנמוךCX3CR1 סמניםגבוהים 5.

בשל הצורך בניתוח כמותי של ביטוי סמן, כלומר, רמות גבוהות לעומת רמות נמוכות/עמומות, ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים היא השיטה האידיאלית לאפליה בין מונוציטים, מקרופאגים, מיקרוגליה ותאים דנדריטיים בעין וברקמות אחרות. יתרונות נוספים כוללים זיהוי אוכלוסיות משנה, היכולת להשתמש במיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי למיין אוכלוסיות תאים לצורך ניתוח תמלולומי או פרוטאומי ומיפוי גורל. החיסרון העיקרי של cytometry זרימה רב פרמטרים הוא חוסר ארכיטקטורת רקמות. זה יכול להיות להתגבר על ידי ניתוח עיניים לתוך subcompartments העין השונים: קרנית, הלחמית, איריס, עדשה, רשתית, קומפלקס choroid-sclera. בנוסף, הדמיית כשל חיסוני מאשר יכולה להתבצע, אך מוגבלת על ידי מספר הסמנים וחוסר כמות איתנה.

מחקרי עמותה רחבת גנום קישרו גנים משלימים מרובים עם AMD16. הפעלה משלימה מובילה לייצור אנפילטוקסין, גיוס לויקוציטים ודלקת כתוצאה מכך. בעכברים משלימים קולטן לקוי, פגיעה בלייזר מפחית גיוס phagocyte mononuclear ו neovascularization choroidal הנגרמת על ידי לייזר (CNV) אזור17. באופן דומה, קולטן כימוקין מוטיב C-C 2 (CCR2) עכבר נוקאאוט, אשר חסר בגיוס מונוציט לרקמה, מדגים הן ירידה בגיוס phagocyte מונונוקארי ואזור CNV המושרה בלייזר18. נתונים אלה קישור משלים phagocytes מונונוקולרי עם CNV ניסיוני ואולי AMD neovascular. לתמיכה של עמותה זו, קולטנים משלימים הם dysregulated על מונוציטים בדם היקפי בחולים עם AMD neovascular19,20. נתונים אלה מראים קשר חזק בין AMD לבין פיגוציטים מונונוקאריים.

בכתב יד זה, נשתמש במודל CNV המושרה בלייזר ניסיוני כדי לאפיין את אוכלוסיות הפגוציטים המונו-גרעיניות בעין העכבר באמצעות ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים. לייזר המושרה CNV הוא מודל העכבר הסטנדרטי של AMD neovascular, אשר הוכיח את היעילות של טיפול AMD ניאו-וסקולרי השורה הראשונה הנוכחי21. פרוטוקול זה יתאר התכווצות של עיני עכבר, ניתוח עיני, עיכול לתוך מתלה תא יחיד, כתמי נוגדנים, קביעת מתחי לייזר באמצעות פקדי צבע יחיד, ואסטרטגיית gating באמצעות פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) פקדים. לקבלת תיאור מפורט של דגם CNV המושרה בלייזר, עיין בפרסום הקודם22. באמצעות פרוטוקול זה, אנו נגדיר אוכלוסיות מיקרוגליה, מונוציטים, תאים דנדריטיים ומאקרופאג'. יתר על כן, נשתמש ב- MHCII וב- CD11c כדי להגדיר עוד יותר ערכות משנה של מקרופאגים במודל CNV המושרה בלייזר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן. עכברי C57BL/6 שוכנו במתקן מחסום במרכז לרפואה השוואתית באוניברסיטת נורת'ווסטרן (שיקגו, אילינוי). כל בעלי החיים שוכנו במחזור אור / כהה של 12/12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.

1. אוסף רקמת עיניים

  1. להקריב עכברי C57BL/6J בני 10-12 שבועות משני המינים באמצעות ניהול מוסדר של פחמן דו חמצני עד שהעכבר לא מגיב וכבר לא שואף. בצע נקע בצוואר הרחם או שיטה משנית מאושרת אחרת כדי להבטיח המתת חסד.
    הערה: ניתן לבצע זלוף טרנסקרדיאלי כדי להסיר לויקוציטים במחזור שאינם ברקמות העין. בניסוי זה, זלוף מערכתי אינו מפחית את מספר המיקרוגליה, המונוציטים, המקרופאגים או התאים הדנדריטיים שזוהו בעיניים שלמות שאינן מטופלות או שטופלו בלייזר. לכן, רוב סוגי התאים האלה ממוקמים ברקמות העיניים וצעד זה הוא אופציונלי.
  2. כדי להסב את העיניים, לדחוף למטה ליד ארובת העין תוך הצבת זוג מלקחיים מעוגלים בעדינות מתחת לעין כפי שהוא בולט מתוך השקע. מלקחיים קמצוץ סגור מתחת לעין מבלי ללחוץ את העין בפועל. לעקור את העין מן הלחמית שמסביב (ראה פרסום מוקדם)23.
  3. משוך את העין לרוחב עד עצב הראייה הוא הקשר היחיד שנותר כדי לנתק את העין. עצב הראייה לעתים קרובות מנתק עם מתח, אבל מספריים קטנים לפעמים יש צורך לחתוך את עצב הראייה. מניחים את העין בתמיסת מלח אגירה (HBSS) קרה של האנק עם סידן ומגנזיום בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל.

