Summary
Dit protocol biedt een methode om hele ogen te verteren tot een suspensie met één cel met het oog op cytometrische analyse van de multiparameterstroom om specifieke oculaire mononucleaire fagocytische populaties te identificeren, waaronder monocyten, microglia, macrofagen en dendritische cellen.
Abstract
Het aangeboren immuunsysteem speelt een belangrijke rol in de oculaire pathofysiologie, waaronder uveïtis, diabetische retinopathie en leeftijdsgebonden maculadegeneratie. Aangeboren immuuncellen, met name mononucleaire fagocyten, drukken overlappende celoppervlakmarkers uit, wat het identificeren van deze populaties een uitdaging maakt. Multi-parameter flow cytometrie maakt de gelijktijdige, kwantitatieve analyse van meercellige oppervlaktemarkers mogelijk om monocyten, macrofagen, microglia en dendritische cellen in muisogen te onderscheiden. Dit protocol beschrijft de enucleatie van hele muisogen, oculaire dissectie, spijsvertering in een suspensie met één cel en kleuring van de eencellige suspensie voor myeloïde celmarkers. Daarnaast leggen we de juiste methoden uit voor het bepalen van spanningen met behulp van enkele kleurregelaars en voor het afbakenen van positieve poorten met behulp van fluorescentie minus één bedieningselementen. De belangrijkste beperking van multi-parameter flow cytometrie is de afwezigheid van weefselarchitectuur. Deze beperking kan worden overwonnen door multiparameterstroomcytometrie van individuele oogcompartimenten of complementaire immunofluorescentiekleuring. Immunofluorescentie wordt echter beperkt door het gebrek aan kwantitatieve analyse en het verminderde aantal fluorforen op de meeste microscopen. We beschrijven het gebruik van multiparametrische flowcytometrie om zeer kwantitatieve analyse van mononucleaire fagocyten in laser-geïnduceerde choroïdale neovascularisatie te bieden. Bovendien kan multiparameterstroomcytometrie worden gebruikt voor de identificatie van macrofaagsubsets, fate mapping en celsortering voor transcriptomische of proteomische studies.
Introduction
Het aangeboren immuunsysteem omvat meerdere celtypen die complementactivatie en ontsteking stimuleren. Aangeboren immuuncellen omvatten natural killer (NK) cellen, mestcellen, basofielen, eosinofielen, neutrofielen en mononucleaire fagocyten. Mononucleaire fagocyten, die zijn samengesteld uit monocyten, macrofagen en dendritische cellen, zijn betrokken bij de pathofysiologie van meerdere oogheelkundige aandoeningen, waaronder uveïtis, diabetische retinopathie en leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD)1. In dit protocol zullen we ons richten op de identificatie van mononucleaire fagocyten met behulp van multi-parameter flow cytometrische analyse in een muismodel van neovasculaire AMD2. Dit protocol is aanpasbaar voor muismodellen van diabetische retinopathie en/of uveïtis, maar uitgebreidere oculaire dissectie wordt aanbevolen vanwege de systemische aard van deze ziekten.
Mononucleaire fagocyten drukken overlappende celoppervlakmarkeringen uit. Ingezeten macrofagen en microglia van langdurig weefsel zijn afkomstig van de van de dooierzak afgeleide erytromyeloïde voorloper3, terwijl recycling van macrofagen en dendritische cellen zich onderscheidt van de van beenmerg afgeleide macrofaagdendritische celveredelvader4. Muisceloppervlakmarkeringen die gebruikelijk zijn voor monocyten, macrofagen en dendritische cellen omvatten CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17en de intracellulaire marker Iba18. Om deze uitdaging het hoofd te bieden, definieert transcriptomische analyse van macrofagen, monocyten en dendritische cellen uit meerdere weefsels CD64 als een macrofaagspecifieke celoppervlakmarker6. Macrofagen zijn beschreven in de iris, choroïde, ciliaire lichaam en oogzenuw in gezonde ogen3. Als alternatief is dendritische celidentificatie moeilijker; de meest specifieke methode voor dendritische celidentificatie vereist lottoewijzing met behulp van de Zbtb46-GFP-reportermuis9. Onafhankelijk van deze melderlijn kan de expressie van CD11c en MHCII in combinatie met de afwezigheid van CD64 potentiële dendritische cellen6,10identificeren . Dendritische cellen zijn geïdentificeerd in hoornvlies, conjunctiva, iris en choroïd in normale ogen11. Microglia zijn gespecialiseerde macrofagen in het netvlies, beschermd door de bloed-retinale barrière, en afgeleid van dooierzak voorloper cellen12. Als gevolg hiervan kan retinale microglia worden onderscheiden van monocyten-afgeleide macrofagen door hun dimniveaus van CD45-expressie13 en hoge niveaus van Tmem119, die beschikbaar is als een flowcytometrie-antilichaam14. Bij microglia-activering kan CD45 echter up-regulated15 zijn en Tmem119 kan down-regulated3zijn , wat de complexiteit van microgliabiologie aantoont en dit is waarschijnlijk relevant in zowel AMD als het muismodel. Ten slotte kunnen monocyten worden onderverdeeld in ten minste twee subtypen, waaronder klassiek en niet-klassiek. Klassieke monocyten tonen CCR2+Ly6ChogeCX3CR1lage expressie, en niet-klassieke monocyten tonen CCR2-Ly6ClageCX3CR1hoge markers5.
Vanwege de noodzaak van de kwantitatieve analyse van markerexpressie, d.w.z. hoge versus lage/dimniveaus, is multiparameterstroomcytometrie de ideale methode voor discriminatie tussen monocyten, macrofagen, microglia en dendritische cellen in het oog en andere weefsels. Extra voordelen zijn de identificatie van subpopulaties, de mogelijkheid om fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om celpopulaties te sorteren voor transcriptomische of proteomische analyse, en lottoewijzing. Het grootste nadeel van multi-parameter flow cytometrie is het gebrek aan weefselarchitectuur. Dit kan worden overwonnen door de oogheelkundige dissectie in de verschillende oogsubcompartementen: hoornvlies, conjunctiva, iris, lens, netvlies en choroid-sclera-complex. Bovendien kan bevestigende immunofluorescentiebeeldvorming worden uitgevoerd, maar wordt deze beperkt door het aantal markers en het gebrek aan robuuste kwantificering.
