Summary
Este protocolo fornece um método para digerir olhos inteiros em uma única suspensão celular com o propósito de análise citométrica de fluxo de vários parâmetros, a fim de identificar populações fagocíticas mononucleares específicas, incluindo monócitos, microglia, macrófagos e células dendríticas.
Abstract
O sistema imunológico inato desempenha papéis importantes na fisiopatologia ocular, incluindo uveíte, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. As células imunes inatas, especificamente os faócitos mononucleares, expressam marcadores de superfície celular sobrepostos, o que torna a identificação dessas populações um desafio. A citometria de fluxo de vários parâmetros permite a análise quantitativa simultânea de marcadores de superfície de múltiplas células, a fim de diferenciar monócitos, macrófagos, microglia e células dendríticas nos olhos do rato. Este protocolo descreve a enucleação de olhos inteiros do rato, dissecção ocular, digestão em uma única suspensão celular e coloração da suspensão de célula única para marcadores de células mielóides. Além disso, explicamos os métodos adequados para determinar tensões usando controles de cor única e para delinear portões positivos usando fluorescência menos um controles. A maior limitação da citometria de fluxo de vários parâmetros é a ausência de arquitetura tecidual. Essa limitação pode ser superada pela citometria de fluxo de vários parâmetros de compartimentos oculares individuais ou coloração de imunofluorescência complementar. No entanto, a imunofluorescência é limitada pela sua falta de análise quantitativa e pelo número reduzido de fluoroforos na maioria dos microscópios. Descrevemos o uso de citometria de fluxo multiparamétrico para fornecer análises altamente quantitativas de fagocitos mononucleares na neovascularização choroidal induzida por laser. Além disso, a citometria de fluxo de vários parâmetros pode ser usada para a identificação de subconjuntos de macrófagos, mapeamento de destinos e classificação celular para estudos transcriômicos ou proteômicos.
Introduction
O sistema imunológico inato inclui múltiplos tipos de células que estimulam a ativação e inflamação complementares. As células imunes inatas incluem células assassinas naturais (NK), células de mastro, basófilos, eosinófilos, neutrófilos e fagocitos mononucleares. Os fagocitos mononucleares, compostos por monócitos, macrófagos e células dendríticas, foram implicados na fisiopatologia de múltiplas condições oftálmicas, incluindo uveíte, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade (AMD)1. Neste protocolo, focaremos na identificação de faócitos mononucleares utilizando análises citométricas de fluxo de vários parâmetros em um modelo de mouse de AMD neovascular2. Este protocolo é adaptável para modelos de camundongos de retinopatia diabética e/ou uveíte, mas a dissecção ocular mais extensa é recomendada devido à natureza sistêmica dessas doenças.
Os fagocitos mononucleares expressam marcadores de superfície de células sobrepostos. Os macrófagos residentes de tecido de longa duração e a microglia são originários do progenitor de células eritrolóides derivados da gema3,enquanto a reciclagem de macrófagos e células dendríticas se diferenciam do progenitor de células dendríticas derivados da medula óssea4. Os marcadores de superfície de células do rato comuns a monócitos, macrófagos e células dendríticas incluem CD45, CD11b5, F4/806,Cx3cr17e o marcador intracelular Iba18. Para superar esse desafio, a análise transcriômica de macrófagos, monócitos e células dendríticas de múltiplos tecidos define CD64 como um marcador de superfície celular específico para macrófago6. Macrófagos foram descritos na íris, corpo ciliar, ciliar e nervo óptico em olhos saudáveis3. Alternativamente, a identificação de células dendríticas é mais difícil; o método mais específico de identificação celular dendrítica requer mapeamento do destino usando o mouse repórter Zbtb46-GFP9. Independente desta linha de repórteres, a expressão de CD11c e MHCII em conjunto com a ausência de CD64 pode identificar potenciais células dendríticas6,10. Células dendríticas foram identificadas em córnea, conjuntiva, íris e coroide em olhos normais11. Microglia são macrófagos especializados localizados na retina, protegidos pela barreira hemrateira-retina, e derivados de células progenitoras do sac gema12. Como resultado, a microglia da retina pode ser diferenciada dos macrófagos derivados de monócitos por seus níveis fracos de expressão CD4513 e altos níveis de Tmem119, que está disponível como anticorpo citometria de fluxo14. Após a ativação da microglia, no entanto, o CD45 pode ser regulado15 e O Tmem119 pode ser regulado3, demonstrando a complexidade da biologia da microglia e isso é provavelmente relevante tanto na AMD quanto em seu modelo de mouse. Finalmente, os monócitos podem ser divididos em pelo menos dois subtipos, incluindo clássico e não clássico. Monócitos clássicos exibem ccr2+Ly6Caltabaixa expressão CX3CR1, e monócitos não clássicos demonstram CCR2-Ly6CbaixoCX3CR1marcadores altos 5.
Devido à necessidade da análise quantitativa da expressão marcadora, ou seja, níveis altos versus baixos/fracos, a citometria de fluxo de vários parâmetros é o método ideal para a discriminação entre monócitos, macrófagos, microglia e células dendríticas no olho e outros tecidos. Outras vantagens incluem a identificação de sub populações, a capacidade de usar a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) para classificar populações celulares para análise transcriômica ou proteômica e mapeamento do destino. A maior desvantagem da citometria de fluxo de vários parâmetros é a falta de arquitetura tecidual. Isso pode ser superado pela dissecção oftálmica nos diversos subcoentamentos oculares: córnea, conjuntiva, íris, lente, retina e complexo coroide-esclera. Além disso, a imagem confirmatória de imunofluorescência pode ser realizada, mas é limitada pelo número de marcadores e falta de quantitação robusta.