2. עיכול רקמת העין

  1. הכינו את מאגר העיכול המכיל אנזים עיכול של 0.1 מ"ג/מ"ל ו-0.2 מ"ג/מ"ל DNase ב-HBSS קר. לשקם 5 אנזים עיכול מ"ג ב 2 מ"ל של מים סטריליים בתחילה. הכן דילול ראשוני של 10 מ"ג / מ"ל DNase ב- HBSS. עבור כל 10 מ"ל של מאגר העיכול (מספיק עבור 3 בעלי חיים) לערבב 9.4 מ"ל של HBSS קר עם 0.4 מ"ל של אנזים עיכול מחדש ו 0.2 מ"ל של DNase אני מדולל.
    הערה: ריכוזים אלה נקבעו באופן אמפירי על פני ניסויים מרובים כדי לספק רמות אופטימליות של כתמי נוגדנים של תאים בודדים, תוך הפחתת מוות של תאים. Collagenase D נוסה כחלופה אנזים עיכול עם יכולת הכדאיות התא מופחתת וירידה CD45+ תאים. נא עיין בדיון לקבלת פרטים נוספים אודות התהליך האיטרטיבי למיטוב העיכול.
  2. תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה כוללת של פי 10, הסר את הלחמית הנותרת ואת עצב הראייה באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים אביביים ב- HBSS קר.
  3. מעבירים עיניים נקיות לצלחת ניתוח יבשה או לסירת שקילה קטנה. להזריק 0.15-0.20 מ"ל / עין של מאגר העיכול באמצעות מזרק מצויד 30 G מחט לתוך החלל הזגוגי לאחר שני פצעים מחוררים נעשים בעין דרך הציר החזותי ו 90 ° מן הפצע הראשון הזה עבור יציאת חיץ העיכול.
  4. יש למרוח עיניים שלמות באמצעות מספריים אביביות ומלקחיים עדינים עם כל החלקים הקטנים מ-0.5 מ"מ x 0.5 מ"מ. לנתק את רקמת העדשה עם הפרעה מכנית בוטה באמצעות מלקחיים כדי למנוע סתימת טיפים פיפטה בשלבים הבאים. עבור כל דגימה, לשטוף מלקחיים ומספריים כל אחד עם 0.75 מ"ל של חיץ העיכול לתוך צלחת קטנה. השתמשו בצלחת חדשה לכל דגימה.
  5. להעביר את התוכן של המנה לצינור דיסוציאציה על קרח באמצעות P1000 פיפטה מקפיד לא לאבד כל חומר בהעברת פיפטה. יש לשטוף את המנה עם 1.5 מ"ל נוספים של חיץ עיכול ולהביא את הנפח הכולל בצינור הדיסוציאציה ל-3.25-3.50 מ"ל.
  6. מניחים את צינור הדיסוציאציה הפוך על דיסוציאטור אלקטרוני ולהפעיל מחזור "m_brain_03_01", המורכב סיבוב חד כיווני 1 דקות ב 200 סל"ד בטמפרטורת החדר, שהיא תוכנית טעונה מראש. ודא שכל הרקמות נמצאות בתחתית צינור הדיסוציאציה במגע עם מאגר העיכול והרוטור לכך ולכל השלבים הנותרים.
  7. מניחים את צינור הדיסוציאציה באינקובטור רועד במשך 30 דקות ב 200 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס.
  8. חזור על שלבים 2.6 ו- 2.7 פעם נוספת. לאחר דגירה שנייה של 30 דקות לבצע עיכול מכני אחד אחרון באמצעות דיסוציאטור אלקטרוני כמו בשלב 2.6.
  9. לעצור את התגובה על ידי הוספת 10 מ"ל של חיץ זרימה קרה ומניחים צינורות על קרח.

3. הכנת השעיית תאים

  1. כדי ליצור השעיה חד-תאית, יוצקים את תגובת עיכול העיניים המופסקת באמצעות מסנן 40 מיקרומטר המונח על החלק העליון של צינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל. באמצעות הכוען ממזרק 2.5 מ"ל, לדחוף את כל החלקים הנותרים של רקמת העין מעוכל דרך המסנן.
  2. לשטוף את צינור הדיסוציאציה עם 10 מ"ל של מאגר זרימה ולשטוף מסנן לפני השימוש בוכנה אותו שוב להעביר חתיכות רקמת העין מעוכל דרך המסנן.
  3. חזור על שלב 3.2 באמצעות מאגר זרימה של 5 מ"ל.
  4. לשטוף את צינור הדיסוציאציה ולסנן עם 10 מ"ל הסופי של מאגר זרימה.
    הערה: נפח כולל של עיכול ומאגר זרימה הוא כ 38-40 מ"ל עבור כל מדגם.
  5. צנטריפוגה הצינור חרוט ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. תכריז על העל-טבעי מבלי להפריע לכדור התא.
  6. הכן פתרון lysing 1x על ידי הוספת פתרון lysing 10x למים סטריליים. לשבור את גלולה על ידי הבהוב צינור נגד צינור אחר. כדי ליזות כדוריות דם אדומות, להוסיף 1 מ"ל של 1x lysing פתרון עבור 30 s עם מערבולת בטמפרטורת החדר (RT).
  7. עצור את התגובה עם 20 מ"ל של מאגר זרימה.
  8. צנטריפוגה הצינור חרוט ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. תכריז על העל-טבעי מבלי להפריע לכדור התא.
  9. נתק את גלולה על ידי החלקת צינור נגד צינור אחר. הוסף 5 מ"ל של קר 1x HBSS לכל צינור.
  10. צינורות צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף על טבעי.

