Digestione di interi occhi di topo per l'analisi citometrica a flusso multi-parametro dei fagociti mononucleari
Summary
Questo protocollo fornisce un metodo per digerire interi occhi in una singola sospensione cellulare ai fini dell’analisi citometrica del flusso multi-parametro al fine di identificare specifiche popolazioni fagocitiche mononucleari oculari, inclusi monociti, microglia, macrofagi e cellule dendritiche.
Abstract
Il sistema immunitario innato svolge ruoli importanti nella fisiopatologia oculare tra cui uveite, retinopatia diabetica e degenerazione maculare legata all’età. Le cellule immunitarie innate, in particolare i fagociti mononucleari, esprimono marcatori di superficie cellulare sovrapposti, il che rende l’identificazione di queste popolazioni una sfida. La citometria a flusso multi-parametro consente l’analisi simultanea e quantitativa di marcatori di superficie a più celle al fine di differenziare monociti, macrofagi, microglia e cellule dendritiche negli occhi del topo. Questo protocollo descrive l’enucleazione di interi occhi del topo, la dissezione oculare, la digestione in una singola sospensione cellulare e la colorazione della sospensione a singola cella per marcatori cellulari mieloidi. Inoltre, spieghiamo i metodi appropriati per determinare le tensioni utilizzando controlli a colori singoli e per delineare cancelli positivi utilizzando la fluorescenza meno un controllo. La principale limitazione della citometria a flusso multi-parametro è l’assenza di architettura tissutale. Questa limitazione può essere superata dalla citometria a flusso multi-parametro dei singoli compartimenti oculari o dalla colorazione gratuita dell’immunofluorescenza. Tuttavia, l’immunofluorescenza è limitata dalla sua mancanza di analisi quantitativa e dal numero ridotto di fluorofori sulla maggior parte dei microscopi. Descriviamo l’uso della citometria a flusso multi-parametrico per fornire un’analisi altamente quantitativa dei fagociti mononucleari nella neovascolarizzazione coroiroidale indotta dal laser. Inoltre, la citometria a flusso multi-parametro può essere utilizzata per l’identificazione di sottoinsiemi di macrofagi, mappatura del destino e smistamento delle cellule per studi trascritomici o proteomici.
Introduction
Il sistema immunitario innato include più tipi di cellule che stimolano l’attivazione e l’infiammazione del complemento. Le cellule immunitarie innate includono cellule killer naturali (NK), mastociti, basofili, eosinofili, neutrofili e fagociti mononucleari. I fagociti mononucleari, che sono composti da monociti, macrofagi e cellule dendritiche, sono stati implicati nella fisiopatologia di molteplici condizioni oftalmiche tra cui uveite, retinopatia diabetica e degenerazione maculare legata all’età (AMD)1. In questo protocollo, ci concentreremo sull’identificazione dei fagociti mononucleari utilizzando l’analisi citometrica del flusso multi-parametro in un modello di topo di AMD2 neovascolare. Questo protocollo è adattabile per i modelli di topo di retinopatia diabetica e / o uveite, ma è raccomandata una dissezione oculare più estesa a causa della natura sistemica di queste malattie.
I fagociti mononucleari esprimono marcatori di superficie cellulare sovrapposti. Macrofagi e microglia residenti nel tessuto di lunga durata provengono dal progenitore eritemicomieloide derivato dal sacco del tuorlo 3 ,mentreil riciclaggio di macrofagi e cellule dendritiche si differenzia dal progenitore di cellule dendritiche a midollo osseo4. I marcatori di superficie delle celle del mouse comuni a monociti, macrofagi e celle dendritiche includono CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17e il marcatore intracellulare Iba18. Per superare questa sfida, l’analisi trascrittamica di macrofagi, monociti e cellule dendritiche provenienti da più tessuti definisce il CD64 come un marcatore di superficie cellulare specifico del macrofago6. I macrofagi sono stati descritti nell’iride, nella coroide, nel corpo ciliare e nel nervo ottico negli occhi sani3. In alternativa, l’identificazione delle cellule dendritiche è più difficile; il metodo più specifico di identificazione delle cellule dendritiche richiede la mappatura del destino utilizzando il mouse reporter Zbtb46-GFP9. Indipendentemente da questa linea di reporter, l’espressione di CD11c e MHCII in combinazione con l’assenza di CD64 può identificare potenziali cellule dendritiche6,10. Le cellule dendritiche sono state identificate in cornea, congiuntiva, iride e coroide negli occhi normali11. Le microglia sono macrofagi specializzati situati nella retina, protetti dalla barriera emato-retinica e derivati dalle cellule progenitrici del sacco tuorlo12. Di conseguenza, le microglia retiniche possono essere differenziate dai macrofagi derivati dai monociti per i loro livelli fiochi di espressione CD4513 e alti livelli di Tmem119, che è disponibile come anticorpo di citometria aflusso 14. All’attivazione delle microglia, tuttavia, CD45 può essereregolato 15 e Tmem119 può essere regolato verso il basso3, dimostrando la complessità della biologia delle microglia e questo è probabilmente rilevante sia nell’AMD che nel suo modello di mouse. Infine, i monociti possono essere divisi in almeno due sottotipi, inclusi classici e non classici. I monociti classici mostrano CCR2+Ly6Caltaespressione bassa CX3CR1, e monociti non classici dimostrano CCR2–Ly6CbassoCX3CR1marcatori alti5.