Estudos de associação de genomas associaram múltiplos genes complementares com a AMD16. A ativação complementar leva à produção de anafilatoxinas, recrutamento de leucócitos e inflamação resultante. Em camundongos deficientes receptores complementares, a lesão a laser reduz o recrutamento de fagocitos mononucleares e a área de neovascularização choroidal induzida por laser (CNV)17. Da mesma forma, o camundongo c-c 2 (CCR2), que é deficiente no recrutamento de monócitos para o tecido, demonstra tanto a diminuição do recrutamento de faócitos mononucleares quanto a área cnv induzida por laser18. Esses dados ligam complementos e fagocitos mononucleares com CNV experimental e possivelmente AMD neovascular. Em apoio a esta associação, os receptores complementares são desregulados em monócitos sanguíneos periféricos em pacientes com AMD neovascular19,20. Esses dados demonstram forte associação entre os faócitos AMD e mononucleares.
Neste manuscrito, usaremos o modelo experimental de CNV induzido a laser para caracterizar as populações de fagocites mononucleares no olho do rato usando citometria de fluxo de vários parâmetros. CnV induzida a laser é o modelo padrão do mouse da AMD neovascular, que demonstrou a eficácia da terapia de AMD neovascular de primeira linha atual21. Este protocolo descreverá a enucleação dos olhos do rato, dissecção ocular, digestão em uma única suspensão celular, coloração de anticorpos, determinação de tensões a laser usando controles de cor única e estratégia de gating usando controles de fluorescência menos um (FMO). Para obter uma descrição detalhada do modelo CNV induzido por laser, consulte uma publicação anterior22. Usando este protocolo, definiremos microglias, monócitos, células dendríticas e populações de macrófagos. Além disso, usaremos MHCII e CD11c para definir ainda mais subconjuntos de macrófago dentro do modelo CNV induzido a laser.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade northwestern. Os camundongos C57BL/6 foram alojados em uma instalação de barreira no Centro de Medicina Comparada da Universidade northwestern (Chicago, IL). Todos os animais foram alojados em ciclo claro/escuro de 12/12 h com livre acesso a alimentos e água.
1. Coleta de tecido ocular
- Sacrificar ratos C57BL/6J de 10-12 semanas de idade de ambos os sexos usando administração regulamentada de dióxido de carbono até que o rato não responda e não inale mais. Realize deslocamento cervical ou outro método secundário aprovado para garantir a eutanásia.
NOTA: A perfusão transcárvia pode ser realizada para remover leucócitos circulantes que não estão nos tecidos oculares. Neste experimento, a perfusão sistêmica não reduz o número de microglias, monócitos, macrófagos ou células dendríticas detectadas em olhos inteiros tratados sem tratamento ou laser. Portanto, a maioria desses tipos de células estão localizados nos tecidos oftálmicos e esta etapa é opcional. - Para enuclear os olhos, empurre para baixo perto da órbita ocular enquanto coloca um par de fórceps curvados suavemente sob o olho enquanto ele se destaca fora da tomada. Pinças fechadas sob o olho sem apertar o olho real. Desalojar o olho da conjuntiva circundante (veja a publicação anterior)23.
- Puxe o olho lateralmente até que o nervo óptico seja a única conexão restante para desacopcular o olho. O nervo óptico muitas vezes rompe com a tensão, mas uma pequena tesoura às vezes é necessária para cortar o nervo óptico. Coloque o olho no frio 1x Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) com cálcio e magnésio em tubo de microcentrifuge de 1,7 mL.
2. Digestão do tecido ocular
- Prepare o tampão de digestão contendo enzima de digestão de 0,1 mg/mL e 0,2 mg/mL DNase em HBSS frio. Reconstituir enzima de digestão de 5 mg em 2 mL de água estéril inicialmente. Prepare uma diluição inicial de 10 mg/mL DNase no HBSS. Para cada 10 mL do tampão de digestão (suficiente para 3 animais) misture 9,4 mL de HBSS frio com 0,4 mL de enzima de digestão reconstituída e 0,2 mL de DNase I diluída.
NOTA: Essas concentrações foram empiricamente determinadas em vários experimentos para fornecer níveis ideais de coloração de anticorpos de células únicas, ao mesmo tempo em que reduziram a morte celular. A colagenase D foi testada como alternativa à enzima de digestão com viabilidade celular reduzida e diminuição das células CD45+ Consulte Discussão para obter mais detalhes sobre o processo iterativo para otimizar a digestão. - Sob um microscópio dissecando a 10x de ampliação total, remova o nervo conjuntivo e óptico restante usando fórceps finos e tesouras de mola em HBSS frio.
- Mova os olhos limpos para um prato de dissecação seca ou pequeno barco de pesagem. Injete 0,15-0,20 mL/olho de tampão de digestão através de seringa equipada com agulha de 30 G na cavidade vítrea após duas feridas perfurantes serem feitas no olho através do eixo visual e 90° de distância desta primeira ferida para saída de tampão de digestão.
- Pique os olhos inteiros usando tesouras de mola e fórceps finos com todas as peças menores que 0,5 mm x 0,5 mm. Dissociar tecido de lente com interrupção mecânica contundente através de fórceps para evitar entupir pontas de pipeta nas etapas subsequentes. Para cada amostra, enxágue fórceps e tesouras cada uma com 0,75 mL de tampão de digestão em prato pequeno. Use um novo prato para cada amostra.
