Summary

Vertering van hele muisogen voor multiparameterstroomcytometrische analyse van mononucleaire fagocyten

Published: June 17, 2020
doi:

Summary

Dit protocol biedt een methode om hele ogen te verteren tot een suspensie met één cel met het oog op cytometrische analyse van de multiparameterstroom om specifieke oculaire mononucleaire fagocytische populaties te identificeren, waaronder monocyten, microglia, macrofagen en dendritische cellen.

Abstract

Het aangeboren immuunsysteem speelt een belangrijke rol in de oculaire pathofysiologie, waaronder uveïtis, diabetische retinopathie en leeftijdsgebonden maculadegeneratie. Aangeboren immuuncellen, met name mononucleaire fagocyten, drukken overlappende celoppervlakmarkers uit, wat het identificeren van deze populaties een uitdaging maakt. Multi-parameter flow cytometrie maakt de gelijktijdige, kwantitatieve analyse van meercellige oppervlaktemarkers mogelijk om monocyten, macrofagen, microglia en dendritische cellen in muisogen te onderscheiden. Dit protocol beschrijft de enucleatie van hele muisogen, oculaire dissectie, spijsvertering in een suspensie met één cel en kleuring van de eencellige suspensie voor myeloïde celmarkers. Daarnaast leggen we de juiste methoden uit voor het bepalen van spanningen met behulp van enkele kleurregelaars en voor het afbakenen van positieve poorten met behulp van fluorescentie minus één bedieningselementen. De belangrijkste beperking van multi-parameter flow cytometrie is de afwezigheid van weefselarchitectuur. Deze beperking kan worden overwonnen door multiparameterstroomcytometrie van individuele oogcompartimenten of complementaire immunofluorescentiekleuring. Immunofluorescentie wordt echter beperkt door het gebrek aan kwantitatieve analyse en het verminderde aantal fluorforen op de meeste microscopen. We beschrijven het gebruik van multiparametrische flowcytometrie om zeer kwantitatieve analyse van mononucleaire fagocyten in laser-geïnduceerde choroïdale neovascularisatie te bieden. Bovendien kan multiparameterstroomcytometrie worden gebruikt voor de identificatie van macrofaagsubsets, fate mapping en celsortering voor transcriptomische of proteomische studies.

Introduction

Het aangeboren immuunsysteem omvat meerdere celtypen die complementactivatie en ontsteking stimuleren. Aangeboren immuuncellen omvatten natural killer (NK) cellen, mestcellen, basofielen, eosinofielen, neutrofielen en mononucleaire fagocyten. Mononucleaire fagocyten, die zijn samengesteld uit monocyten, macrofagen en dendritische cellen, zijn betrokken bij de pathofysiologie van meerdere oogheelkundige aandoeningen, waaronder uveïtis, diabetische retinopathie en leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD)1. In dit protocol zullen we ons richten op de identificatie van mononucleaire fagocyten met behulp van multi-parameter flow cytometrische analyse in een muismodel van neovasculaire AMD2. Dit protocol is aanpasbaar voor muismodellen van diabetische retinopathie en/of uveïtis, maar uitgebreidere oculaire dissectie wordt aanbevolen vanwege de systemische aard van deze ziekten.

Mononucleaire fagocyten drukken overlappende celoppervlakmarkeringen uit. Ingezeten macrofagen en microglia van langdurig weefsel zijn afkomstig van de van de dooierzak afgeleide erytromyeloïde voorloper3, terwijl recycling van macrofagen en dendritische cellen zich onderscheidt van de van beenmerg afgeleide macrofaagdendritische celveredelvader4. Muisceloppervlakmarkeringen die gebruikelijk zijn voor monocyten, macrofagen en dendritische cellen omvatten CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17en de intracellulaire marker Iba18. Om deze uitdaging het hoofd te bieden, definieert transcriptomische analyse van macrofagen, monocyten en dendritische cellen uit meerdere weefsels CD64 als een macrofaagspecifieke celoppervlakmarker6. Macrofagen zijn beschreven in de iris, choroïde, ciliaire lichaam en oogzenuw in gezonde ogen3. Als alternatief is dendritische celidentificatie moeilijker; de meest specifieke methode voor dendritische celidentificatie vereist lottoewijzing met behulp van de Zbtb46-GFP-reportermuis9. Onafhankelijk van deze melderlijn kan de expressie van CD11c en MHCII in combinatie met de afwezigheid van CD64 potentiële dendritische cellen6,10identificeren . Dendritische cellen zijn geïdentificeerd in hoornvlies, conjunctiva, iris en choroïd in normale ogen11. Microglia zijn gespecialiseerde macrofagen in het netvlies, beschermd door de bloed-retinale barrière, en afgeleid van dooierzak voorloper cellen12. Als gevolg hiervan kan retinale microglia worden onderscheiden van monocyten-afgeleide macrofagen door hun dimniveaus van CD45-expressie13 en hoge niveaus van Tmem119, die beschikbaar is als een flowcytometrie-antilichaam14. Bij microglia-activering kan CD45 echter up-regulated15 zijn en Tmem119 kan down-regulated3zijn , wat de complexiteit van microgliabiologie aantoont en dit is waarschijnlijk relevant in zowel AMD als het muismodel. Ten slotte kunnen monocyten worden onderverdeeld in ten minste twee subtypen, waaronder klassiek en niet-klassiek. Klassieke monocyten tonen CCR2+Ly6ChogeCX3CR1lage expressie, en niet-klassieke monocyten tonen CCR2Ly6ClageCX3CR1hoge markers5.