Genoombrede associatiestudies hebben meerdere complementgenen gekoppeld aan AMD16. Complement activering leidt tot anafylaxie productie, leukocyten rekrutering, en resulterende ontsteking. Als aanvulling op receptordeficiënte muizen vermindert laserletsel mononucleaire fagocytenwerving en lasergeïnduceerde choroïdale neovascularisatie (CNV) gebied17. Evenzo toont het C-C-motief chemokine receptor 2 (CCR2) knock-outmuis, die een tekort heeft aan monocytenwerving aan het weefsel, zowel verminderde mononucleaire fagocytenwerving als lasergeïnduceerde CNV-gebied18. Deze gegevens koppelen complementaire en mononucleaire fagocyten aan experimentele CNV en mogelijk neovasculaire AMD. Ter ondersteuning van deze associatie worden complementreceptoren gedyreguleerd op perifere bloedmonocyten bij patiënten met neovasculaire AMD19,20. Deze gegevens tonen een sterke associatie aan tussen AMD en mononucleaire fagocyten.
In dit manuscript zullen we het experimentele lasergeïnduceerde CNV-model gebruiken om de mononucleaire fagocytenpopulaties in het muisoog te karakteriseren met behulp van multiparameterstroomcytometrie. Lasergeïnduceerde CNV is het standaard muismodel van neovasculaire AMD, dat de werkzaamheid van de huidige eerstelijns neovasculaire AMD-therapieaantoonde 21. Dit protocol beschrijft enucleatie van muisogen, oculaire dissectie, spijsvertering in een eencellige suspensie, antilichaamkleuring, bepaling van laserspanningen met behulp van enkele kleurregelaars en gatingstrategie met behulp van fluorescentie minus één (FMO) bedieningselementen. Voor een gedetailleerde beschrijving van het lasergeïnduceerde CNV-model, zie een eerdere publicatie22. Met behulp van dit protocol definiëren we microglia, monocyten, dendritische cellen en macrofaagpopulaties. Verder zullen we MHCII en CD11c gebruiken om macrofaagsubsets verder te definiëren binnen het lasergeïnduceerde CNV-model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee. C57BL/6 muizen werden gegroepeerd in een barrièrefaciliteit in het Center for Comparative Medicine van de Northwestern University (Chicago, IL). Alle dieren waren gehuisvest in 12/12 uur lichte / donkere cyclus met gratis toegang tot voedsel en water.
1. Verzameling van oogweefsel
- Offer 10-12 weken oude C57BL/6J muizen van beide geslachten met gereguleerde toediening van kooldioxide totdat de muis niet meer reageert en niet meer inademt. Voer cervicale dislocatie of een andere goedgekeurde secundaire methode uit om euthanasie te garanderen.
OPMERKING: Transcardiale perfusie kan worden uitgevoerd om circulerende leukocyten te verwijderen die zich niet in de oogweefsels bevinden. In dit experiment vermindert systemische perfusie niet het aantal microglia, monocyten, macrofagen of dendritische cellen gedetecteerd in onbehandelde of laserbehandelde hele ogen. Daarom bevinden de meeste van deze celtypen zich in de oogweefsels en deze stap is optioneel. - Om de ogen te enucleeren, duwt u in de buurt van de oogkas terwijl u een paar gebogen tangen zachtjes onder het oog plaatst terwijl deze uit de socket valt. Knijp de tang gesloten onder het oog zonder het eigenlijke oog te knijpen. Losmaken van het oog van het omringende conjunctiva (zie voorafgaande publicatie)23.
- Trek het oog zijdelings totdat de oogzenuw de enige overgebleven verbinding is om het oog los te maken. De oogzenuw snijdt vaak met spanning, maar een kleine schaar is soms nodig om de oogzenuw te snijden. Plaats het oog in koude 1x Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) met calcium en magnesium in 1,7 ml microcentrifugebuis.
2. Vertering van oogweefsel
- Bereid de vergistingsbuffer voor met 0,1 mg/ml vergistingsenzym en 0,2 mg/ml DNase in koude HBSS. Reconstitueer in eerste instantie 5 mg vergistingsenzym in 2 ml steriel water. Bereid een initiële verdunning van 10 mg/ml DNase in HBSS. Meng voor elke 10 ml van de vergistingsbuffer (voldoende voor 3 dieren) 9,4 ml koude HBSS met 0,4 ml gereconstitueerd spijsverteringsenzym en 0,2 ml verdund DNase I.
OPMERKING: Deze concentraties werden empirisch bepaald over meerdere experimenten om optimale niveaus van antilichaamkleuring van afzonderlijke cellen te bieden, terwijl de celdood werd verminderd. Collagenase D werd geprobeerd als alternatief voor spijsverteringsenzym met verminderde levensvatbaarheid van cellen en verminderde CD45+ cellen. Zie Discussie voor meer informatie over het iteratieve proces om de spijsvertering te optimaliseren. - Verwijder onder een ontledende microscoop bij 10x totale vergroting het resterende bindvlies en de oogzenuw met behulp van fijne tang en veerschaar in koude HBSS.
- Beweeg schone ogen naar een droge ontleedschaal of kleine weegboot. Injecteer 0,15-0,20 ml/oog van de spijsverteringsbuffer via een spuit met een naald van 30 G in de glasholte nadat er twee perforerende wonden in het oog zijn gemaakt via de visuele as en 90° van deze eerste wond voor het uitdrijven van de spijsverteringsbuffer.
- Gehakt hele ogen met behulp van een veerschaar en fijne tang met alle stukken kleiner dan 0,5 mm x 0,5 mm. Dissocieer lensweefsel met stompe mechanische verstoring via een tang om verstopping van pipetpunten in volgende stappen te voorkomen. Spoel voor elk monster de tang en schaar elk met 0,75 ml vergistingsbuffer in een kleine schaal. Gebruik voor elk monster een nieuw gerecht.