A causa della necessità dell’analisi quantitativa dell’espressione marcatore, cioè livelli alti rispetto a bassi/ fiochi, la citometria del flusso multi-parametro è il metodo ideale per la discriminazione tra monociti, macrofagi, microglia e cellule dendritiche nell’occhio e in altri tessuti. Ulteriori vantaggi includono l’identificazione delle sotto-popolazioni, la possibilità di utilizzare lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per ordinare le popolazioni cellulari per l’analisi trascri o proteomica e la mappatura del destino. Il principale svantaggio della citometria a flusso multi-parametro è la mancanza di architettura tissutale. Questo può essere superato dalla dissezione oftalmica nei vari sottocomparti oculari: cornea, congiuntiva, iris, lente, retina e complesso coroide-sclera. Inoltre, è possibile eseguire l’imaging di immunofluorescenza di conferma, ma è limitato dal numero di marcatori e dalla mancanza di una quantificazione robusta.
Studi di associazione a livello genomico hanno collegato più geni di complemento con AMD16. L’attivazione del complemento porta alla produzione di anafilatossina, al reclutamento di leucociti e alla conseguenza infiammazione. Nei topi carenti del recettore del complemento, la lesione laser riduce il reclutamento di fagociti mononucleari e l’area di neovascolarizzazione coroiroidale indotta dal laser (CNV)17. Allo stesso modo, il recettore della chemiochina con motivo C-C 2 (CCR2) topo knockout, che è carente nel reclutamento di monociti nel tessuto, dimostra sia la diminuzione del reclutamento di fagociti mononucleari che l’area CNV indotta dal laser18. Questi dati collegano complementi e fagociti mononucleari con CNV sperimentale e possibilmente AMD neovascolare. A sostegno di questa associazione, i recettori del complemento sono disregolati sui monociti del sangue periferico in pazienti con AMD neovascolare19,20. Questi dati dimostrano una forte associazione tra AMD e fagociti mononucleari.
In questo manoscritto, useremo il modello sperimentale CNV indotto dal laser per caratterizzare le popolazioni di fagociti mononucleari nell’occhio del topo usando citometria a flusso multi-parametro. La CNV indotta dal laser è il modello standard di topo dell’AMD neovascolare, che ha dimostrato l’efficacia dell’attuale terapia amd neovascolare di primalinea 21. Questo protocollo descriverà l’enucleazione degli occhi del topo, la dissezione oculare, la digestione in una singola sospensione cellulare, la colorazione degli anticorpi, la determinazione delle tensioni laser utilizzando controlli a colori singoli e la strategia di gating utilizzando controlli di fluorescenza meno uno (FMO). Per una descrizione dettagliata del modello CNV indotto dal laser, si veda una pubblicazione precedente22. Utilizzando questo protocollo, definiremo microglia, monociti, cellule dendritiche e popolazioni di macrofagi. Inoltre, utilizzeremo MHCII e CD11c per definire ulteriormente sottoinsiemi di macrofagi all’interno del modello CNV indotto dal laser.
Protocol
Representative Results
Discussion
La citometria a flusso multi-parametro consente l’analisi quantitativa di più tipi di cellule in un tessuto complesso. In questo rapporto, descriviamo il rilevamento citometrico del flusso delle popolazioni di fagociti mononucleari, inclusi monociti, cellule dendritiche e sottoinsiemi di macrofagi, dopo lesioni laser nell’occhio del topo. Liyanage et al ha recentemente riportato una strategia di gating simile per rilevare neutrofili, eosinofili, linfociti, PC, macrofagi, macrofagi infiltrati e monociti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JAL è stato supportato dalla sovvenzione NIH K08EY030923; Il CMC è stato supportato da una sovvenzione K01 (5K01AR060169) del NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases e da un Novel Research Grant (637405) della Lupus Research Alliance.
Materials
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
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