- Transfira o conteúdo do prato para um tubo de dissociação no gelo usando pipeta P1000 tomando cuidado para não perder nenhum material na transferência de pipeta. Enxágüe o prato com 1,5 mL adicional de tampão de digestão, elevando o volume total no tubo de dissociação para 3,25-3,50 mL.
- Coloque o tubo de dissociação invertido em dissociador eletrônico e execute o ciclo "m_brain_03_01", consistindo de rotação unidirecional de 1 min a 200 rpm à temperatura ambiente, que é um programa pré-carregado. Certifique-se de que todo o tecido está na parte inferior do tubo de dissociação em contato com o tampão de digestão e o rotor para este e todos os passos restantes.
- Coloque o tubo de dissociação na incubadora de agitação por 30 min a 200 rpm a 37 °C.
- Repita as etapas 2.6 e 2.7 uma vez adicional. Após a segunda incubação de 30 min realizar uma digestão mecânica final usando dissociador eletrônico como na etapa 2.6.
- Pare a reação adicionando 10 mL de tampão de fluxo frio e coloque tubos no gelo.
3. Preparação da suspensão celular
- Para criar suspensão unicelular, despeje a reação de digestão ocular parada através de um filtro de 40 μm colocado na parte superior de um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Usando o êmbolo de uma seringa de 2,5 mL, empurre todos os pedaços restantes de tecido ocular não digerido através do filtro.
- Lave o tubo de dissociação com 10 mL de tampão de fluxo e enxágue o filtro antes de usar o mesmo êmbolo para passar novamente pedaços de tecido ocular não digerido através do filtro.
- Repita o passo 3.2 usando 5 mL de buffer Flow.
- Lave o tubo de dissociação e o filtro com um tampão final de 10 mL de flow.
NOTA: O volume total de digestão e tampão de fluxo é de cerca de 38-40 mL para cada amostra. - Centrifugar o tubo cônico a 400 x g por 10 min a 4 °C. Decante o supernatante sem perturbar a pelota celular.
- Prepare a solução 1x lysing adicionando solução de 10x de lise à água estéril. Quebre a pelota movendo o tubo contra outro tubo. Para lise os glóbulos vermelhos, adicione 1 mL de solução de 1x lysing para 30 s com redemoinhos à temperatura ambiente (RT).
- Pare a reação com 20 mL de buffer Flow.
- Centrifugar o tubo cônico a 400 x g por 10 min a 4 °C. Decante o supernatante sem perturbar a pelota celular.
- Dissociar a pelota movendo o tubo contra outro tubo. Adicione 5 mL de HBSS frio 1x por tubo.
- Tubos centrífugas a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspirante supernante.
4. Coloração de suspensão celular para fagocitos mononucleares
- Prepare 0,5 mL de mancha viva/morta por amostra diluindo o corante Live/Dead 1:5.000 em HBSS frio.
- Adicione a mancha Viva/Morta a cada amostra usando uma pipeta P1000 certificando-se de dissociar completamente a pelota. Transfira amostras para tubos micro titer de 1,2 mL.
- Tome uma pequena alíquota (10 μL) para contar células usando um hemócitometro ou contador automático de células (ver 4.4). Incubar amostras com mancha viva/morta por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
- Conte células usando azul Trypan para determinar o número de células vivas por amostra.
NOTA: Normalmente, 2 olhos de um mouse C57BL/6J de 10-12 semanas de idade contêm menos de 2 x 106 células vivas. - Lave as amostras adicionando 400 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular.
- Células resuspendas completamente em 500 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular.
- Bloqueie até 5 x 106 células vivas em 50 μL de bloco Fc (diluição de 1:50 em tampão de fluxo frio do camundongo purificado CD16/CD32). Se mais de 5 x 106 células vivas, aumente os volumes adequadamente.
- Adicione o bloco Fc à pelota, certificando-se de dissociar completamente a amostra. Incubar por 20 min a 4 °C.
- Adicione 50 μL de solução de coloração de anticorpos (ver Tabela 1 para escolha e quantidade de cada anticorpo que está incluído na solução) por 5 x 10 6 células vivasdiretamente às células no bloco Fc e misture completamente. Incubar por 30 min a 4 °C.
NOTA: As quantidades de anticorpos dependem da configuração do citómetro de fluxo e devem ser tituladas independentemente para cada laboratório e instrumento. Consulte a Tabela 2 para a configuração do instrumento de filtros e espelhos. Para titular anticorpos, comece com a recomendação do fabricante e calcule o índice de coloração. Realize um teste de diferentes concentrações de anticorpos (acima e abaixo da recomendação do fabricante) e escolha a menor concentração de anticorpos onde o índice de coloração é mantido. Além disso, certifique-se de que a coloração positiva seja menos brilhante do que o controle de cor única. Use células não manchadas para garantir que as células manchadas negativamente estejam em escala e tenham um pico inferior ou inferior a 1 x 102. Use uma fluorescência menos um controle para definir as células manchadas positivamente. - Lave as amostras adicionando 700 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular.
- Opcionalmente, após a coloração do anticorpo, as amostras podem ser fixadas com 500 μL de 2% de paraformaldeído no buffer Flow. Conserte amostras por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, realize uma lavagem como descrito em 4.10. Armazene amostras fixas a 4 °C. As contas de contagem devem ser adicionadas no dia da coleta de dados de citometria de fluxo. As amostras fixas devem ser executadas no citômetro de fluxo em 1-2 dias.