- Breng de inhoud van de schaal over in een dissociatiebuis op ijs met behulp van P1000 pipet en zorg ervoor dat er geen materiaal verloren gaat in de pipetoverdracht. Spoel de schaal af met een extra 1,5 ml vergistingsbuffer die het totale volume in de dissociatiebuis op 3,25-3,50 ml brengt.
- Plaats de dissociatiebuis omgekeerd op elektronische dissociator en voer cyclus "m_brain_03_01", bestaande uit 1 min unidirectionele rotatie bij 200 tpm bij kamertemperatuur, wat een vooraf geladen programma is. Zorg ervoor dat al het weefsel zich aan de onderkant van de dissociatiebuis bevindt in contact met de spijsverteringsbuffer en de rotor voor deze en alle resterende stappen.
- Plaats de dissociatiebuis gedurende 30 minuten in de schudincubator bij 200 tpm bij 37 °C.
- Herhaal stap 2.6 en 2.7 nog één keer. Na de tweede incubatie van 30 minuten voert u een laatste mechanische vergisting uit met behulp van elektronische dissociator zoals in stap 2.6.
- Stop de reactie door 10 ml koudestroombuffer toe te voegen en buizen op ijs te plaatsen.
3. Voorbereiding van celsuspensie
- Om eencellige suspensie te creëren, giet je de gestopte oogverteringsreactie door een filter van 40 μm dat bovenop een conische centrifugebuis van 50 ml is geplaatst. Duw met behulp van de zuiger uit een spuit van 2,5 ml alle resterende stukjes onverteerde oogweefsel door het filter.
- Was de dissociatiebuis met 10 ml Flow-buffer en spoel het filter voordat u dezelfde zuiger gebruikt om opnieuw onverteerde oogweefselstukken door het filter te laten gaan.
- Herhaal stap 3.2 met 5 ml flowbuffer.
- Was de dissociatiebuis en filter met een laatste 10 ml flowbuffer.
OPMERKING: Het totale volume van de vergistings- en debietbuffer is ongeveer 38-40 ml voor elk monster. - Centrifugeer de conische buis bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Decanteer het supernatant zonder de celkorrel te storen.
- Bereid 1x lyseeroplossing door 10x lyseeroplossing toe te voegen aan steriel water. Breek de pellet af door de buis tegen een andere buis te flikkeren. Om rode bloedcellen te lyseren, voeg 1 ml 1x lyseeroplossing toe gedurende 30 s met wervelen bij kamertemperatuur (RT).
- Stop de reactie met 20 ml Flow buffer.
- Centrifugeer de conische buis bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Decanteer het supernatant zonder de celkorrel te storen.
- Dissocieer de pellet door buis tegen een andere buis te flikkeren. Voeg 5 ml koude 1x HBSS per tube toe.
- Centrifugeerbuizen bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Aspirate supernatant.
4. Kleuring van celsuspensie voor mononucleaire fagocyten
- Bereid 0,5 ml Live/Dead-vlek per monster door Live/Dead dye 1:5.000 te verdunnen in koude HBSS.
- Voeg live/dode vlekken toe aan elk monster met behulp van een P1000 pipet en zorg ervoor dat u de pellet volledig loskoppelt. Breng monsters over naar 1,2 ml micro-titerbuizen.
- Neem een kleine aliquot (10 μL) om cellen te tellen met behulp van een hemocytometer of automatische celteller (zie 4.4). Incubeer monsters met Live/Dead vlek gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Tel cellen met Trypan blauw om het aantal levende cellen per monster te bepalen.
OPMERKING: Meestal bevatten 2 ogen van een 10-12 weken oude C57BL/6J-muis minder dan 2 x 106 levende cellen. - Was monsters door 400 μL koude flowbuffer toe te voegen. Centrifugeerbuizen in een micro titer buisrek bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Aspirateer de supernatant zonder de celkorrel te storen.
- Resuspend cellen volledig in 500 μL koude Flow buffer. Centrifugeerbuizen in een micro titer buisrek bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Aspirateer de supernatant zonder de celkorrel te storen.
- Blokkeer tot 5 x 106 levende cellen in 50 μL Fc blok (1:50 verdunning in koude Flow buffer van gezuiverde rat anti-muis CD16/CD32). Als er meer dan 5 x 106 levende cellen zijn, verhoog dan de volumes op de juiste manier.
- Voeg het Fc-blok toe aan de pellet en zorg ervoor dat u het monster volledig loskoppelt. Incubeer gedurende 20 min bij 4 °C.
- Voeg 50 μL antilichaamkleuroplossing toe (zie tabel 1 voor keuze en hoeveelheid van elk antilichaam dat in de oplossing is opgenomen) per 5 x 106 levende cellen rechtstreeks aan cellen in Fc-blok en meng volledig. Incubeer gedurende 30 min bij 4 °C.
OPMERKING: Antilichaamhoeveelheden zijn afhankelijk van de configuratie van de flowcytometer en moeten onafhankelijk worden getitreerd voor elk laboratorium en instrument. Zie tabel 2 voor de instrumentconfiguratie van filters en spiegels. Om antilichamen te titreren, begint u met de aanbeveling van de fabrikant en berekent u de kleuringsindex. Voer een testrun uit van verschillende antilichaamconcentraties (zowel boven als onder de aanbeveling van de fabrikant) en kies de laagste concentratie antilichamen waar de kleuringsindex wordt gehandhaafd. Zorg er ook voor dat positieve kleuring minder helder is dan de single-color controle. Gebruik niet-opgeslagen cellen om ervoor te zorgen dat negatief bevlekte cellen op schaal zijn en een piek hebben van of minder dan 1 x 102. Gebruik een fluorescentie minus één controle om de positief bevlekte cellen te definiëren. - Was monsters door 700 μL koude flowbuffer toe te voegen. Centrifugeerbuizen in een micro titer buisrek bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Aspirateer de supernatant zonder de celkorrel te storen.