4. הכתמת השעיית תאים עבור פיגוציטים מונונוקולריים

  1. הכן 0.5 מ"ל של כתם חי / מת לכל מדגם על ידי דילול צבע חי / מת 1:5,000 ב HBSS קר.
  2. הוסף כתם חי / מת לכל דגימה באמצעות פיפטה P1000 הקפד לנתק את גלולה לחלוטין. העבר דגימות לצינורות 1.2 מ"ל מיקרו טיטר.
  3. קח aliquot קטן (10 μL) כדי לספור תאים באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי (ראה 4.4). דגימות דגירה עם כתם חי / מת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  4. ספירת תאים באמצעות Trypan כחול כדי לקבוע את מספר התאים החיים לכל מדגם.
    הערה: בדרך כלל, 2 עיניים מעכבר C57BL/6J בן 10-12 שבועות מכילות פחות מ- 2 x 106 תאים חיים.
  5. לשטוף דגימות על ידי הוספת 400 μL של מאגר זרימה קר. צינורות צנטריפוגה בארון צינור מיקרו טיטר ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא.
  6. Resuspend תאים לחלוטין ב 500 μL של מאגר זרימה קר. צינורות צנטריפוגה בארון צינור מיקרו טיטר ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא.
  7. חסום עד 5 x 106 תאים חיים ב- 50 μL של בלוק Fc (דילול של 1:50 במאגר זרימה קר של CD16/CD32 נגד עכבר מטוהר). אם יותר מ 5 x 106 תאים חיים, להגדיל את הנפחים כראוי.
  8. הוסף בלוקF c לכדור הקפד לנתק לחלוטין את המדגם. דגירה במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. הוסף 50 μL של פתרון כתמי נוגדנים (ראה טבלה 1 לבחירה וכמות של כל נוגדן הכלול בתמיסה) לכל 5 x 106 תאים חיים ישירות לתאים בבלוק Fc ומערבבים לחלוטין. דגירה במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: כמויות הנוגדנים תלויות בתצורת ציטומטר הזרימה ויש לצייןן באופן עצמאי עבור כל מעבדה ומכשיר. ראה טבלה 2 לקבלת תצורת כלי נגינה של מסננים ושיקוף. כדי לצייץ נוגדנים, התחל בהמלצת היצרן וחשב את מדד הכתמים. בצעו בדיקה של ריכוזי נוגדנים שונים (מעל ומתחת להמלצת היצרן) ובחרו את הריכוז הנמוך ביותר של נוגדנים שבהם נשמר מדד הכתמים. כמו כן, ודאו שצביעה חיובית פחות בהירה מהפקד בצבע אחד. השתמש בתאים לא מוכתמים כדי להבטיח כי תאים מוכתמים שלילית הם בקנה מידה ויש להם שיא או פחות מ 1 x 102. השתמש בפלואורסצנטיות פחות פקד אחד כדי להגדיר את התאים המוכתמים באופן חיובי.
  10. לשטוף דגימות על ידי הוספת 700 μL של מאגר זרימה קרה. צינורות צנטריפוגה בארון צינור מיקרו טיטר ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא.
  11. באופן אופציונלי, לאחר כתמי נוגדנים, ניתן לתקן את הדגימות עם 500 μL של 2% paraformaldehyde במאגר זרימה. תיקון דגימות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצע שטיפה אחת כמתואר ב- 4.10. אחסן דגימות קבועות ב 4 מעלות צלזיוס. יש להוסיף חרוזי ספירה ביום איסוף נתוני ציטומטריית זרימה. דגימות קבועות צריך להיות מופעל על cytometer זרימה ב 1-2 ימים.
    התראה: Paraformaldehyde הוא מאכל ומפגע בריאותי.
  12. לשטוף דגימות שוב באמצעות 500 μL של מאגר זרימה קר. צינורות צנטריפוגה בארון צינור מיקרו טיטר ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף מחצית supernatant מבלי להפריע גלולת התא.
  13. Resuspend כדורי ולהעביר ל 96 גם, U-bottom assay צלחת. צלחת צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. כדי לגנות את העל-טבעי, הפכו את הצלחת ותוך טלטול חזק אחד סלקו את הנוזל לתוך כיור, מבלי להפריע לכדור.
  14. בצינור חדש של 1.2 מ"ל מיקרו טיטר, מניחים 50 μL של חרוזי ספירה מערבולת היטב.
  15. גלולות resuspend ב 96 צלחת היטב ב 200 μL של מאגר זרימה קר. הוסף תערובת תאים על החלק העליון של חרוזים משלב קודם. לרוץ על ציטומטר זרימה בנפח כולל של 250 μL / צינור טיטר מיקרו.

5. איסוף נתוני ציטומטריית זרימה

  1. הפעל והכן ציטומטר זרימה. ההוראות המפורטות להלן הן עבור סיטופומטר לייזר שונה (טבלה 2).
  2. הפעל דגימת בדיקה, הכוללת aliquot קטן מכל מדגם, כדי להבטיח כי כל התאים נמצאים בקנה מידה עבור כל גלאי. כוונן מתחים כך שכל התאים יהיה בקנה מידה.
  3. הפעל פקדי צבע בודדים (SCC) עבור כל פלואורופור המשמש לקוקטייל מכתים(שולחן 3). מניחים צינור מיקרו טיטר לתוך צינור פוליסטירן גדול יותר 5 מ"ל למיקום על שלב סייטומטר זרימה.
    הערה: פלואורים שורש כמו BV421 (כחול האוקיינוס השקט), FITC, PE, Alexa647 (APC), ו Alexa700 אינם דורשים נוגדן זהה לקוקטייל (כלומר, CD19 PE עבור CD64 PE). עם זאת, פלואורופורים טנדם כמו PE-CF594, PE-Cy7, או APC-Cy7 דורשים את אותו נוגדן עבור SCC כמו קוקטייל עקב ניתוק פוטנציאלי של פלואורופורים מצומדים.
    1. צור את SCC עבור BV421 על ידי הוספת 2 טיפות של חרוזי פיצוי צינור טיטר 1.2 מ"ל יחד עם 1 μL של אוגר נגד עכבר CD11c BV421. חרוזי פיצוי משמשים מכיוון ש- CD11c BV421 הוא סוג משנה של למבדה של IgG במקום קאפה כמתואר ב- 5.3.3. דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הוסף מאגר זרימה של 0.2 מ"ל.
    2. צור את SCC עבור צבע חי / מת על ידי הוספת טיפה אחת של חרוזי כתמים חיוביים (כובע ירוק) מן החרוזים תגובתי אמין, ואחריו 1 μL של צבע חי / מת. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הוסף טיפה אחת של חרוזים שליליים (כובע לבן) מן החרוזים תגובתי אמין. הוסף מאגר זרימה של 0.2 מ"ל.
    3. צור את SCCs הנותרים על ידי הוספת טיפה אחת של חרוזי כתמים חיוביים (כובע ירוק) מן נגד עכברוש ואנטי אוגר Ig kappa חרוזים להגדיר, ואחריו כמות הנוגדנים המפורטים (טבלה 3) בצינור טיטר 1.2 מ"ל. דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הוסף טיפה אחת של חרוזים שליליים (כובע לבן) מן אנטי עכברוש אנטי אוגר Ig קאפה חרוזים להגדיר. הוסף מאגר זרימה של 0.2 מ"ל.
    4. וורטקס כל תערובות חרוזים לחלוטין. אחסן SCCs ב 4 °C (69 °F) עד 3 ימים.
      הערה: SCC עבור עכברי כתב פלואורסצנטי הוא תאים מוכתמים.
    5. בעת הפעלת SCCs, הגדר מתחים כך שלדגימה SCC יש שיא גדול יותר מכל פלואורסצנטיות עבור מדגם של תאים באותו ערוץ גלאי. בנוסף, יש להגדיר מתחים כך שלכל SCC יהיה הפרש יומן רישום של לפחות 0.5 בין שיא ההיסטוגרמה בערוץ העניין לעומת כל ערוץ אחר (איור 1).
  4. הפעל דוגמאות על "נמוך" שמירה על אירועים / שני מתחת 4000. אם לא ניתן להוריד את קצב הזרימה כראוי, לדלל דגימות עם מאגר זרימת קור נוסף. רשום את אמצעי האחסון שנוסף מכיוון שהדבר יהיה נחוץ לחישוב הספירה (ראה תוצאות מייצגות).
  5. לאסוף לפחות 3 x 106 אירועים לכל מדגם. זה עשוי להיות גבוה יותר ממספר התא עקב גרגירי פיגמנט ופסולת לספור כאירועים על הסייטומטר שלך.
  6. רשום פלואורסצנטיות מינוס אחת (FMO) עבור כל פלואור שאינו חי/מת עבור אסטרטגיית ג'ינג נאותה בסעיף 6.4. FMO הוא מדגם שהוכתם בכל הפלואורופורים למעט אחד.
  7. נקה וכבה את ציטומטר הזרימה בהתאם להוראות היצרן או המתקן.