ATENÇÃO: O paraformaldeído é um risco corrosivo e para a saúde. - Lave novamente as amostras usando 500 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspirar metade do supernante sem perturbar a pelota celular.
- Resuspend pelotas e transferir para um poço 96 bem, placa de ensaio u-bottom. Placa centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Para decantar o supernasce, vire a placa e em um forte shake desaloja o líquido em uma bacia de pia, sem perturbar a pelota.
- Em um novo tubo de 1,2 mL micro titer, coloque 50 μL de contas de contagem bem vórtices.
- Resuspend pelotas em 96 placas de poço em 200 μL de tampão de fluxo frio. Adicione a mistura celular na parte superior das contas da etapa anterior. Execute no citómetro de fluxo em volume total de 250 μL / micro tubo de titulação.
5. Coleta de dados de citometria de fluxo
- Ligue e prepare o citômetro de fluxo. As instruções aqui listadas são para um cicímetro laser modificado(Tabela 2).
- Execute uma amostra de teste, que inclui uma pequena alíquota de cada amostra, para garantir que todas as células estejam em escala para cada detector. Ajuste as tensões para que todas as células estejam em escala.
- Execute controles de cor única (CCS) para cada fluoróforo usado no coquetel de coloração(Tabela 3). Coloque o tubo de micro titer em um tubo de poliestireno maior de 5 mL para colocação no estágio do citômetro de fluxo.
NOTA: Fluoroforos radiculares como BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) e Alexa700 não requerem o mesmo anticorpo que o coquetel (ou seja, CD19 PE para CD64 PE). No entanto, fluoroforos tandem como PE-CF594, PE-Cy7 ou APC-Cy7 requerem o mesmo anticorpo para CCS como coquetel devido à possível dissociação dos fluoroforos conjugados.- Crie o CCS para BV421 adicionando 2 gotas de contas de compensação a um tubo de titer de 1,2 mL, juntamente com 1 μL de hamster anti-mouse CD11c BV421. As contas de compensação são usadas porque o CD11c BV421 é um subtipo de lambda IgG em vez de kappa, conforme descrito em 5.3.3. Incubar por 15 minutos a 4 °C. Adicione 0,2 mL de tampão de fluxo.
- Crie o SCC para o corante Live/Dead adicionando uma gota de contas de coloração positiva (tampa verde) das contas reativas de amina, seguida por 1 μL de corante Vivo/Morto. Incubar por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Adicione uma gota das contas negativas (tampa branca) das contas reativas de amina. Adicione 0,2 mL de tampão de fluxo.
- Crie os CCs restantes adicionando uma gota de contas de coloração positiva (tampa verde) do conjunto de contas anti-rato e anti-hamster Ig kappa, seguido pela quantidade de anticorpos listada(Tabela 3) em um tubo de titer de 1,2 mL. Incubar por 15 min a 4 °C. Adicione uma gota das contas negativas (tampa branca) do conjunto de contas anti-rato e anti-hamster Ig kappa. Adicione 0,2 mL de tampão de fluxo.
- Vórtice todas as misturas de contas completamente. Armazenar SCCs a 4 °C por até 3 dias.
NOTA: O CCS para ratos repórteres fluorescentes são células não manchadas. - Ao executar SCCs, defina tensões de tal forma que a amostra de CCS tenha um pico maior do que qualquer fluorescência para uma amostra de células no mesmo canal do detector. Além disso, as tensões devem ser definidas para que qualquer CCS tenha pelo menos uma diferença de log de 0,5 entre o pico do histograma no canal de interesse versus qualquer outro canal(Figura 1).
- Execute amostras em eventos de manutenção "Baixa"/segundo abaixo de 4000. Se a taxa de fluxo não puder ser reduzida adequadamente, diluir amostras com buffer de fluxo frio adicional. Registo o volume adicionado, pois isso será necessário para o cálculo da contagem (veja os resultados representativos).
- Coletar pelo menos 3 x 106 eventos por amostra. Isso pode ser maior do que o número de células devido a grânulos de pigmento e detritos contando como eventos em seu cítmetro.
- Registo uma Fluorescência Menos Um (FMO) para cada fluoróforo que não seja Live/Dead para a estratégia adequada de gating na seção 6.4. Um FMO é uma amostra que foi manchada com todos os fluoroforos, exceto um.
- Limpe e desligue o citômetro de fluxo de acordo com as instruções do fabricante ou da instalação.
6. Anotação dos dados de citometria de fluxo
- Abra uma nova planilha usando software de análise. Importar arquivos FCS de citômetro para todas as amostras e controles de cor única.
- Use SCCs para criar uma matriz de compensação.
- Aplique a matriz de compensação às suas amostras manchadas e FMOs.
- Use as FMOs para determinar a coloração positiva para desenhar portões.