- Optioneel kunnen de monsters na het beitsen van antilichamen worden bevestigd met 500 μL van 2% paraformaldehyde in flowbuffer. Bevestig monsters gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Voer vervolgens één wasbeurt uit zoals beschreven in 4.10. Bewaar vaste monsters op 4 °C. Telparels moeten worden toegevoegd op de dag van het verzamelen van stroomcytometriegegevens. Vaste monsters moeten binnen 1-2 dagen op de flowcytometer worden uitgevoerd.
LET OP: Paraformaldehyde is corrosief en een gevaar voor de gezondheid. - Was de monsters opnieuw met 500 μL koude flowbuffer. Centrifugeerbuizen in een micro titer buisrek bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Aspirateer de helft van de supernatant zonder de celkorrel te verstoren.
- Resuspend pellets en overdracht naar een 96 put, U-bodem testplaat. Centrifugeerplaat op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Om de supernatant te decanteren, draait u de plaat om en in één sterke shake onttrekt u de vloeistof in een gootsteenbekken, zonder de pellet te storen.
- Plaats in een nieuwe 1,2 ml microtiterbuis 50 μL goed gekolkte telparels.
- Resuspend pellets in 96 putplaat in 200 μL koude Flow buffer. Voeg vanaf de vorige stap celmengsel toe aan de bovenkant van kralen. Run op flow cytometer in totaal volume van 250 μL / micro titer tube.
5. Verzameling van stroomcytometriegegevens
- Schakel flowcytometer in en bereid deze voor. De hier vermelde instructies zijn voor een gewijzigde vierlasercytometer (tabel 2).
- Voer een testmonster uit, dat een kleine aliquot van elk monster bevat, om ervoor te zorgen dat alle cellen voor elke detector op schaal zijn. Stel de spanningen zo in dat alle cellen op schaal zijn.
- Voer enkele kleurregelaars (SCC) uit voor elke fluorfore die wordt gebruikt in kleuringscocktail(tabel 3). Plaats micro titer buis in een grotere 5 ml polystyreen buis voor plaatsing op de flow cytometer fase.
OPMERKING: Wortelfluorforen zoals BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) en Alexa700 hebben niet hetzelfde antilichaam nodig als de cocktail (d.w.z. CD19 PE voor CD64 PE). Tandemfluorforen zoals PE-CF594, PE-Cy7 of APC-Cy7 vereisen echter hetzelfde antilichaam voor SCC als cocktail vanwege mogelijke dissociatie van de geconjugeerde fluorforen.- Maak de SCC voor BV421 door 2 druppels compensatieparels toe te voegen aan een 1,2 ml titerbuis samen met 1 μL hamster anti-muis CD11c BV421. Compensatieparels worden gebruikt omdat CD11c BV421 een IgG lambda subtype is in plaats van kappa zoals beschreven in 5.3.3. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C. Voeg 0,2 ml stroombuffer toe.
- Maak de SCC voor de Live/Dead kleurstof door één druppel positieve vlekken (groene dop) van de amine reactieve kralen toe te voegen, gevolgd door 1 μL Live/Dead kleurstof. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg een druppel van de negatieve kralen (witte dop) van de amine reactieve kralen toe. Voeg 0,2 ml stroombuffer toe.
- Maak de resterende SCC's door één druppel positieve vlekken (groene dop) toe te voegen uit de anti-rat en anti-hamster Ig kappa kralenset, gevolgd door de vermelde antilichaamhoeveelheid (tabel 3) in een 1,2 ml titerbuis. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C. Voeg een druppel van de negatieve kralen (witte dop) van de anti-rat en anti-hamster Ig kappa kraal set toe. Voeg 0,2 ml stroombuffer toe.
- Vortex alle kralenmengsels volledig. Bewaar SCC's tot 3 dagen bij 4 °C.
OPMERKING: De SCC voor fluorescerende reportermuizen is onbevlekte cellen. - Stel bij het uitvoeren van SCC's spanningen zo in dat het SCC-monster een piek heeft die groter is dan een fluorescentie voor een monster van cellen in hetzelfde detectorkanaal. Bovendien moeten spanningen zo worden ingesteld dat elke SCC ten minste een 0,5 Log-verschil heeft tussen de histogrampiek in het interessant kanaal ten opzichte van een ander kanaal (figuur 1).
- Voer monsters uit op "Low" keeping events/second onder de 4000. Als het debiet niet op de juiste manier kan worden verlaagd, verdun dan monsters met extra koudestroombuffer. Noteer het toegevoegde volume omdat dit nodig is voor de tellingsberekening (zie representatieve resultaten).
- Verzamel ten minste 3 x 106 gebeurtenissen per monster. Dit kan hoger zijn dan het celnummer als gevolg van pigmentkorrels en vuiltellingen als gebeurtenissen op uw cytometer.
- Neem een fluorescentie minus één (FMO) op voor elke andere fluorfore dan Live/Dead voor een goede gatingstrategie in rubriek 6.4. Een FMO is een monster dat is bevlekt met alle fluorforen behalve één.
- Reinig en schakel de stroomcytometer uit volgens de instructies van de fabrikant of faciliteit.
6. Annotatie van flowcytometriegegevens
- Open een nieuw werkblad met behulp van analysesoftware. Importeer FCS-bestanden uit cytometer voor alle monsters en besturingselementen met één kleur.
- Gebruik SCC's om een compensatiematrix te maken.
- Pas de compensatiematrix toe op uw bevlekte monsters en VBO's.