Vanwege de noodzaak van de kwantitatieve analyse van markerexpressie, d.w.z. hoge versus lage/dimniveaus, is multiparameterstroomcytometrie de ideale methode voor discriminatie tussen monocyten, macrofagen, microglia en dendritische cellen in het oog en andere weefsels. Extra voordelen zijn de identificatie van subpopulaties, de mogelijkheid om fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om celpopulaties te sorteren voor transcriptomische of proteomische analyse, en lottoewijzing. Het grootste nadeel van multi-parameter flow cytometrie is het gebrek aan weefselarchitectuur. Dit kan worden overwonnen door de oogheelkundige dissectie in de verschillende oogsubcompartementen: hoornvlies, conjunctiva, iris, lens, netvlies en choroid-sclera-complex. Bovendien kan bevestigende immunofluorescentiebeeldvorming worden uitgevoerd, maar wordt deze beperkt door het aantal markers en het gebrek aan robuuste kwantificering.

Genoombrede associatiestudies hebben meerdere complementgenen gekoppeld aan AMD16. Complement activering leidt tot anafylaxie productie, leukocyten rekrutering, en resulterende ontsteking. Als aanvulling op receptordeficiënte muizen vermindert laserletsel mononucleaire fagocytenwerving en lasergeïnduceerde choroïdale neovascularisatie (CNV) gebied17. Evenzo toont het C-C-motief chemokine receptor 2 (CCR2) knock-outmuis, die een tekort heeft aan monocytenwerving aan het weefsel, zowel verminderde mononucleaire fagocytenwerving als lasergeïnduceerde CNV-gebied18. Deze gegevens koppelen complementaire en mononucleaire fagocyten aan experimentele CNV en mogelijk neovasculaire AMD. Ter ondersteuning van deze associatie worden complementreceptoren gedyreguleerd op perifere bloedmonocyten bij patiënten met neovasculaire AMD19,20. Deze gegevens tonen een sterke associatie aan tussen AMD en mononucleaire fagocyten.

In dit manuscript zullen we het experimentele lasergeïnduceerde CNV-model gebruiken om de mononucleaire fagocytenpopulaties in het muisoog te karakteriseren met behulp van multiparameterstroomcytometrie. Lasergeïnduceerde CNV is het standaard muismodel van neovasculaire AMD, dat de werkzaamheid van de huidige eerstelijns neovasculaire AMD-therapieaantoonde 21. Dit protocol beschrijft enucleatie van muisogen, oculaire dissectie, spijsvertering in een eencellige suspensie, antilichaamkleuring, bepaling van laserspanningen met behulp van enkele kleurregelaars en gatingstrategie met behulp van fluorescentie minus één (FMO) bedieningselementen. Voor een gedetailleerde beschrijving van het lasergeïnduceerde CNV-model, zie een eerdere publicatie22. Met behulp van dit protocol definiëren we microglia, monocyten, dendritische cellen en macrofaagpopulaties. Verder zullen we MHCII en CD11c gebruiken om macrofaagsubsets verder te definiëren binnen het lasergeïnduceerde CNV-model.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee. C57BL/6 muizen werden gegroepeerd in een barrièrefaciliteit in het Center for Comparative Medicine van de Northwestern University (Chicago, IL). Alle dieren waren gehuisvest in 12/12 uur lichte / donkere cyclus met gratis toegang tot voedsel en water. 1. Verzameling van oogweefsel Offer 10-12 weken oude C57BL/6J muizen van beide geslachten met gereguleerde toediening van k…

Representative Results

Figuur 1 toonde niet-gecompenseerde frequentie histogrammen voor de SCC’s en cellen voor de rode laser: Alexa647, Alexa700 en APC-Cy7. In figuur 1Atoonde de magentalijn de piek van de SCC voor Alexa647, terwijl de cyaanlijn het beoogde 0,5 Log-verschil liet zien. Merk op dat de piek in Alexa700 en APC-Cy7 links (minder helder) van de cyaanlijn was. Merk ook op dat de cellen allemaal links van de magentalijn stonden. Cellen rechts van de SCC-piek werden niet geco…