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Representative Results
A Figura 1 mostrou histogramas de frequência não compensados para os SCCs e células para o laser vermelho: Alexa647, Alexa700 e APC-Cy7. Na Figura 1A,a linha magenta retratou o pico do CCS para Alexa647, enquanto a linha ciano mostrou a diferença de log pretendida de 0,5. Observe que o pico em Alexa700 e APC-Cy7 foi à esquerda (menos brilhante) da linha ciano. Note também que as células estavam todas à esquerda da linha magenta. As células à direita do pico do CCS não foram compensadas. Canais específicos eram conhecidos por derramar em outros com base na química dos corantes fluorocromáticos (ou seja, Laser Violet: BV421 -> V500, Laser Verde-Amarelo: PE -> PE-CF594, Laser Vermelho: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, Cross Laser: PE-Cy7 -> APC-Cy7). Se qualquer uma das condições acima não fosse atendida, a tensão de um canal poderia ser ajustada para cima enquanto qualquer canal de derramamento poderia ser movido para baixo. Consulte a Figura 1B e a Figura 1C para obter exemplos adicionais do laser vermelho. Uma vez que as tensões foram determinadas e então registradas, todas as amostras devem ser executadas com os parâmetros de tensão. Existe um assistente de compensação e pode ser útil.
A identificação de contas de contagem é necessária para quantificação da contagem de células. A Figura 2A mostrou propriedades FSC-A vs SSC-A para todos os eventos analisados a partir de dois olhos de um único mouse. É importante ajustar a tensão SSC para garantir que as contas da contagem sejam visíveis como uma coleção muito apertada de eventosaltos ebaixos do FSC-A. As contagens de contas foram limpas e confirmadas pelo plotagem PE vs APC-Cy7 (Fig 2B). Contas limpas eram um aglomerado apertado de pe+ e eventos APC-Cy7 .
Singlets e células vivas foram identificados em seguida de todos os eventos. Os singlets foram determinados por plotar FSC-H vs FSC-A. Os singlets foram positivamente correlacionados nessas duas propriedades, enquanto as células doublet e triplet apresentaram FSC-A maior do que fsc-h(Figura 2C). Células vivas foram delineadas plotando Live / Dead vs FSC-A. As células mortas eram vivas / mortas positivas, e as células demonstram maior FSC-A do que detritos (Fig 2D). Note que as contas de contagem eram Ao Vivo / Dead+ e foram removidas nesta etapa.
A Figura 3 mostra a estratégia inicial de gating para o delineamento de faócitos mononucleares de células ao vivo, singlet. Singlets ao vivo foram visualizados usando um plot CD45 versus CD11b(Figura 3, à esquerda). Observe que cd45+CD11b- (principalmente células B e células T), CD45dimCD11b+ (microglia putativa) e células CD45+CD11b+ (infiltrando células imunes, aumentadas com laser [Fig 3B, esquerda]) foram selecionadas. A ausência de células CD45+ no CD45 FMO confirmou a seleção do portão (Figura 3C, à esquerda). Em seguida, neutrófilos, eosinófilos, Células B, células NK e células T foram excluídas por plotagem CD45+ singlets vivos usando o portão lineage (Lin: Ly6G [neutrófilos], SiglecF [eosinófilos], B220 [células B], NK1.1 [células NK], CD4 [células T], e CD8 [células T]) vs CD11b. O aumento dos grupos CD11b+Lin- células entre os grupos No Laser(Figura 3A, médio) e Laser(Figura 3B, médio) foi facilmente observado. Note a falta de células CD11b+Lin no CD11b FMO (Figura 3C, meio) e a falta de lin+ células no Lin FMO (Figura 3C, à direita). A microglia pode ser separada da infiltração de faócitos mononucleares pela quantidade de expressão CD4513,24. CD11b+Lin- as células foram visualizadas usando um plot CD11b vs CD45 para identificar microgliaputativa dim putative CD45 e fágoras mononucleares dealta infiltração. O aumento relativo dos fágoras mononuclearesde CD45 foi claro no camundongo tratado a laser (Figura 3A,B, à direita).
A figura 4 identificou microglia, três subconjuntos de macrófagos, monócitos e células dendríticas. A microglia foi determinada plotando célulasdim CD45 em uma trama CD64 vs MHCII(Figura 4, painel esquerdo). Microglia tem sido mostrado como CD64+MHCIIbaixo anteriormente13. A microglia estava relativamente inalterada com o laser e ausente no CD64 FMO(Figura 4A,C à esquerda). As célulasaltas CD45 foram plotadas em seguida no mesmo gráfico CD64 vs MHCII. Foram identificados CD64+MHCII- macrófagos (MHCII- Macs), CD64-MHCII- monócitos e células MHCII+ (Figura 4A,B, centro-esquerda). Observe a ausência de células MHCII+ no MHCII FMO (Figura 4C, meio esquerdo). AS células MHCII+ foram ainda discriminadas usando CD64 e CD11c. CD64+CD11c- macrófagos (CD11c- Macs), CD64+CD11c+ macáfagos (CD11c+ Macs) e CD64-CD11c+ células dendríticas (DCs)(Figura 4A,B, direita média). Observe a ausência de células CD11c+ no CD11c FMO (Figura 4C, meio direito). Os monócitos foram subtipados como Ly6C clássico+ ou ly6C não clássico- monócitos(Figura 4, à direita). Note a ausência de Ly6C+ monócitos no Ly6C FMO (Figura 4C, à direita).
O número de células por mouse (ou por 2 olhos) foi calculado com a seguinte equação:
Usando os volumes neste método, a equação é:
A contagem de células e a contagem de contas serão específicas para cada amostra. A concentração de contas é específica para cada lote de contas de contagem e fornecida pelo fabricante em cada frasco.