- Gebruik de VBO's om positieve vlekken te bepalen om poorten te tekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toonde niet-gecompenseerde frequentie histogrammen voor de SCC's en cellen voor de rode laser: Alexa647, Alexa700 en APC-Cy7. In figuur 1Atoonde de magentalijn de piek van de SCC voor Alexa647, terwijl de cyaanlijn het beoogde 0,5 Log-verschil liet zien. Merk op dat de piek in Alexa700 en APC-Cy7 links (minder helder) van de cyaanlijn was. Merk ook op dat de cellen allemaal links van de magentalijn stonden. Cellen rechts van de SCC-piek werden niet gecompenseerd. Van specifieke kanalen was bekend dat ze in anderen terechtkwamen op basis van de chemie van de fluorchrome kleurstoffen (d.w.z. Violet Laser: BV421 -> V500, Geelgroene Laser: PE -> PE-CF594, Rode Laser: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, Cross Laser: PE-Cy7 -> APC-Cy7). Als niet aan een van de bovenstaande voorwaarden werd voldaan, kon de spanning van één kanaal naar boven worden aangepast, terwijl eventuele morskanalen naar beneden konden worden verplaatst. Zie figuur 1B en figuur 1C voor aanvullende voorbeelden van de rode laser. Zodra de spanningen zijn bepaald en vervolgens zijn geregistreerd, moeten alle monsters worden uitgevoerd met de spanningsparameters. Er bestaat een wizard voor het instellen van compensatie en kan nuttig zijn.
Telling kraal identificatie is noodzakelijk voor de kwantificering van celtellingen. Figuur 2A toonde FSC-A vs SSC-A eigenschappen voor alle geanalyseerde gebeurtenissen vanaf twee ogen van één muis. Het is belangrijk om de SSC-spanning aan te passen om ervoor te zorgen dat uw telparels zichtbaar zijn als een zeer strakke verzameling SSC-Ahoge en FSC-Alage gebeurtenissen. Kralentellingen werden gereinigd en bevestigd door PE vs APC-Cy7 (fig. 2B) te plotten. Schone kralen waren een strakke cluster van PE+ en APC-Cy7- evenementen.
Singlets en levende cellen werden vervolgens geïdentificeerd aan de hand van alle gebeurtenissen. Singlets werden bepaald door FSC-H vs FSC-A te plotten. Singlets waren positief gecorreleerd in deze twee eigenschappen, terwijl doublet- en tripletcellen een grotere FSC-A hadden dan FSC-H (figuur 2C). Live cellen werden afgebakend door Live / Dead vs FSC-A te plotten. Dode cellen waren Live / Dead positive, en cellen vertonen een grotere FSC-A dan puin (Fig 2D). Merk op dat telparels Live / Dead+ waren en bij deze stap werden verwijderd.
Figuur 3 toont de initiële gatingstrategie voor de afbakening van mononucleaire fagocyten uit levende, singletcellen. Live singlets werden gevisualiseerd met behulp van een CD45 versus CD11b plot(figuur 3, links). Merk op dat CD45+CD11b- (meestal B-cellen en T-cellen), CD45dimCD11b+ (putatieve microglia) en CD45+CD11b+ cellen (infiltreren van immuuncellen, verhoogd met laser [Fig 3B, links]) werden geselecteerd. De afwezigheid van CD45+ cellen in de CD45 FMO bevestigde de poortselectie (figuur 3C, links). Vervolgens werden neutrofielen, eosinofielen, B-cellen, NK-cellen en T-cellen uitgesloten door CD45+ levende singlets te plotten met behulp van Lineage gate (Lin: Ly6G [neutrofielen], SiglecF [eosinofielen], B220 [B-cellen], NK1.1 [NK-cellen], CD4 [T-cellen] en CD8 [T-cellen]) versus CD11b. De toename van CD11b+Lin- cellen tussen Geen Laser(Figuur 3A,midden) en Laser(Figuur 3B,midden) groepen werd gemakkelijk waargenomen. Let op het ontbreken van CD11b+Lin-cellen in de CD11b FMO(figuur 3C,midden) en het ontbreken van Lin+ cellen in de Lin FMO(figuur 3C,rechts). Microglia kan worden gescheiden van het infiltreren van mononucleaire fagocyten door de hoeveelheid CD45-expressie13,24. CD11b+Lin- cellen werden gevisualiseerd met behulp van een CD11b vs CD45 plot om CD45dim putative microglia en CD45hoge infiltrerende mononucleaire fagocyten te identificeren. De relatieve toename van CD45hoge mononucleaire fagocyten was duidelijk in de laserbehandelde muis (figuur 3A,B, rechts).
Figuur 4 identificeerde microglia, drie macrofaagsubsets, monocyten en dendritische cellen. Microglia werden bepaald door CD45dimcellen te plotten op een CD64 vs MHCII plot(figuur 4, linkerpaneel). Microglia bleek cd64+MHCIIlaag te zijn voorheen13. Microglia was relatief onveranderd met laser en afwezig in de CD64 FMO(figuur 4A,C links). CD45hoge cellen werden vervolgens geplot op dezelfde CD64 vs MHCII grafiek. CD64+MHCII- macrofagen (MHCII- Macs), CD64-MHCII- monocyten en MHCII+ cellen werden geïdentificeerd (figuur 4A,B, midden links). Let op de afwezigheid van MHCII+ cellen in de MHCII FMO (figuur 4C, midden links). MHCII+ cellen werden verder gediscrimineerd met behulp van CD64 en CD11c. CD64+CD11c- macrofagen (CD11c- Macs), CD64+CD11c+ macrofagen (CD11c+ Macs) en CD64-CD11c+ dendritische cellen (DC's) werden gedefinieerd (figuur 4A,B, midden rechts). Let op de afwezigheid van CD11c+ cellen in de CD11c FMO(figuur 4C, midden rechts). Monocyten werden gesubtypeerd als klassiek Ly6C+ of niet-klassiek Ly6C- monocyten (figuur 4, rechts). Let op de afwezigheid van Ly6C+ monocyten in de Ly6C FMO (figuur 4C, rechts).
Het aantal cellen per muis (of per 2 ogen) werd berekend met de volgende vergelijking:
Met behulp van de volumes in deze methode is de vergelijking:
Het aantal cellen en het aantal kralen zijn specifiek voor elk monster. De concentratie kralen is specifiek voor elke partij telparels en wordt door de fabrikant op elke flacon geleverd.