6. ביאור של נתוני ציטומטריית זרימה

  1. פתח גליון עבודה חדש באמצעות תוכנת ניתוח. יבא קבצי FCS מסיטומטר עבור כל הדגימות והפקדים בצבע יחיד.
  2. השתמש ב- SCCs כדי ליצור מטריצת פיצוי.
  3. החל את מטריצת הפיצוי על הדגימות המוכתמות ו- FMOs שלך.
  4. השתמש ב- FMOs כדי לקבוע כתמים חיוביים כדי לצייר שערים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 הראה היסטוגרמות תדר לא מפוצות עבור ה- SCCs והתאים עבור הלייזר האדום: Alexa647, Alexa700 ו- APC-Cy7. באיור 1A, קו המג'נטה תיאר את פסגת ה- SCC עבור Alexa647, בעוד שקו הציאן הראה את הפרש יומן הרישום המיועד של 0.5. שים לב כי השיא Alexa700 ו- APC-Cy7 היה משמאל (פחות בהיר) של קו ציאן. כמו כן, שים לב שהתאים היו כולם משמאל לקו המגנטה. כל התאים מימין לשיא ה-SCC לא קיבלו פיצוי. ערוצים ספציפיים היו ידועים לשפוך לתוך אחרים המבוססים על הכימיה של צבעי פלואורוכרום (כלומר. לייזר סגול: BV421 -> V500, לייזר צהוב-ירוק: PE -> PE-CF594, לייזר אדום: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, לייזר צולב: PE-Cy7 -> APC-Cy7). אם אחד התנאים לעיל לא התקיים, המתח של ערוץ אחד יכול להיות מותאם כלפי מעלה בעוד כל ערוצי לשפוך יכול להיות מועבר למטה. ראו איור 1B ואיור 1C לקבלת דוגמאות נוספות של הלייזר האדום. לאחר שהמתח נקבע ולאחר מכן נרשם, יש להפעיל את כל הדגימות עם פרמטרי המתח. אשף הגדרת פיצוי קיים ועשוי להועיל.

זיהוי חרוז ספירה נחוץ לכימות ספירות תאים. איור 2A הראה מאפייני FSC-A לעומת SSC-A עבור כל האירועים שנותחו משתי עיניים של עכבר יחיד. חשוב להתאים את מתח SSC כדי לוודא חרוזי הספירה שלך גלויים כאוסף הדוק מאוד של SSC-Aגבוה FSC-A אירועיםנמוכים. ספירות חרוזים נוקו ואושרו על ידי התוויית PE לעומת APC-Cy7 (איור 2B). חרוזים נקיים היו אשכול הדוק של PE+ ו- APC - Cy7- אירועים.

סינגלים ותאים חיים זוהו לאחר מכן מכל האירועים. סינגלים נקבעו על ידי התוויית FSC-H לעומת FSC-A. סינגלים היו בקורלציה חיובית בשני מאפיינים אלה בעוד שלתאי דאבל ושלישייה היה FSC-A גדול יותר מאשר FSC-H(איור 2C). תאים חיים תוארו על ידי התוויית Live / Dead לעומת FSC-A. תאים מתים היו חיים / מתים חיוביים, ותאים להפגין FSC-A גדול יותר מאשר פסולת (תאנה 2D). שים לב כי חרוזי ספירה היו חיים / מתים+ והוסרו בשלב זה.

איור 3 מציג את אסטרטגיית הגזירה הראשונית לתיעוד של פיגוציטים מונו-גרעיניים מתאים בודדים חיים. סינגלים חיים צולמו באמצעות עלילה CD45 לעומת CD11b(איור 3, שמאל). שים לב כי CD45+CD11b- (בעיקר B-תאים ותאי T), CD45עמוםCD11b+ (microglia putative), ו CD45+CD11b+ תאים (חדירה לתאי החיסון, גדל עם לייזר [איור 3B, שמאל]) נבחרו. היעדר CD45+ תאים ב- CD45 FMO אישר את בחירת השער (איור 3C, שמאל). לאחר מכן, נויטרופילים, אאוזינופילים, תאי B, תאי NK ותאי T לא נכללו על-ידי התוויית CD45+ סינגלים חיים באמצעות שער שושלת (לין: Ly6G [נויטרופילים], SiglecF [אאוזינופילים], B220 [תאי B], NK1.1 [תאי NK], CD4 [תאי T]ו- CD8 [תאי T]) לעומת CD11b. ניתן היה להבחין בקלות בעלייה בקבוצות CD11b+Lin- תאים בין קבוצות ללא לייזר(איור 3A, אמצע) ולייזר(איור 3B, אמצע). שים לב למחסור בתאי CD11b+Lin ב- FMO CD11b(איור 3C, באמצע) והיעדר תאי Lin+ ב- Lin FMO (איור 3C, ימין). Microglia ניתן להפריד מן הסתננות phagocytes מונונוקלארי על ידי כמות של ביטוי CD4513,24. CD11b+Lin- תאים היו חזותיים באמצעות CD11b לעומת CD45 התוויה לזהות CD45dim putative microglia ו CD45גבוה חדירה מונונוקארית phagocytes. העלייה היחסית בפגוציטים מונו-גרעינייםגבוהים של CD45 הייתה ברורה בעכבר שטופל בלייזר(איור 3A,B,מימין).