Macrófagos se infiltram no coroide após lesão a laser25, e o esgotamento do macrófago reduz a área cnv18. Esses estudos mais antigos dependem de imagens de imunofluorescência, que não podem diferenciar de forma confiável os faócitos mononucleares, ou menos marcadores citométricos de fluxo para identificação de macrófagos. A heterogeneidade macfago é um conceito emergente na imunologia inata, onde macrófagos são capazes de desempenhar múltiplas funções dependendo de sua origem e microambiente tecidual12,26. Realizamos citometria de fluxo de vários parâmetros em olhos de camundongos não tratados e tratados a laser no dia 3 após lesão a laser para identificar fagocitos mononucleares e heterogeneidade macrófago. O tratamento a laser aumentou o MHCII-, CD11c-e CD11c+ macrófagos em 7,0-25,6, 2,8-7,2 e 3,9-8,2 vezes, respectivamente(Figura 5A,C). A contagem de células dendríticas também foi regulada 4,5-4,7 vezes por laser(Figura 5F). As contagens de microglia e monócito não foram afetadas pelo tratamento a laser(Figura 5D,E). Não foram detectadas diferenças significativas com ou sem perfusão sistêmica antes da enucleação. Esses resultados demonstram aumento das populações de macrófagos e células dendríticas após lesão a laser sem alteração em microglia ou monócitos. Além disso, esses dados destacam como a citometria de fluxo de vários parâmetros pode detectar heterogeneidade macrófago.
| Anticorpo ou tampão | Fluoróforo | Clone | Quantidade por amostra (ng) |
| rato anti-rato Ly6C | FITC | AL-21 | 15 |
| mouse anti-mouse CD64 | Pe | X54-5/7.1 | 40 |
| rato anti-rato Tim4 | AlexaFluor 647 | RMT4-54 | 300 |
| hamster anti-mouse CD11c | BV 421 | HL3 | 300 |
| rato anti-rato Ly6G | PE-CF594 | 1A8 | 10 |
| camundongo anti-mouse NK1.1 | PE-CF594 | PK136 | 10 |
| rato anti-rato Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 20 |
| rato anti-rato B220 | PE-CF594 | RA3-6B2 | 20 |
| rato anti-rato CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | 40 |
| rato anti-rato CD4 | PE-CF594 | RM4-5 | 20 |
| rato anti-rato MHC II | AlexaFluor 700 | M5/114.15.2 | 2.5 |
| rato anti-rato CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 2 |
| rato anti-rato CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 6 |
| Tampão MACS |
Tabela 1: Fluoróforo de anticorpos e clones (ver passo 4.9). Geralmente, uma amostra é um ou dois olhos digeridos. Adicione o tampão de fluxo a um tubo primeiro, em seguida, cada anticorpo. Diluições podem ser feitas para evitar a tubulação muito pequena de um volume, enquanto altera o volume total do buffer de fluxo adequadamente. Consulte Tabela de Materiais para o número do produto e empresa.
| Laser | PMT Slot | Filtro | Espelho | Cores |
| Violeta (405nm) | Um | 525/50 | 505LP | V500 ou AmCyan |
| B | 450/50 | Pacific Blue, eFluor 450, V450 ou BV421 | ||
| Azul (488nm/FSC) | Um | 710/50 | 685LP | PerCP-Cy5.5, PerCP, PI ou 7AAD |
| B | 525/50 | 505LP | FITC, CFSE, GFP ou AlexaFluor 488 | |
| C | 488/10 | Ccd | ||
| Verde-Amarelo (561nm) | Um | 780/60 | 735LP | PE-Cy7 |
| B | 610/20 | 600LP | PE-CF594, mCherry ou DsRed2 | |
| C | 582/15 | Pe | ||
| Vermelho (640nm) | Um | 780/60 | 735LP | APC-Cy7, APC-H7 ou APC-eFluor 780 |
| B | 730/45 | 690LP | AlexaFluor 700 | |
| C | 670/30 | APC ou AlexaFluor 647 |
Tabela 2: Configuração do citômetro de fluxo. Configuração do filtro e espelho para um cicímetro de quatro lasers e os fluoroforos disponíveis que podem ser detectados em cada canal. PMT = tubo fotomultiplier, FSC = dispersão para a frente, SSC = dispersão lateral.
| Anticorpo | Fluoróforo | Clone | Quantidade por CCS (ng) |
| rato anti-rato CD45 | FITC | 30-F11 | 500 |
| rato anti-rato CD19 | Pe | 1D3 | 40 |
| rato anti-rato Tim4 | AlexaFluor 647 | RMT4-54 | 100 |
| hamster anti-mouse CD11c | BV421 | HL3 | 200 |
| rato anti-rato Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 40 |
| rato anti-rato CD19 | AlexaFluor 700 | 1D3 | 200 |
| rato anti-rato CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 200 |
| rato anti-rato CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 200 |
| Live / Dead Dye | eFluor 506 | N/A | 1 μl |
Tabela 3: Fluoróforo de anticorpos e clones para controles de cor única. Cada anticorpo deve ser adicionado à conta de compensação adequada, conforme descrito nas etapas 5.3.1 – 5.3.3.