Macrofagen infiltreren de choroïde na laserletsel25, en macrofaagdepletie vermindert CNV-gebied18. Deze oudere studies zijn gebaseerd op immunofluorescentie-beeldvorming, die mononucleaire fagocyten niet betrouwbaar kan onderscheiden, of minder stroomcytometrische markers voor macrofaagidentificatie. Macrofaag heterogeniteit is een opkomend concept in aangeboren immunologie, waarbij macrofagen in staat zijn meerdere functies uit te voeren, afhankelijk van hun oorsprong en weefselmicromilieu12,26. We hebben multi-parameter flow cytometrie uitgevoerd op onbehandelde en laserbehandelde muisogen op dag 3 na laserletsel om mononucleaire fagocyten en macrofaag heterogeniteit te identificeren. Laserbehandeling verhoogde MHCII-, CD11c-, en CD11c+ macrofagen met respectievelijk 7,0-25,6, 2,8-7,2 en 3,9-8,2 maal (figuur 5A,C). Dendritische celtellingen waren ook up-regulated 4,5-4,7-voudig door laser (Figuur 5F). Het aantal microglia's en monocyten werd niet beïnvloed door laserbehandeling (figuur 5D,E). Voorafgaand aan de enucleatie werden geen significante verschillen met of zonder systemische perfusie gedetecteerd. Deze resultaten tonen verhoogde macrofaagpopulaties en dendritische cellen aan na laserletsel zonder verandering in microglia of monocyten. Bovendien benadrukken deze gegevens hoe multiparameterstroomcytometrie macrofaag heterogeniteit kan detecteren.
| Antilichaam of buffer | Fluorfore | Kloon | Hoeveelheid per monster (ng) |
| rat anti-muis Ly6C | Fitc | AL-21 jaar | 15 |
| muis anti-muis CD64 | Pe | X54-5/7.1 | 40 |
| rat anti-muis Tim4 | AlexaFluor | RMT4-54 | 300 |
| hamster anti-muis CD11c | BV 421 | HL3 | 300 |
| rat anti-muis Ly6G | PE-CF594 | 1A8 | 10 |
| muis anti-muis NK1.1 | PE-CF594 | PK136 | 10 |
| rat anti-muis Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 20 |
| rat anti-muis B220 | PE-CF594 | RA3-6B2 | 20 |
| rat anti-muis CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | 40 |
| rat anti-muis CD4 | PE-CF594 | RM4-5 | 20 |
| rat anti-muis MHC II | AlexaFluor | M5/114.15.2 | 2.5 |
| rat anti-muis CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 2 |
| rat anti-muis CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 6 |
| MACS-buffer |
Tabel 1: Antilichaamfluorfore en klonen (zie stap 4.9). Over het algemeen is één monster een of twee verteerd ogen. Voeg eerst stroombuffer toe aan een buis en vervolgens aan elk antilichaam. Verdunningen kunnen worden gemaakt om te voorkomen dat een te klein volume wordt gepijpt, terwijl het totale stroombuffervolume op de juiste manier wordt gewijzigd. Zie Tabel met materialen voor productnummer en bedrijf.
| Laser | PMT-sleuf | Filter | Spiegel | Kleuren |
| Violet (405nm) | A | 525/50 | 505LP | V500 of AmCyan |
| B | 450/50 | Pacific Blue, eFluor 450, V450 of BV421 | ||
| Blauw (488nm/FSC) | A | 710/50 | 685LP | PerCP-Cy5.5, PerCP, PI of 7AAD |
| B | 525/50 | 505LP | FITC, CFSE, GFP of AlexaFluor 488 | |
| C | 488/10 | Ssc | ||
| Geelgroen (561nm) | A | 780/60 | 735LP | PE-Cy7 |
| B | 610/20 | 600LP | PE-CF594, mCherry of DsRed2 | |
| C | 582/15 | Pe | ||
| Rood (640nm) | A | 780/60 | 735LP | APC-Cy7, APC-H7 of APC-eFluor 780 |
| B | 730/45 | 690LP | AlexaFluor | |
| C | 670/30 | APC of AlexaFluor 647 |
Tabel 2: Configuratie van debietcytometer. Filter- en spiegelopstelling voor een vierlasercytometer en de beschikbare fluorforen die in elk kanaal kunnen worden gedetecteerd. PMT = fotomultiplicatorbuis, FSC = voorwaartse verstrooiing, SSC = zijverstrooiing.
| Antilichaam | Fluorfore | Kloon | Bedrag per SCC (ng) |
| rat anti-muis CD45 | Fitc | 30-F11 | 500 |
| rat anti-muis CD19 | Pe | 1D3 | 40 |
| rat anti-muis Tim4 | AlexaFluor | RMT4-54 | 100 |
| hamster anti-muis CD11c | BV421 | HL3 | 200 |
| rat anti-muis Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 40 |
| rat anti-muis CD19 | AlexaFluor | 1D3 | 200 |
| rat anti-muis CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 200 |
| rat anti-muis CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 200 |
| Live / Dode Kleurstof | eFluor 506 | N/a | 1 μl |
Tabel 3: Antilichaamfluorfore en klonen voor besturingselementen met één kleur. Elk antilichaam moet worden toegevoegd aan de passende compensatiekraal zoals beschreven in de stappen 5.3.1 – 5.3.3.