איור 4 זיהה מיקרוגליה, שלוש תת-קבוצות מקרופאגים, מונוציטים ותאים דנדריטיים. Microglia נקבעו על ידי התוויית תאיםעמומים CD45 על עלילה CD64 לעומת MHCII(איור 4, לוח שמאלי). Microglia הוכחו להיות CD64+MHCIIנמוך בעבר13. המיקרוגליה נותרה יחסית ללא שינוי עם לייזר ונעדרה ב-CD64 FMO(איור 4A,C משמאל). תאיםגבוהים CD45 הותוו לאחר מכן באותו גרף CD64 לעומת MHCII. CD64+MHCII- זוהו מקרופאגים (MHCII- Macs), CD64-MHCII- מונוציטים, ותאי MHCII+ זוהו (איור 4A,B, שמאל אמצעי). שים לב להיעדרם של תאי MHCII+ ב- FMO של MHCII(איור 4C, שמאל אמצעי). תאים MHCII+ הופלו עוד יותר באמצעות CD64 ו- CD11c. CD64+CD11c- מקרופאגים (CD11c- Macs), CD64+CD11c+ מקופאגים (CD11c+ Macs), ו- CD64-CD11c+ תאים דנדריטיים (DCs) הוגדרו (איור 4A, B, אמצע ימין). שים לב להיעדרם של CD11c+ תאים ב- FMO CD11c(איור 4C, ימין אמצעי). מונוציטים היו תת-סוגים קלאסיים Ly6C+ או Ly6C לא קלאסי- מונוציטים (איור 4, ימין). שים לב להיעדרם של Ly6C+ מונוציטים ב- Ly6C FMO (איור 4C, מימין).

מספר התאים לעכבר (או לכל 2 עיניים) חושב במשוואה הבאה:

Equation 1

באמצעות אמצעי האחסון בפעולת שירות זו, המשוואה היא:

Equation 2

ספירת תאים וספירת חרוזים יהיו ספציפיים לכל דגימה. הריכוז של חרוזים הוא ספציפי לכל הרבה חרוזי ספירה המסופקים על ידי היצרן על כל בקבוקון.

מקרופאגים לחדור choroid לאחר פציעת לייזר25, דלדול מקרופאג מפחית שטח CNV18. מחקרים ישנים אלה מסתמכים על הדמיה חיסונית, שאינה יכולה להבדיל באופן אמין בין פיגוציטים מונו-גרעיניים, או פחות סמנים ציטומטריים בזרימה לזיהוי מקרופאג'. הטרוגניות מקרופגת היא מושג מתפתח באימונולוגיה מולדת, שם מקרופאגים מסוגלים לבצע פונקציות מרובות בהתאם למקורם ומיקרו-וירוס הרקמהשלהם 12,26. ביצענו ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים על עיני עכבר לא מטופלות ומטופלים בלייזר ביום 3 לאחר פגיעה בלייזר כדי לזהות פיגוציטים מונונוקאריים והטרוגניות מקרופאגת. טיפול לייזר מוגבר MHCII-, CD11c-ו CD11c+ מקרופאגים על ידי 7.0-25.6, 2.8-7.2, ו 3.9-8.2 קיפול בהתאמה (איור 5A,C). ספירת התאים הדנדריטית הייתה גם פי 4.5-4.7 בלייזר (איור 5F). ספירות מיקרוגליה ומונוצייטים לא הושפעו מטיפול לייזר (איור 5D,E). לא התגלו הבדלים משמעותיים עם או בלי זלוף מערכתי לפני ההקמה. תוצאות אלו מדגימות אוכלוסיות מקרופאגים מוגברות ותאים דנדריטיים לאחר פגיעה בלייזר ללא שינוי במיקרוגליה או במונוציטים. יתר על כן, נתונים אלה מדגישים כיצד cytometry זרימה מרובת פרמטרים יכול לזהות הטרוגניות מקרופאג.

נוגדן או חיץ פלואורופור שיבוט סכום לדגימה (ng)
עכברוש נגד עכבר Ly6C התאמה גופנית אל-21 15
עכבר נגד עכבר CD64 Pe X54-5/7.1 40
עכברוש נגד עכבר Tim4 אלקסהפלור 647 RMT4-54 300
תקליטור נגד עכבר אוגר CD11c BV 421 HL3 300
עכברוש נגד עכבר Ly6G PE-CF594 1A8 (1A8) 10
עכבר נגד עכבר NK1.1 PE-CF594 PK136 10
עכברוש נגד עכבר סיגלק F PE-CF594 E50-2440 20
עכברוש נגד עכבר B220 PE-CF594 RA3-6B2 20
עכברוש נגד עכבר CD8 PE-CF594 53-6.7 40
עכברוש נגד עכבר CD4 PE-CF594 RM4-5 20
עכברוש נגד עכבר MHC II אלקסהפלור 700 M5/114.15.2 2.5
עכברוש נגד עכבר CD11b APC-Cy7 M1/70 2
עכברוש נגד עכבר CD45 PE-Cy7 30-F11 6
מאגר MACS

טבלה 1: פלואור נוגדנים ושיבוטים (ראו שלב 4.9). בדרך כלל, דגימה אחת היא אחת או שתיים עיניים מתעכלות. הוסף מאגר זרימה לצינור תחילה ולאחר מכן כל נוגדן. ניתן לבצע דילולים כדי למנוע pipeting קטן מדי נפח, תוך שינוי נפח מאגר זרימה הכולל כראוי. ראה טבלת חומרים עבור מספר מוצר וחברה.

לייזר חריץ PMT מסנן מראה צבעים
ויולט (405 ננו מ') ת 525/50 505LP (505LP) V500 או אמסיאן
ב 450/50 כחול האוקיינוס השקט, eFluor 450, V450 או BV421
כחול (488nm/FSC) ת 710/50 685LP (685LP) PerCP-Cy5.5, PERCP, PI או 7AAD
ב 525/50 505LP (505LP) FITC, CFSE, GFP או אלקספלור 488
ג 488/10 תואר ראשון
צהוב-ירוק (561 ננום) ת 780/60 735LP (735LP) PE-Cy7
ב 610/20 600LP (600LP) PE-CF594, mצ'רי או DsRed2
ג 582/15 Pe
אדום (640 ננום) ת 780/60 735LP (735LP) APC-Cy7, APC-H7 או APC-eFluor 780
ב 730/45 690LP (690LP) אלקסהפלור 700
ג 670/30 APC או אלקספלור 647

טבלה 2: תצורת ציטומטר זרימה. הגדרת סינון ושיקוף עבור ציטומטר ארבעה לייזרים ואת פלואורופורים זמינים אשר ניתן לזהות בכל ערוץ. PMT = צינור photomultiplier, FSC = פיזור קדימה, SSC = פיזור בצד.