Figura 1: Tensão representativa configurada para o laser vermelho. (A) Controles de cor simples (SCCs) para Alexa647. À esquerda, o CCS para Alexa647 é mostrado. O meio esquerdo exibe o vazamento do Alexa647 SCC no canal Alexa700. O pico do Alexa647 SCC é mostrado em magenta e o diferencial de meta de 0,5 Log é exibido em ciano. Note que o pico é à esquerda (menos brilhante) do que a linha ciano. A direita média demonstra o derramamento do Alexa647 SCC no canal APC-Cy7. A direita ilustra as células do canal Alexa647. Observe que todas as células são menos brilhantes que a CCS (linha magenta). (B) CcS para Alexa700. A esquerda média mostra o CCS para Alexa700. A esquerda exibe o vazamento do Alexa700 SCC no canal Alexa647. A direita média demonstra o derramamento do Alexa700 SCC no canal APC-Cy7. O pico do Alexa700 SCC é mostrado em magenta e o diferencial de meta de 0,5 Log é exibido em ciano. Note que o pico é à esquerda (menos brilhante) do que a linha ciano. A direita ilustra as células do canal Alexa700. Observe que todas as células são menos brilhantes que a CCS (linha magenta). (C) CcS para APC-Cy7. Esquerda e meio-esquerda mostram o derramamento do APC-Cy7 SCC em Alexa647 e Alexa700, respectivamente. Note que ambos os picos são à esquerda da linha ciano. A direita média demonstra o CCS ACP-Cy7. A direita ilustra as células do canal APC-Cy7. Observe que todas as células são menos brilhantes que a CCS (linha magenta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Identificação representativa de contas de contagem, singlets e células vivas. (A) Área de dispersão lateral (SSC-A) vs área de dispersão dianteira (FSC-A) para todas as células em uma trama de contorno. As contas de contagem são identificadas por SSC-A alto, FSC-A baixo, e agrupamento muito apertado das contas uniformes. (B) PE vs APC-Cy7 parcela para portão de contas limpa. A seta entre A e B indica plotagem apenas dos eventos positivos da contagem. As contas de contagem limpa são delineadas por pe alta e baixa fluorescência APC-Cy7. (C) FSC-Height (FSC-H) vs FSC-Area (FSC-A) parcela de todas as células demonstra células singlet em uma linha ampla positivamente correlacionada. Doublets e outros multiplets mostram maior área FSC do que FSC-Height. (D) Ao vivo / Dead vs FSC-A para células singlet. As células vivas são definidas como Live / Dead low e FSC-A positivo. As porcentagens indicam por cento dos pais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Identificação representativa de fagocitos mononucleares. Esquerda: CD45 vs CD11b trama pseudocolor de células vivas de não-açoitadas(A),laser(B)e controle de fluorescência menos um (FMO) controle (C). Esquerda: As células CD45+ são definidas em A-B e ausentes no FMO. Observe o aumento das células CD45+CD11b+ no grupo laser(B). Meio: Gráfico pseudocolor de linhagem (Lin) marcador vs CD11b para células CD45+. CD11b+Lin- as células são delineadas em A-B e estão ausentes no FMO para CD11b (inferior). Certo: CD11b vs CD45 parcela de CD11b+Lin- células. Cd45dim e CD45células altas são identificadas. Observe o aumento das célulasaltas CD45 no grupo laser (B). As porcentagens indicam por cento dos pais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Identificação representativa de microglia, células dendríticas, monócitos e subconjuntos de macrófagos. Esquerda: Cd64 vs MHCII pseudocolor plot de célulasdim CD45 define microglia como CD64+MHCIIbaixo. Observe a quantidade semelhante de microglia em grupos não-açoitados (A) e laser(B)e a ausência de microglia no controle FMO(C). Meia esquerda: Cd64 vs MHCII trama pseudocolor de célulasaltas CD45 define CÉLULAS MHCII- macrófagos como CD64+MHCII-, monócitos como CD64-MHCII-e células MHCII+ . Observe o aumento do MHCII- macrófagos no grupo laser (B), a ausência de células MHCII+ no FMO (C, médio) e o CD64 FMO (C, à esquerda) ajudaram a determinar o corte para células CD64+ e CD64- . Meio-direito: CD64 vs CD11c trama pseudocolor de células MHCII+. CD11c- macrófagos foram definidos como CD64+CD11c-, CD11c+ macrófagos foram identificados como CD64+CD11c+, e células dendríticas (DCs) foram delineadas como CD64-CD11c+. Ambos os subconjuntos de macrófagos e células dendríticas foram aumentados com laser (B). Observe a ausência de células CD11c+ no FMO (C). Direito: Ly6C vs Tim4 trama pseudocolor de monócitos. Ly6C clássico+ e Ly6C não clássico- monócitos foram identificados. Note que os monocitos clássicos Ly6C+ estavam ausentes no Ly6C FMO (C). As porcentagens indicam por cento dos pais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Dados representativos para fagocitos mononucleares entre camundongos não-perfurados e laserados com e sem perfusão sistêmica. As contagens de macrófagos MHCII- (A),CD11c- (B)e CD11c+ (C)foram todas aumentadas com laser. Não foram detectadas alterações entre microglia não-lavrada e laser(D)ou monócitos(E). As células dendríticas (DC) também foram aumentadas com laser(F). Brown Forsythe e Welch ANOVA com o teste de comparação múltipla T3 de Dunnett foram usados para definir diferenças estatísticas devido a variâncias desiguais entre os grupos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A citometria de fluxo de vários parâmetros permite a análise quantitativa de múltiplos tipos de células em um tecido complexo. Neste relatório, descrevemos a detecção citométrica de fluxo de populações de fagocitos mononucleares, incluindo monócitos, células dendríticas e subconjuntos de macrófagos, após lesão a laser no olho do rato. Liyanage et al relataram recentemente uma estratégia semelhante de gating para detectar neutrófilos, eosinófilos, linfócitos, DCs, macrófagos, macrófagos infiltrados e monócitos27. Nossa estratégia de gating difere principalmente pela adição de CD64. Liyanage et al identifica DC como CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ células, e macrófagos como CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- células. Identificamos DC como CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- células e macrófagos como CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD64+ células. O uso do CD64 para discriminar DC a partir de macrófagos é bem estabelecido6, e essa estratégia nos permite identificar a heterogeneidade macrófago, incluindo macrófagos CD11c+. A maior limitação deste método é que ele não fornece dados sobre arquitetura tecidual ou a localização de células específicas dentro do olho. A fim de determinar se essas células estão na retina, coroide, íris ou outra estrutura ocular, nosso protocolo pode ser combinado com métodos histológicos ou modificado para incluir dissecção oftálmica mais extensa para executar individualmente citometria de fluxo de vários parâmetros em cada subcomentamento ocular.
Otimizamos o protocolo de digestão de olhos inteiros do rato para evitar qualquer variância criada pela dissecação. Por exemplo, a dissecção de copos oculares posteriores com remoção de córnea, íris e lentes poderia criar variabilidade de íris retida ou material córnea (sub-dissecção) ou aumento da lesão a laser para a área normal do copo ocular posterior (dissecção excessiva). Nossa comparação entre o controle não de olhos sem pele e olhos laser detecta a infiltração de faócitos mononucleares por causa de lesão retinocórida. Para a análise dos efeitos das doenças sistêmicas no olho, ou seja, uveíte e diabetes, a análise individual de subcomentamento ocular é essencial. O método de digestão, na seção 2 do protocolo, é o mais crítico, enquanto outras etapas nas seções 3 - 5 têm sido usadas com sucesso em múltiplos tipos de tecido24. Chegamos às nossas condições de digestão através de um método iterativo que envolvia: (1) testes do método de digestão química (Colagenase D vs enzima digestão), (2) determinação do comprimento da digestão química (30, 60 e 90 minutos) e (3) adição de digestão mecânica (nenhuma, uma, duas, três vezes). Em cada etapa, julgávamos o sucesso das condições de digestão por viabilidade celular e número de células CD45HiCD64+ (infiltrando macrófagos). Descobrimos que a enzima de digestão (ver Tabela Suplementar de Materiais) recuperou mais células vivas do que a Colagenase D e a tentativa de metade da concentração de enzimas de digestão resultou em menos macrófagos infiltrados. Em seguida, 60 minutos de digestão química com digestão mecânica quase dobraram as populações de macrófagos infiltrados. Três digestões mecânicas foram ótimas com 25-30% de células vivas de singlets e as populações de macrófagos mais infiltradas. Finalmente, condições de digestão mecânica mais rápidas causaram perda severa de células vivas e macrófagos.
No futuro, propomos estender o método removendo a córnea, íris e lente seguidas pela digestão separada da retina e do copo posterior dos olhos (esclera, coroide e epitélio pigmentado da retina). Com essa modificação, esperamos reduzir as condições de digestão devido às características proteináceas e densas da lente e córnea, respectivamente. Essas reduções podem incluir redução da concentração de enzimas de digestão, mudança para Colagenase, diminuição do tempo de digestão ou diminuição da quantidade de digestão mecânica. Esperamos condições gerais de digestão reduzidas para o copo ocular posterior, e condições de digestão ainda mais reduzidas apenas para retina.
Direções futuras adicionais incluem a expansão do nosso painel convencional de citometria de fluxo de vários parâmetros para um instrumento laser 6 convencional ou citometria de fluxo espectral. A citometria de fluxo espectral permite a detecção de fluoróforos em todo o espectro, em vez de determinada pelos filtros disponíveis. A citometria do fluxo espectral resulta em detecção de cores mais específica. No entanto, a citometria do fluxo espectral requer um conjunto totalmente novo de considerações a serem seguidas e está além do escopo deste manuscrito. Para mais detalhes, consulte este recente artigo28da JoVE . Os 6 instrumentos laser incluem um laser ultravioleta, que adiciona detectores 6-9. Ao adicionar marcadores a um painel de citometria de fluxo ocular do mouse, recomendamos a detecção de tipos de células mais oculares. Por exemplo, o portão de Linhagem poderia ser separado para detectar neutrófilos, eosinófilos, células de mastro, células NK e linfócitos independentemente. Não é recomendável aumentar a detecção de subconjuntos de fagocitos mononucleares devido ao pequeno número de macrófagos em estado estável. Ao adicionar novos anticorpos, sugerimos titulação cuidadosa de anticorpos.
Em resumo, apresentamos um método adaptável e robusto para a detecção de populações de fagocitos mononucleares no olho do camundongo. Devido aos marcadores de superfície celular altamente sobrepostos de monócitos, células dendríticas, macrófagos e microglia, a citometria de fluxo multi-parâmetro é o melhor método para detectar essas populações celulares. A citometria de fluxo pode ser usada para análise de tipos celulares, mapeamento de destinos e/ou classificação celular para avaliação transcriômica ou proteômica. Sua maior limitação é a falta de arquitetura tecidual, e os principais achados podem ser confirmados usando histologia tradicional.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A JAL foi apoiada pela concessão do NIH K08EY030923; A CMC foi apoiada por uma bolsa K01 (5K01AR060169) do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticos do NIH e uma Nova Bolsa de Pesquisa (637405) da Lupus Research Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
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