Figuur 1: Representatieve spanning ingesteld voor de rode laser. (A) Single color controls (SCCs) voor Alexa647. Aan de linkerkant wordt de SCC voor Alexa647 weergegeven. Het linker midden toont het morsen van de Alexa647 SCC in het Alexa700-kanaal. De piek van de Alexa647 SCC wordt weergegeven in magenta en het 0.5 Log-doelverschil wordt weergegeven in cyaan. Merk op dat de piek links is (minder helder) dan de cyaanlijn. Midden rechts demonstreert het morsen van de Alexa647 SCC in het APC-Cy7-kanaal. Rechts illustreert de cellen in het Alexa647-kanaal. Houd er rekening mee dat alle cellen minder helder zijn dan de SCC (magentalijn). (B) SCC voor Alexa700. Links midden toont de SCC voor Alexa700. Links toont het morsen van de Alexa700 SCC in het Alexa647-kanaal. Midden rechts demonstreert de lekkage van de Alexa700 SCC in het APC-Cy7-kanaal. De piek van de Alexa700 SCC wordt weergegeven in magenta en het 0.5 Log-doelverschil wordt weergegeven in cyaan. Merk op dat de piek links is (minder helder) dan de cyaanlijn. Rechts illustreert de cellen in het Alexa700-kanaal. Houd er rekening mee dat alle cellen minder helder zijn dan de SCC (magentalijn). (C) SCC voor APC-Cy7. Links en midden links tonen de lekkage van de APC-Cy7 SCC in respectievelijk Alexa647 en Alexa700. Merk op dat beide pieken zich links van de cyaanlijn bevinden. Midden rechts toont de ACP-Cy7 SCC. Rechts illustreert de cellen in het APC-Cy7 kanaal. Houd er rekening mee dat alle cellen minder helder zijn dan de SCC (magentalijn). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve identificatie van telparels, singlets en levende cellen. (A) Zijverstrooiingsgebied (SSC-A) versus voorwaarts spreidingsgebied (FSC-A) voor alle cellen op een contourplot. Telling kralen worden geïdentificeerd door hoge SSC-A, lage FSC-A, en zeer strakke clustering van de uniforme kralen. (B) PE vs APC-Cy7 perceel voor schone kraal poort. De pijl tussen A en B geeft aan dat alleen de positieve gebeurtenissen van de telkraal worden geplot. Clean count kralen worden afgebakend door hoge PE en lage APC-Cy7 fluorescentie. (C) FSC-Height (FSC-H) vs FSC-Area (FSC-A) plot van alle cellen toont singlet cellen in een positief gecorreleerde brede lijn. Doubletten en andere veelvouden tonen een groter FSC-gebied dan FSC-hoogte. (D) Live / Dead vs FSC-A voor singlet cellen. Live cellen worden gedefinieerd als Live / Dead low en FSC-A positief. Percentages geven het percentage van de ouder aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve identificatie van mononucleaire fagocyten. Links: CD45 vs CD11b pseudocolor plot van levende cellen van ongelasereerde (A), gelaserd (B), en fluorescentie minus een (FMO) controle (C). Links: CD45+ cellen zijn gedefinieerd in A-B en afwezig in de FMO. Let op de toename van CD45+CD11b+ cellen in de gelaserde (B) groep. Midden: Pseudocolor plot van afstamming (Lin) marker vs CD11b voor CD45+ cellen. CD11b+Lin- cellen zijn afgebakend in A-B en ontbreken in de FMO voor CD11b (onder). Rechts: CD11b vs CD45 plot van CD11b+Lin- cellen. CD45dim en CD45hoge cellen worden geïdentificeerd. Let op de toename van CD45hoge cellen in de gelaserde (B) groep. Percentages geven het percentage van de ouder aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve identificatie van microglia, dendritische cellen, monocyten en macrofaagsubsets. Links: CD64 vs MHCII pseudocolor plot van CD45dimcellen definieert microglia als CD64+MHCIIlaag. Let op de vergelijkbare hoeveelheid microglia in niet-gelasereerde (A) en gelaserde (B) groepen, en de afwezigheid van microglia in de FMO-controle (C). Midden links: CD64 vs MHCII pseudocolor plot van CD45hoge cellen definieert MHCII- macrofagen als CD64+MHCII-, monocyten als CD64-MHCII-, en MHCII+ cellen. Let op de toename van MHCII- macrofagen in de gelaserde groep (B), de afwezigheid van MHCII+ cellen in de FMO (C, midden), en de CD64 FMO (C, links) hielp bij het bepalen van de cutoff voor CD64+ en CD64- cellen. Midden rechts: CD64 vs CD11c pseudocolor plot van MHCII+ cellen. CD11c- macrofagen werden gedefinieerd als CD64+CD11c-, CD11c+ macrofagen werden geïdentificeerd als CD64+CD11c+, en dendritische cellen (DC 's) werden afgebakend als CD64-CD11c+. Zowel macrofaagsubsets als dendritische cellen werden verhoogd met laser (B). Let op de afwezigheid van CD11c+ cellen in de FMO (C). Rechts: Ly6C vs Tim4 pseudocolor plot van monocyten. Klassiek Ly6C+ en niet-klassiek Ly6C- monocyten werden geïdentificeerd. Merk op dat klassieke Ly6C+ monocyten afwezig waren in de Ly6C FMO (C). Percentages geven het percentage van de ouder aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve gegevens voor mononucleaire fagocyten tussen ongelaserde en gelaserde muizen, zowel met als zonder systemische perfusie. MHCII- (A), CD11c- (B) en CD11c+ (C) macrofaagtellingen werden allemaal verhoogd met laser. Er werden geen veranderingen waargenomen tussen ongelasereerde en gelaserde microglia (D) of monocyten (E). Dendritische cellen (DC) werden ook verhoogd met laser (F). Brown Forsythe en Welch ANOVA met Dunnett's T3 meervoudige vergelijkingstest werden gebruikt om statistische verschillen te definiëren als gevolg van ongelijke verschillen tussen groepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multi-parameter flow cytometrie maakt de kwantitatieve analyse van meerdere celtypen in een complex weefsel mogelijk. In dit rapport beschrijven we de stroomcytometrische detectie van mononucleaire fagocytenpopulaties, waaronder monocyten, dendritische cellen en macrofaagsubsets, na laserletsel in het muisoog. Liyanage et al rapporteerden onlangs een vergelijkbare gating-strategie om neutrofielen, eosinofielen, lymfocyten, DC's, macrofagen, infiltrerende macrofagen en monocyten te detecteren27. Onze gating strategie verschilt voornamelijk door de toevoeging van CD64. Liyanage et al identificeert DC als CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ cellen, en macrofagen als CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- cellen. We identificeren DC als CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- cellen en macrofagen als CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD64+ cellen. Het gebruik van CD64 om DC te onderscheiden van macrofagen is goedingeburgerd 6, en deze strategie stelt ons in staat om macrofaag heterogeniteit te identificeren, inclusief CD11c + macrofagen. De belangrijkste beperking van deze methode is dat het geen gegevens verstrekt over weefselarchitectuur of de locatie van specifieke cellen in het oog. Om te bepalen of deze cellen zich in het netvlies, choroïd, iris of een andere oogstructuur bevinden, kan ons protocol worden gecombineerd met histologische methoden of worden gewijzigd om uitgebreidere oogheelkundige dissectie op te nemen om individueel multiparameterstroomcytometrie op elk oculaire subcompartement uit te voeren.