Discussion

Multi-parameter flow cytometrie maakt de kwantitatieve analyse van meerdere celtypen in een complex weefsel mogelijk. In dit rapport beschrijven we de stroomcytometrische detectie van mononucleaire fagocytenpopulaties, waaronder monocyten, dendritische cellen en macrofaagsubsets, na laserletsel in het muisoog. Liyanage et al rapporteerden onlangs een vergelijkbare gating-strategie om neutrofielen, eosinofielen, lymfocyten, DC’s, macrofagen, infiltrerende macrofagen en monocyten te detecteren27. On…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JAL werd ondersteund door NIH-subsidie K08EY030923; CMC werd ondersteund door een K01-subsidie (5K01AR060169) van het NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases en een Novel Research Grant (637405) van de Lupus Research Alliance.

Materials

0.6 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-120
1.7 ml microcentrifuge tubes Costar 3620
10 ml pipettes Fisher Scientific 431031
15 ml conicals ThermoFisher 339650
1x HBSS, 500 ml Gibco 14025-092
2.5 ml syringe Henke Sass Wolf 7886-1
20% paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15713-S
25 ml pipettes Fisher Scientific 431032
30 G needle Exel 26437
3ml luer lock syringe Fisher Scientific 14955457
41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish Fisher Scientific 08-732-112
50 ml conicals Falcon 352070
96-well, U-bottom assay plate without lid Falcon 353910
Amine reactive beads ThermoFisher A10628
Analysis software FlowJo v 10
Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set BD Biosciences 552845
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
Cell counter Invitrogen AMQAX1000
Cell counter slides Invitrogen C10283
Compensation beads ThermoFisher 01-1111-42
Count beads ThermoFisher 01-1234-42
Curved forceps Fisher Scientific 16-100-123
Digestion enzyme Sigma Aldrich 5401020001
Dissecting microscope National Optical and Scientific Instruments, Inc. DC3-420T
Dissociation tubes Miltenyi Biotec 130-096-334
DNase Roche 10104159001
Electronic dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
FACS Diva software BD Biosciences
Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142
Fine forceps Integra Miltex 17035X
Flow buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Flow cytometer BD Biosciences
Flow tubes Falcon 352008
Hamster anti-mouse CD11c BV421 BD Biosciences 562782
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-123
Live/Dead dye ThermoFisher 65-0866-14
Lysing solution, 10x solution BD Biosciences 555899
Micro titer tube and rack Fisher Scientific 02-681-380
Mouse anti-mouse CD64 PE BioLegend 139304
Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 BD Biosciences 562864
P1000 pipet tips Denville Scientific P2404
P1000 pipettor Gilson FA10006M
P2 pipet tips eppendorf 22491806
P2 pipettor Gilson FA10001M
P20 pipettor Gilson FA10003M
P200 pipet tips Denville Scientific P2401
P200 pipettor Gilson FA10005M
Pipet man Fisher Scientific FB14955202
Rat anti-mouse B220 PECF594 BD Biosciences 562313
Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 BD Biosciences 557657
Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 BD Biosciences 557958
Rat anti-mouse CD19 PE BD Biosciences 553786
Rat anti-mouse CD4 PECF594 BD Biosciences 562314
Rat anti-mouse CD45 FITC ThermoFisher 11-0451-82
Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 BD Biosciences 552848
Rat anti-mouse CD8 PECF594 BD Biosciences 562315
Rat anti-mouse Ly6C BD Biosciences 561085
Rat anti-mouse Ly6G PECF594 BD Biosciences 562700
Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 BioLegend 107622
Rat anti-mouse Siglec F PECF594 BD Biosciences 562757
Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 BD Biosciences 564178
Shaking incubator Labnet 311DS
Spring scissors Fine Science Tools 15024-10
Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh Fisher Scientific 22363547
Sterile water, 500 ml Gibco A12873-01
Swinging bucket centrifuge eppendorf 5910 R
Trypan blue, 0.4% solution Gibco 15250061

References

  1. Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
  2. Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
  3. O’Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
  4. Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
  5. Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
  6. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  7. Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
  8. Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
  9. Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
  10. Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
  11. Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
  12. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  13. O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
  14. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  15. Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
  16. McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
  17. Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
  18. Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
  19. Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
  20. Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
  21. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
  22. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
  23. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
  24. Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
  25. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
  26. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  27. Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
  28. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).

Play Video

Cite This Article
Droho, S., Cuda, C. M., Lavine, J. A. Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes. J. Vis. Exp. (160), e61348, doi:10.3791/61348 (2020).

View Video