נוגדן פלואורופור שיבוט סכום ל- SCC (ng)
עכברוש נגד עכבר CD45 התאמה גופנית 30-F11 500
עכברוש נגד עכבר CD19 Pe 1D3 40
עכברוש נגד עכבר Tim4 אלקסהפלור 647 RMT4-54 100
תקליטור נגד עכבר אוגר CD11c BV421 HL3 200
עכברוש נגד עכבר סיגלק F PE-CF594 E50-2440 40
עכברוש נגד עכבר CD19 אלקסהפלור 700 1D3 200
עכברוש נגד עכבר CD11b APC-Cy7 M1/70 200
עכברוש נגד עכבר CD45 PE-Cy7 30-F11 200
צבע חי / מת eFluor 506 מספר N/A 1 מיקרול

טבלה 3: פלואור נוגדנים ושיבוטים לבקרת צבע אחת. יש להוסיף כל נוגדן חרוז הפיצוי המתאים כמתואר בשלבים 5.3.1 – 5.3.3.

Figure 1
איור 1: מתח ייצוגי מוגדר עבור הלייזר האדום. (A)פקדי צבע בודדים (SCCs) עבור Alexa647. בצד שמאל, SCC עבור Alexa647 מוצג. האמצע השמאלי מציג את הדליפה של Alexa647 SCC לתוך ערוץ Alexa700. השיא של Alexa647 SCC מוצג במגנטה ודיפרנציאל המטרה של יומן רישום 0.5 מוצג בציאן. שים לב כי הפסגה היא שמאלה (פחות בהיר) מאשר קו ציאן. הימין התיכון מדגים את הדליפה של Alexa647 SCC לתוך ערוץ APC-Cy7. ימין מדגים את התאים בערוץ Alexa647. שים לב שכל התאים בהירים פחות מה- SCC (קו מגנטה). (B)SCC עבור אלקסה700. באמצע שמאל מראה את SCC עבור Alexa700. שמאל מציג את הדליפה של Alexa700 SCC לתוך ערוץ Alexa647. הימין התיכון מדגים את הדליפה של Alexa700 SCC לתוך ערוץ APC-Cy7. השיא של Alexa700 SCC מוצג במגנטה ודיפרנציאל המטרה של יומן רישום 0.5 מוצג בציאן. שים לב כי הפסגה היא שמאלה (פחות בהיר) מאשר קו ציאן. ימין מדגים את התאים בערוץ Alexa700. שים לב שכל התאים בהירים פחות מה- SCC (קו מגנטה). (C)SCC עבור APC-Cy7. שמאל ושמאל אמצעי מראים את הדליפה של APC-Cy7 SCC לתוך Alexa647 ו Alexa700, בהתאמה. שים לב כי שתי הפסגות הן משמאל לקו ציאן. ימין אמצעי מדגים את ACP-Cy7 SCC. ימין מדגים את התאים בערוץ APC-Cy7. שים לב שכל התאים בהירים פחות מה- SCC (קו מגנטה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זיהוי מייצג של חרוזי ספירה, סינגלים ותאים חיים. (A) אזור פיזור צדדי (SSC-A) לעומת אזור פיזור קדימה (FSC-A) עבור כל התאים על מתאר מתאר. חרוזי ספירה מזוהים על ידי SSC-A גבוה, FSC-A נמוך, וקיבוץ חזק מאוד של החרוזים האחידים. (B)PE לעומת APC-Cy7 מגרש עבור שער חרוז נקי. החץ בין A ל- B מציין התוויה של האירועים החיוביים של חרוז הספירה בלבד. חרוזי ספירה נקייה מסומנים על ידי PE גבוה ופלואורסצנטיות APC-Cy7 נמוכה. (C) FSC-Height (FSC-H) לעומת FSC-Area (FSC-A) של כל התאים מדגים תאים בודדים בקו רחב מתואם באופן חיובי. כפולים וכפולות אחרות מציגים שטח FSC גדול יותר מגובה FSC. (D) חי / מת לעומת FSC-A עבור תאים בודדים. תאים חיים מוגדרים חיים / מתים נמוך FSC-A חיובי. האחוזים מציינים אחוז מהאב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: זיהוי מייצג של פיגוציטים מונונוקאריים. משמאל: CD45 לעומת CD11b pseudocolor התוויה של תאים חיים מ unlasered (A), לייזר (B), ופלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) פקד (C). משמאל: CD45+ תאים מוגדרים ב- A-B ונעדרים ב- FMO. שים לב לעלייה של CD45+CD11b+ תאים בקבוצה בלייזר (B). אמצעי: התוויית פסאודוקולור של סמן שושלת (Lin) לעומת CD11b עבור CD45+ תאים. CD11b+Lin- תאים מסומנים ב- A-B ונעדרים ב- FMO עבור CD11b (למטה). מימין: CD11b לעומת CD45 התוויה של CD11b+Lin- תאים. מזוהים תאיםגבוהים CD45 dim ו- CD45. שים לב לעלייה בתאיםהגבוהים CD45 בקבוצה בלייזר (B). האחוזים מציינים אחוז מהאב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: זיהוי מייצג של מיקרוגליה, תאים דנדריטיים, מונוציטים ותת-קבוצות מקרופאג'. משמאל: CD64 לעומת MHCII פסאודוקולור התוויה של תאיםעמומים CD45 מגדיר microglia כמו CD64+MHCIIנמוך. שימו לב לכמות המיקרוגליה הדומה בקבוצות ללא תמורה (A) ובלייזר(B),והיעדר מיקרוגליה בבקרת FMO (C). שמאל אמצעי: CD64 לעומת MHCII pseudocolor התוויה של תאיםגבוהים CD45 מגדיר MHCII- מקרופאגים כמו CD64+MHCII-, מונוציטים כמו CD64-MHCII-, ו MHCII+ תאים. שים לב לעלייה ב- MHCII- מקרופאגים בקבוצה בלייזר (B), היעדר תאי MHCII+ בתאי FMO (C, באמצע) ו- CD64 FMO (C, שמאל) עזרו לקבוע את הניתוק עבורתאים CD64+ ו- CD64. ימין אמצעי: CD64 לעומת מתווה פסאודו-קולור CD11c של MHCII+ תאים. CD11c- מקרופאגים הוגדרו כ- CD64+CD11c-, CD11c+ מקרופאגים זוהו כ- CD64+CD11c+, ותאים דנדריטיים (DCs) הוגדרו כ- CD64-CD11c+. הן תת-קבוצות מקרופגות והן תאים דנדריטיים הוגדלו באמצעות לייזר (B). שים לב להיעדרם של CD11c+ תאים ב- FMO (C). מימין: Ly6C לעומת טים4 עלילה מדומה של מונוציטים. קלאסי Ly6C+ ולא קלאסי Ly6C- מונוציטים זוהו. שים לב כי קלאסי Ly6C+ מונוציטים נעדרו Ly6C FMO (C). האחוזים מציינים אחוז מהאב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: נתונים מייצגים עבור פיגוציטים מונו-גרעיניים בין עכברים לא מנוצלים ועכברים שעברו לייזר הן עם זלוף מערכתי והן ללא זלוף מערכתי. ספירת המקרופאגים של CD11c- (B) ו- CD11c+ (C) הוגדלה כולה באמצעות לייזר. לא זוהו שינויים בין מיקרוגליה(D)או מונוציטים(E)לא מנוזלים. תאים דנדריטיים (DC) הוגדלו גם עם לייזר (F). בראון פורסיית' וולש ANOVA עם מבחן ההשוואה המרובות T3 של דנט שימשו להגדרת הבדלים סטטיסטיים בשל שונות לא שוויונית בין קבוצות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים מאפשרת ניתוח כמותי של סוגי תאים מרובים ברקמה מורכבת. בדו"ח זה, אנו מתארים את הזיהוי הציטומטרי הזרימה של אוכלוסיות פיגוציטים מונונוקליות, כולל מונוציטים, תאים דנדריטיים ותת-קבוצות מקרופאגים, לאחר פגיעה בלייזר בעין העכבר. Liyanage et al דיווח לאחרונה על אסטרטגיית gating דומה כדי לזהות נויטרופילים, אאוזינופילים, לימפוציטים, DCs, מקרופאגים, חדירה מקרופאגים, מונוציטים27. אסטרטגיית הגטינג שלנו שונה בעיקר על ידי תוספת של CD64. Liyanage et al מזהה DC כ- CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ תאים, ומאקרופאגים כ- CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- תאים. אנו מזהים DC כ- CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- תאים ומאקרופאגים כ- CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD64+ תאים. השימוש ב- CD64 כדי להפלות DC ממאקרופאגים מבוסס היטב6, ואסטרטגיה זו מאפשרת לנו לזהות הטרוגניות מקרופגת, כולל CD11c + מקרופאגים. המגבלה העיקרית של שיטה זו היא שהיא אינה מספקת נתונים על ארכיטקטורת רקמות או על המיקום של תאים ספציפיים בתוך העין. על מנת לקבוע אם תאים אלה נמצאים ברשתית, choroid, קשתית, או מבנה עיני אחר, הפרוטוקול שלנו יכול להיות משולב עם שיטות היסטולוגיות או שונה לכלול ניתוח עיניים נרחב יותר כדי להפעיל בנפרד cytometry זרימה מרובת פרמטרים על כל תת-מבנה עיני.