We hebben het protocol geoptimaliseerd voor de vertering van hele muisogen om elke variantie te voorkomen die ontstaat door dissectie. Dissectie van posterieure oogschelpen met verwijdering van hoornvlies, iris en lens kan bijvoorbeeld variabiliteit creëren van behouden iris- of hoornvliesmateriaal (onderdissectie) of verhoogde laserletsel tot normaal achterste oogbekergebied (overdissectie). Onze vergelijking tussen ongecontroleerde en gelaserde controleogen detecteert de infiltratie van mononucleaire fagocyten als gevolg van retinochoridale letsels. Voor de analyse van de effecten van systemische ziekten op het oog, d.w.z. uveïtis en diabetes, is individuele oculaire subcompartementanalyse essentieel. De methode van spijsvertering, in sectie 2 van het protocol, is het meest kritiek, terwijl andere stappen in secties 3 - 5 met succes zijn gebruikt op meerdere weefseltypen24. We kwamen tot onze spijsverteringsomstandigheden via een iteratieve methode die betrekking had op: (1) testen van de chemische vergistingsmethode (Collagenase D versus spijsverteringsenzym), (2) bepaling van de lengte van de chemische spijsvertering (30, 60 en 90 minuten) en (3) toevoeging van mechanische spijsvertering (geen, één, twee, drie keer). Bij elke stap beoordeelden we het succes van de spijsverteringsomstandigheden op cel levensvatbaarheid en aantal CD45HiCD64+ (infiltrerende macrofagen) cellen. We ontdekten dat spijsverteringsenzym (zie Aanvullende Tabel van Materialen) meer levende cellen terugvond dan Collagenase D en een poging tot de helft van de concentratie van het spijsverteringsenzym resulteerde in minder infiltrerende macrofagen. Vervolgens verdubbelde 60 minuten chemische vergisting met mechanische vergisting bijna de infiltrerende macrofaagpopulaties. Drie mechanische vergistingen waren optimaal met 25-30% levende cellen van singlets en de meest infiltrerende macrofaagpopulaties. Ten slotte veroorzaakten snellere mechanische spijsverteringsomstandigheden ernstig verlies van zowel levende cellen als macrofagen.
In de toekomst stellen we voor om de methode uit te breiden door het hoornvlies, de iris en de lens te verwijderen, gevolgd door het afzonderlijk verteren van het netvlies en de achterste oogschelp (sclera, choroïd en retinaal gepigmenteerd epitheel). Met deze wijziging verwachten we de spijsverteringsomstandigheden te verminderen vanwege de eiwitachtige en dichte eigenschappen van respectievelijk de lens en het hoornvlies. Deze verlagingen kunnen een verminderde concentratie van het spijsverteringsenzym omvatten, overschakelen naar Collagenase, verminderde tijd van de spijsvertering of verminderde hoeveelheid mechanische spijsvertering. We verwachten over het algemeen verminderde spijsverteringsomstandigheden voor de achterste oogbeker en verdere verminderde spijsverteringsomstandigheden voor alleen het netvlies.
Aanvullende toekomstige richtingen omvatten de uitbreiding van ons conventionele multi-parameter flow cytometriepaneel naar een conventioneel 6 laserinstrument of spectrale flowcytometrie. Spectrale stroomcytometrie maakt fluorforedetectie over het hele spectrum mogelijk, in plaats van te worden bepaald door de beschikbare filters. Spectrale stroomcytometrie resulteert in meer specifieke kleurdetectie. Spectrale stroomcytometrie vereist echter een geheel nieuwe reeks overwegingen die moeten worden gevolgd en valt buiten het bereik van dit manuscript. Voor meer details, zie dit recente JoVE artikel28. De 6 laserinstrumenten zijn voorzien van een ultraviolette laser, die 6-9 detectoren toevoegt. Wanneer u markeringen toevoegt aan een cytometriepaneel van de muisoogstroom, raden we u aan meer oculaire celtypen te detecteren. De lineagepoort kan bijvoorbeeld worden gescheiden om zelfstandig neutrofielen, eosinofielen, mestcellen, NK-cellen en lymfocyten te detecteren. Het wordt niet aanbevolen om de subsetdetectie van mononucleaire fagocyten te verhogen vanwege het kleine aantal macrofagen in steady state. Bij het toevoegen van nieuwe antilichamen stellen we zorgvuldige antilichaamtitratie voor.
Kortom, we hebben een aanpasbare, robuuste methode gepresenteerd voor de detectie van mononucleaire fagocytenpopulaties in het muisoog. Vanwege de sterk overlappende celoppervlakmarkers van monocyten, dendritische cellen, macrofagen en microglia is multiparameterstroomcytometrie de beste methode om deze cellulaire populaties te detecteren. Stroomcytometrie kan worden gebruikt voor analyse van celtypen, lottoewijzing en/of celsortering voor transcriptomische of proteomische evaluatie. De belangrijkste beperking is het gebrek aan weefselarchitectuur en belangrijke bevindingen kunnen worden bevestigd met behulp van traditionele histologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
JAL werd ondersteund door NIH-subsidie K08EY030923; CMC werd ondersteund door een K01-subsidie (5K01AR060169) van het NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases en een Novel Research Grant (637405) van de Lupus Research Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J.
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