יש לנו אופטימיזציה הפרוטוקול לעיכול של עיני עכבר שלמות כדי למנוע כל שונות שנוצרה על ידי ניתוח. לדוגמה, ניתוח של כוסות עיניים אחוריות עם הסרת קרנית, קשתית ועדשה יכול ליצור שונות מחומר איריס או קרנית שמור (תת-ניתוח) או פגיעה מוגברת בלייזר באזור העין האחורית הרגילה (ניתוח יתר). ההשוואה שלנו בין עיניים לא משוננות בלייזר מזהה חדירה של פיגוציטים מונונוקלריים בגלל פגיעה רטינוכורידאלית. לניתוח ההשפעות של מחלות מערכתיות על העין, כלומר uveitis וסוכרת, ניתוח תת-קומפוזיציה עינית בודדת היא חיונית. שיטת העיכול, בסעיף 2 של הפרוטוקול, היא הקריטית ביותר, בעוד שלבים אחרים בסעיפים 3 - 5 שימשו בהצלחה על סוגי רקמות מרובים24. הגענו לתנאי העיכול שלנו בשיטה איטרטיבית שכללה: (1) בדיקות של שיטת העיכול הכימית (קולגנאז D לעומת אנזים עיכול), (2) קביעת אורך העיכול הכימי (30, 60 ו -90 דקות), ו -(3) תוספת של עיכול מכני (ללא, פעם, פעמיים, שלוש פעמים). בכל שלב שפטנו את ההצלחה של תנאי העיכול על ידי הכדאיות של התא ומספר CD45HiCD64+ (חדירת מקרופאגים) תאים. מצאנו כי אנזים העיכול (ראה טבלה משלימה של חומרים) התאושש תאים חיים יותר קולגנאז D וניסיון מחצית ריכוז האנזים העיכול הביא פחות מקרופאגים חדירה. לאחר מכן, 60 דקות של עיכול כימי עם עיכול מכני כמעט הכפילו את אוכלוסיות המקרופאג'ים החודרות. שלושה עיכולים מכניים היו אופטימליים עם 25-30% תאים חיים של סינגלים ואוכלוסיות המקרופאג'ים החודרות ביותר. לבסוף, תנאי עיכול מכניים מהירים יותר גרמו לאובדן חמור של תאים חיים ומקפאגים.

בעתיד, אנו מציעים להרחיב את השיטה על ידי הסרת הקרנית, הקשתית והעדשה ולאחר מכן לעכל בנפרד את הרשתית ואת העין האחורית (סקלרה, צ'ורויד ואפיתל פיגמנטי ברשתית). עם שינוי זה, אנו מצפים להפחית את תנאי העיכול בגלל המאפיינים החלבוניים והצפופים של העדשה והקרנית בהתאמה. הפחתות אלה יכולות לכלול ריכוז אנזים עיכול מופחת, מעבר לקולגנאז, ירידה בזמן העיכול או ירידה בכמות העיכול המכני. אנו מצפים לתנאי עיכול מופחתים בסך הכל עבור העין האחורית, ותנאי עיכול מופחתים עוד יותר עבור רשתית בלבד.

כיוונים עתידיים נוספים כוללים את ההרחבה של פאנל cytometry זרימה רב-פרמטרי קונבנציונלי שלנו למכשיר לייזר קונבנציונלי 6 או ציטומטריית זרימה ספקטרלית. ציטומטריית זרימה ספקטרלית מאפשרת זיהוי פלואורופור על פני כל הספקטרום, ולא נקבעת על ידי המסננים הזמינים. ציטומטריית זרימה ספקטרלית גורמת לזיהוי צבעים ספציפי יותר. עם זאת, ציטומטריית זרימה ספקטרלית דורשת מערכת חדשה לחלוטין של שיקולים שיש לעקוב אחריהם והיא מעבר להיקף כתב היד הזה. לפרטים נוספים, אנא עיינו במאמר האחרון של JoVEמס' 28. 6 מכשירי הלייזר כוללים לייזר אולטרה סגול, אשר מוסיף 6-9 גלאים. בעת הוספת סמנים ללוח ציטומטריה של זרימת עין העכבר, אנו ממליצים על זיהוי של סוגי תאים עיניים נוספים. לדוגמה, ניתן להפריד את שער השושלת כדי לזהות נויטרופילים, אאוזינופילים, תאי פיטום, תאי NK ולימפוציטים באופן עצמאי. לא מומלץ להגדיל את זיהוי קבוצת המשנה של פיגוציטים מונונוקאריים בגלל המספר הקטן של מקרופאגים במצב יציב. בעת הוספת נוגדנים חדשים, אנו מציעים טיטרציה נוגדנים זהירה.

לסיכום, הצגנו שיטה מותאמת וחזקה לגילוי אוכלוסיות פיגוציטים מונונוקליות בעין העכבר. בשל סמני פני התא החופפים מאוד של מונוציטים, תאים דנדריטיים, מקרופאגים ומיקרוגליה, ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים היא השיטה הטובה ביותר לזהות אוכלוסיות סלולריות אלה. ניתן להשתמש בציטומטריית זרימה לניתוח סוגי תאים, מיפוי גורל ו/או מיון תאים לצורך הערכה תעתיקית או פרוטאומית. המגבלה העיקרית שלה היא חוסר ארכיטקטורת רקמות, וממצאים מרכזיים ניתן לאשר באמצעות היסטולוגיה מסורתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

JAL נתמכה על ידי מענק NIH K08EY030923; CMC נתמך על ידי מענק K01 (5K01AR060169) מהמכון הלאומי NIH למחלות דלקת פרקים ושרירים ומענק מחקר חדשני (637405) מברית המחקר זאבת.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-120
1.7 ml microcentrifuge tubes Costar 3620
10 ml pipettes Fisher Scientific 431031
15 ml conicals ThermoFisher 339650
1x HBSS, 500 ml Gibco 14025-092
2.5 ml syringe Henke Sass Wolf 7886-1
20% paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15713-S
25 ml pipettes Fisher Scientific 431032
30 G needle Exel 26437
3ml luer lock syringe Fisher Scientific 14955457
41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish Fisher Scientific 08-732-112
50 ml conicals Falcon 352070
96-well, U-bottom assay plate without lid Falcon 353910
Amine reactive beads ThermoFisher A10628
Analysis software FlowJo v 10
Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set BD Biosciences 552845
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
Cell counter Invitrogen AMQAX1000
Cell counter slides Invitrogen C10283
Compensation beads ThermoFisher 01-1111-42
Count beads ThermoFisher 01-1234-42
Curved forceps Fisher Scientific 16-100-123
Digestion enzyme Sigma Aldrich 5401020001
Dissecting microscope National Optical and Scientific Instruments, Inc. DC3-420T
Dissociation tubes Miltenyi Biotec 130-096-334
DNase Roche 10104159001
Electronic dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
FACS Diva software BD Biosciences
Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142
Fine forceps Integra Miltex 17035X
Flow buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Flow cytometer BD Biosciences
Flow tubes Falcon 352008
Hamster anti-mouse CD11c BV421 BD Biosciences 562782
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-123
Live/Dead dye ThermoFisher 65-0866-14
Lysing solution, 10x solution BD Biosciences 555899
Micro titer tube and rack Fisher Scientific 02-681-380
Mouse anti-mouse CD64 PE BioLegend 139304
Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 BD Biosciences 562864
P1000 pipet tips Denville Scientific P2404
P1000 pipettor Gilson FA10006M
P2 pipet tips eppendorf 22491806
P2 pipettor Gilson FA10001M
P20 pipettor Gilson FA10003M
P200 pipet tips Denville Scientific P2401
P200 pipettor Gilson FA10005M
Pipet man Fisher Scientific FB14955202
Rat anti-mouse B220 PECF594 BD Biosciences 562313
Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 BD Biosciences 557657
Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 BD Biosciences 557958
Rat anti-mouse CD19 PE BD Biosciences 553786
Rat anti-mouse CD4 PECF594 BD Biosciences 562314
Rat anti-mouse CD45 FITC ThermoFisher 11-0451-82
Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 BD Biosciences 552848
Rat anti-mouse CD8 PECF594 BD Biosciences 562315
Rat anti-mouse Ly6C BD Biosciences 561085
Rat anti-mouse Ly6G PECF594 BD Biosciences 562700
Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 BioLegend 107622
Rat anti-mouse Siglec F PECF594 BD Biosciences 562757
Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 BD Biosciences 564178
Shaking incubator Labnet 311DS
Spring scissors Fine Science Tools 15024-10
Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh Fisher Scientific 22363547
Sterile water, 500 ml Gibco A12873-01
Swinging bucket centrifuge eppendorf 5910 R
Trypan blue, 0.4% solution Gibco 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
  2. Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
  3. O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
  4. Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
  5. Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
  6. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  7. Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
  8. Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
  9. Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
  10. Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
  11. Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
  12. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  13. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
  14. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  15. Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
  16. McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
  17. Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
  18. Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
  19. Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
  20. Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
  21. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
  22. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
  23. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
  24. Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
  25. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
  26. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  27. Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
  28. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 160 עין ציטומטריית זרימה מקרופאג' מיקרוגליה מונוציט מיאלואיד
עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Droho, S., Cuda, C. M., Lavine, J.… More

Droho, S., Cuda, C. M., Lavine, J. A. Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes. J. Vis. Exp. (160), e61348, doi:10.3791/61348 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter