Summary
Questo protocollo fornisce un metodo per digerire interi occhi in una singola sospensione cellulare ai fini dell'analisi citometrica del flusso multi-parametro al fine di identificare specifiche popolazioni fagocitiche mononucleari oculari, inclusi monociti, microglia, macrofagi e cellule dendritiche.
Abstract
Il sistema immunitario innato svolge ruoli importanti nella fisiopatologia oculare tra cui uveite, retinopatia diabetica e degenerazione maculare legata all'età. Le cellule immunitarie innate, in particolare i fagociti mononucleari, esprimono marcatori di superficie cellulare sovrapposti, il che rende l'identificazione di queste popolazioni una sfida. La citometria a flusso multi-parametro consente l'analisi simultanea e quantitativa di marcatori di superficie a più celle al fine di differenziare monociti, macrofagi, microglia e cellule dendritiche negli occhi del topo. Questo protocollo descrive l'enucleazione di interi occhi del topo, la dissezione oculare, la digestione in una singola sospensione cellulare e la colorazione della sospensione a singola cella per marcatori cellulari mieloidi. Inoltre, spieghiamo i metodi appropriati per determinare le tensioni utilizzando controlli a colori singoli e per delineare cancelli positivi utilizzando la fluorescenza meno un controllo. La principale limitazione della citometria a flusso multi-parametro è l'assenza di architettura tissutale. Questa limitazione può essere superata dalla citometria a flusso multi-parametro dei singoli compartimenti oculari o dalla colorazione gratuita dell'immunofluorescenza. Tuttavia, l'immunofluorescenza è limitata dalla sua mancanza di analisi quantitativa e dal numero ridotto di fluorofori sulla maggior parte dei microscopi. Descriviamo l'uso della citometria a flusso multi-parametrico per fornire un'analisi altamente quantitativa dei fagociti mononucleari nella neovascolarizzazione coroiroidale indotta dal laser. Inoltre, la citometria a flusso multi-parametro può essere utilizzata per l'identificazione di sottoinsiemi di macrofagi, mappatura del destino e smistamento delle cellule per studi trascritomici o proteomici.
Introduction
Il sistema immunitario innato include più tipi di cellule che stimolano l'attivazione e l'infiammazione del complemento. Le cellule immunitarie innate includono cellule killer naturali (NK), mastociti, basofili, eosinofili, neutrofili e fagociti mononucleari. I fagociti mononucleari, che sono composti da monociti, macrofagi e cellule dendritiche, sono stati implicati nella fisiopatologia di molteplici condizioni oftalmiche tra cui uveite, retinopatia diabetica e degenerazione maculare legata all'età (AMD)1. In questo protocollo, ci concentreremo sull'identificazione dei fagociti mononucleari utilizzando l'analisi citometrica del flusso multi-parametro in un modello di topo di AMD2 neovascolare. Questo protocollo è adattabile per i modelli di topo di retinopatia diabetica e / o uveite, ma è raccomandata una dissezione oculare più estesa a causa della natura sistemica di queste malattie.
I fagociti mononucleari esprimono marcatori di superficie cellulare sovrapposti. Macrofagi e microglia residenti nel tessuto di lunga durata provengono dal progenitore eritemicomieloide derivato dal sacco del tuorlo 3 ,mentreil riciclaggio di macrofagi e cellule dendritiche si differenzia dal progenitore di cellule dendritiche a midollo osseo4. I marcatori di superficie delle celle del mouse comuni a monociti, macrofagi e celle dendritiche includono CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17e il marcatore intracellulare Iba18. Per superare questa sfida, l'analisi trascrittamica di macrofagi, monociti e cellule dendritiche provenienti da più tessuti definisce il CD64 come un marcatore di superficie cellulare specifico del macrofago6. I macrofagi sono stati descritti nell'iride, nella coroide, nel corpo ciliare e nel nervo ottico negli occhi sani3. In alternativa, l'identificazione delle cellule dendritiche è più difficile; il metodo più specifico di identificazione delle cellule dendritiche richiede la mappatura del destino utilizzando il mouse reporter Zbtb46-GFP9. Indipendentemente da questa linea di reporter, l'espressione di CD11c e MHCII in combinazione con l'assenza di CD64 può identificare potenziali cellule dendritiche6,10. Le cellule dendritiche sono state identificate in cornea, congiuntiva, iride e coroide negli occhi normali11. Le microglia sono macrofagi specializzati situati nella retina, protetti dalla barriera emato-retinica e derivati dalle cellule progenitrici del sacco tuorlo12. Di conseguenza, le microglia retiniche possono essere differenziate dai macrofagi derivati dai monociti per i loro livelli fiochi di espressione CD4513 e alti livelli di Tmem119, che è disponibile come anticorpo di citometria aflusso 14. All'attivazione delle microglia, tuttavia, CD45 può essereregolato 15 e Tmem119 può essere regolato verso il basso3, dimostrando la complessità della biologia delle microglia e questo è probabilmente rilevante sia nell'AMD che nel suo modello di mouse. Infine, i monociti possono essere divisi in almeno due sottotipi, inclusi classici e non classici. I monociti classici mostrano CCR2+Ly6Caltaespressione bassa CX3CR1, e monociti non classici dimostrano CCR2-Ly6CbassoCX3CR1marcatori alti5.
A causa della necessità dell'analisi quantitativa dell'espressione marcatore, cioè livelli alti rispetto a bassi/ fiochi, la citometria del flusso multi-parametro è il metodo ideale per la discriminazione tra monociti, macrofagi, microglia e cellule dendritiche nell'occhio e in altri tessuti. Ulteriori vantaggi includono l'identificazione delle sotto-popolazioni, la possibilità di utilizzare lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per ordinare le popolazioni cellulari per l'analisi trascri o proteomica e la mappatura del destino. Il principale svantaggio della citometria a flusso multi-parametro è la mancanza di architettura tissutale. Questo può essere superato dalla dissezione oftalmica nei vari sottocomparti oculari: cornea, congiuntiva, iris, lente, retina e complesso coroide-sclera. Inoltre, è possibile eseguire l'imaging di immunofluorescenza di conferma, ma è limitato dal numero di marcatori e dalla mancanza di una quantificazione robusta.
Studi di associazione a livello genomico hanno collegato più geni di complemento con AMD16. L'attivazione del complemento porta alla produzione di anafilatossina, al reclutamento di leucociti e alla conseguenza infiammazione. Nei topi carenti del recettore del complemento, la lesione laser riduce il reclutamento di fagociti mononucleari e l'area di neovascolarizzazione coroiroidale indotta dal laser (CNV)17. Allo stesso modo, il recettore della chemiochina con motivo C-C 2 (CCR2) topo knockout, che è carente nel reclutamento di monociti nel tessuto, dimostra sia la diminuzione del reclutamento di fagociti mononucleari che l'area CNV indotta dal laser18. Questi dati collegano complementi e fagociti mononucleari con CNV sperimentale e possibilmente AMD neovascolare. A sostegno di questa associazione, i recettori del complemento sono disregolati sui monociti del sangue periferico in pazienti con AMD neovascolare19,20. Questi dati dimostrano una forte associazione tra AMD e fagociti mononucleari.
In questo manoscritto, useremo il modello sperimentale CNV indotto dal laser per caratterizzare le popolazioni di fagociti mononucleari nell'occhio del topo usando citometria a flusso multi-parametro. La CNV indotta dal laser è il modello standard di topo dell'AMD neovascolare, che ha dimostrato l'efficacia dell'attuale terapia amd neovascolare di primalinea 21. Questo protocollo descriverà l'enucleazione degli occhi del topo, la dissezione oculare, la digestione in una singola sospensione cellulare, la colorazione degli anticorpi, la determinazione delle tensioni laser utilizzando controlli a colori singoli e la strategia di gating utilizzando controlli di fluorescenza meno uno (FMO). Per una descrizione dettagliata del modello CNV indotto dal laser, si veda una pubblicazione precedente22. Utilizzando questo protocollo, definiremo microglia, monociti, cellule dendritiche e popolazioni di macrofagi. Inoltre, utilizzeremo MHCII e CD11c per definire ulteriormente sottoinsiemi di macrofagi all'interno del modello CNV indotto dal laser.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Northwestern University. I topi C57BL/6 erano alloggiati in una struttura barriera presso il Center for Comparative Medicine della Northwestern University (Chicago, IL). Tutti gli animali sono stati ospitati in un ciclo chiaro /scuro di 12/12 ore con libero accesso a cibo e acqua.
1. Raccolta del tessuto oculare
- Sacrifica topi C57BL/6J di 10-12 settimane di entrambi i sessi usando la somministrazione regolamentata di anidride carbonica fino a quando il topo non risponde e non inala più. Eseguire la lussazione cervicale o altro metodo secondario approvato per garantire l'eutanasia.
NOTA: La perfusione transcardica può essere eseguita per rimuovere i leucociti circolanti che non si trovano nei tessuti oculari. In questo esperimento, la perfusione sistemica non riduce il numero di microglia, monociti, macrofagi o cellule dendritiche rilevate in interi occhi non trattati o trattati al laser. Pertanto, la maggior parte di questi tipi di cellule si trova nei tessuti oftalmici e questo passaggio è facoltativo. - Per enucleare gli occhi, spingere verso il basso vicino all'orbita oculare mentre si posiziona un paio di forcette curve delicatamente sotto l'occhio mentre si distingue dalla presa. Pizzicare le plesse chiuse sotto l'occhio senza spremere l'occhio reale. Dislodge l'occhio dalla congiuntiva circostante (si veda la pubblicazione preliminare)23.
- Tirare l'occhio lateralmente fino a quando il nervo ottico è l'unica connessione rimasta per staccare l'occhio. Il nervo ottico spesso si taglia con tensione, ma una piccola forbice è talvolta necessaria per tagliare il nervo ottico. Mettere l'occhio in freddo 1x Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) con calcio e magnesio in tubo microcentrifugo da 1,7 ml.
2. Digestione del tessuto oculare
- Preparare il tampone di digestione contenente 0,1 mg/mL di digestione enzima e 0,2 mg/mL di DNasi in HBSS freddo. Ricostituire inizialmente 5 mg di enzima di digestione in 2 mL di acqua sterile. Preparare una diluizione iniziale di 10 mg/mL di DNasi in HBSS. Per ogni 10 mL del tampone di digestione (sufficiente per 3 animali) mescolare 9,4 mL di HBSS freddo con 0,4 mL di enzima di digestione ricostituito e 0,2 mL di DNasi I diluita.
NOTA: Queste concentrazioni sono state determinate empiricamente su più esperimenti per fornire livelli ottimali di colorazione degli anticorpi di singole cellule, riducendo al contempo la morte cellulare. La collagenasi D è stata provata come alternativa all'enzima di digestione con ridotta vitalità cellulare e diminuzione delle celluleCD45 +. Si prega di vedere Discussione per ulteriori dettagli sul processo iterativo per ottimizzare la digestione. - Al microscopio sezionato con ingrandimento totale 10x, rimuovere la congiuntiva rimanente e il nervo ottico utilizzando forcep fini e forbici a molla in HBSS freddo.
- Spostare gli occhi puliti su un piatto di sezionatura asciutta o su una piccola barca di pesatura. Iniettare 0,15-0,20 mL/occhio del tampone di digestione tramite siringa dotata di ago da 30 G nella cavità vitrea dopo che due ferite perforate sono fatte nell'occhio attraverso l'asse visivo e a 90° di distanza da questa prima ferita per l'uscita del tampone di digestione.
- Tritare gli occhi interi usando forbici a molla e forcep fini con tutti i pezzi più piccoli di 0,5 mm x 0,5 mm. Dissociare il tessuto delle lenti con interruzione meccanica smussata tramite forcep per evitare l'intasamento delle punte delle pipette nei passaggi successivi. Per ogni campione, sciacquare le forcep e le forbici ognuna con 0,75 mL di tampone di digestione in un piccolo piatto. Utilizzare un nuovo piatto per ogni campione.
- Trasferire il contenuto del piatto in un tubo di dissociazione sul ghiaccio utilizzando pipetta P1000 facendo attenzione a non perdere alcun materiale nel trasferimento della pipetta. Risciacquare il piatto con ulteriori 1,5 ml di tampone di digestione portando il volume totale nel tubo di dissociazione a 3,25-3,50 ml.
- Posizionare il tubo di dissociazione invertito sul dissociatore elettronico e eseguire il ciclo "m_brain_03_01", costituito da una rotazione unidirezionale di 1 min a 200 giri/min a temperatura ambiente, che è un programma precaricato. Assicurarsi che tutto il tessuto si trova nella parte inferiore del tubo di dissociazione a contatto con il tampone di digestione e il rotore per questo e tutti i passaggi rimanenti.
- Posizionare il tubo di dissociazione nell'incubatore di scuotimento per 30 minuti a 200 giri/min a 37 °C.
- Ripetere i passaggi 2.6 e 2.7 una volta in più. Dopo la seconda incubazione di 30 minuti eseguire un'ultima digestione meccanica utilizzando dissociatore elettronico come nella fase 2.6.
- Interrompere la reazione aggiungendo 10 ml di tampone di flusso freddo e posizionare i tubi sul ghiaccio.
3. Preparazione della sospensione cellulare
- Per creare una sospensione a cella singola, versare la reazione di digestione oculare interrotta attraverso un filtro da 40 μm posto sulla parte superiore di un tubo di centrifuga conico da 50 ml. Utilizzando lo stantuffo da una siringa da 2,5 ml, spingere tutti i restanti pezzi di tessuto oculare non digerito attraverso il filtro.
- Lavare il tubo di dissociazione con 10 ml di flow buffer e risciacquare il filtro prima di utilizzare lo stesso pistone per passare nuovamente pezzi di tessuto oculare non digeriti attraverso il filtro.
- Ripetere il passaggio 3.2 utilizzando 5 mL di Flow buffer.
- Lavare il tubo di dissociazione e filtrare con un buffer di flusso finale di 10 ml.
NOTA: Il volume totale della digestione e del buffer di flusso è di circa 38-40 mL per ogni campione. - Centrifugare il tubo conico a 400 x g per 10 min a 4 °C. Decantare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Preparare una soluzione di lysing 1x aggiungendo una soluzione di lysing 10x all'acqua sterile. Rompere il pellet sfarfallando il tubo contro un altro tubo. Per lyse globuli rossi, aggiungere 1 mL di soluzione di lysing 1x per 30 s con vorticoso a temperatura ambiente (RT).
- Interrompere la reazione con 20 mL di flow buffer.
- Centrifugare il tubo conico a 400 x g per 10 min a 4 °C. Decantare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Dissociare il pellet sfarfallando il tubo contro un altro tubo. Aggiungere 5 ml di HBSS freddo 1x per tubo.
- Tubi di centrifuga a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspira il supernatante.
4. Colorazione della sospensione cellulare per fagociti mononucleari
- Preparare 0,5 mL di macchia Viva/Morta per campione diluire il colorante Vivo/Morto 1:5.000 in HBSS freddo.
- Aggiungere la macchia Live/Dead a ciascun campione utilizzando una pipetta P1000 assicurandosi di dissociare completamente il pellet. Trasferire campioni in tubi microtitolo da 1,2 ml.
- Prendere una piccola aliquota (10 μL) per contare le cellule usando un emocitometro o un contatore automatico delle celle (vedere 4.4). Incubare campioni con macchia viva / morta per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Contare le celle usando Trypan blue per determinare il numero di celle vive per campione.
NOTA: In genere, 2 occhi di un topo C57BL/6J di 10-12 settimane contengono meno di 2 x 106 cellule viventi. - Lavare i campioni aggiungendo 400 μL di tampone di flusso freddo. Tubi di centrifuga in un micro portatubi a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Resuspend cellule completamente in 500 μL di tampone di flusso freddo. Tubi di centrifuga in un micro portatubi a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Bloccare fino a 5 x 106 cellule viventi in 50 μL di blocco Fc (diluizione 1:50 nel tampone di flusso freddo del CD16/CD32 del ratto purificato). Se più di 5 x 106 cellule viventi, aumentare i volumi in modo appropriato.
- Aggiungere il blocco Fc al pellet assicurandosi di dissociare completamente il campione. Incubare per 20 min a 4 °C.
- Aggiungere 50 μL di soluzione di colorazione degli anticorpi (vedere la tabella 1 per la scelta e la quantità di ciascun anticorpo incluso nella soluzione) per 5 x 106 cellule viventi direttamente alle cellule in blocco Fc e mescolare completamente. Incubare per 30 min a 4 °C.
NOTA: Le quantità di anticorpi dipendono dalla configurazione del citometro del flusso e devono essere titole indipendentemente per ogni laboratorio e strumento. Cfr. tabella 2 per la configurazione dello strumento di filtri e specchi. Per titolare gli anticorpi, inizia con la raccomandazione del produttore e calcola l'indice di colorazione. Eseguire una prova di concentrazioni di anticorpi variabili (sia al di sopra che al di sotto della raccomandazione del produttore) e scegliere la concentrazione più bassa di anticorpi in cui viene mantenuto l'indice di colorazione. Inoltre, assicurarsi che la colorazione positiva sia meno luminosa del controllo monocolore. Utilizzare celle non macchiate per assicurarsi che le celle macchiate negativamente siano in scala e abbiano un picco a o meno di 1 x 102. Utilizzare una fluorescenza meno un controllo per definire le celle macchiate positivamente. - Lavare i campioni aggiungendo 700 μL di tampone di flusso freddo. Tubi di centrifuga in un micro portatubi a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Opzionalmente, dopo la colorazione degli anticorpi, i campioni possono essere fissati con 500 μL di paraformaldeide al 2% nel tampone di flusso. Fissare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, eseguire un lavaggio come descritto nella 4.10. Conservare campioni fissi a 4 °C. Le perline di conteggio devono essere aggiunte il giorno della raccolta dei dati della citometria del flusso. I campioni fissi devono essere eseguiti sul citometro di flusso in 1-2 giorni.
ATTENZIONE: La paraformaldeide è corrosiva e un pericolo per la salute. - Lavare nuovamente i campioni utilizzando 500 μL di tampone di flusso freddo. Tubi di centrifuga in un micro portatubi a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare metà del supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Resuspend pellets e trasferire in un pozzo 96, piastra di dosaggio con fondo a U. Piastra di centrifuga a 400 x g per 5 min a 4 °C. Per decantare il supernatante, capovolgere la piastra e in un forte shake sganciare il liquido in un lavandino, senza disturbare il pellet.
- In un nuovo tubo di micro mento da 1,2 ml, posizionare 50 μL di perline di conteggio ben vortexate.
- Resuspend pellets in 96 piastra di pozzo in 200 μL di tampone di flusso freddo. Aggiungere la miscela cellulare sulla parte superiore delle perline del passaggio precedente. Eseguire su citometro di flusso in volume totale di 250 μL / micro tubo di formicolio.
5. Raccolta dei dati di citometria del flusso
- Accendere e preparare il citometro a flusso. Le istruzioni qui elencate sono per un citometro laser modificato(tabella 2).
- Eseguire un campione di test, che include una piccola aliquota per ogni campione, per assicurarsi che tutte le celle siano in scala per ogni rilevatore. Regolare le tensioni in modo che tutte le celle siano in scala.
- Eseguire controlli a colori singoli (SCC) per ogni fluoroforo utilizzato nel cocktail di colorazione (Tabella 3). Posizionare il tubo del micro titer in un tubo di polistirolo da 5 ml più grande per posizionarlo sullo stadio del citometro di flusso.
NOTA: I fluorofori delle radici come BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) e Alexa700 non richiedono lo stesso anticorpo del cocktail (ad esempio, CD19 PE per CD64 PE). Tuttavia, i fluorofori tandem come PE-CF594, PE-Cy7 o APC-Cy7 richiedono lo stesso anticorpo per scc come cocktail a causa della potenziale dissociazione dei fluorofori coniugati.- Creare l'SCC per BV421 aggiungendo 2 gocce di perline di compensazione a un tubo di piastrellatura da 1,2 ml insieme a 1 μL di CD11c BV421 anti-mouse del criceto. Le perline di compensazione sono usate perché CD11c BV421 è un sottotipo lambda IgG piuttosto che kappa come descritto al 5.3.3. Incubare per 15 minuti a 4 °C. Aggiungere 0,2 mL di buffer di flusso.
- Crea l'SCC per il colorante Live/Dead aggiungendo una goccia di perline di colorazione positive (cappuccio verde) dalle perline reattive dell'ammina, seguita da 1 μL di colorante Vivo/Morto. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Aggiungere una goccia delle perline negative (tappo bianco) dalle perline reattive dell'ammina. Aggiungere 0,2 mL di buffer di flusso.
- Creare i restanti SCC aggiungendo una goccia di perline di colorazione positive (cappuccio verde) dal set di perline Ig kappa anti-ratto e anti-criceto, seguito dalla quantità di anticorpi elencata(tabella 3)in un tubo di tattuccio da 1,2 ml. Incubare per 15 min a 4 °C. Aggiungi una goccia delle perline negative (berretto bianco) dal set di perline Ig kappa anti-ratto e anti-criceto. Aggiungere 0,2 mL di buffer di flusso.
- Vortice tutte le miscele di perline completamente. Conservare scc a 4 °C per un massimo di 3 giorni.
NOTA: L'SCC per topi reporter fluorescenti è cellule non contaminate. - Quando si eseguono SCC, impostare tensioni tali che il campione SCC abbia un picco maggiore di qualsiasi fluorescenza per un campione di celle nello stesso canale del rivelatore. Inoltre, le tensioni devono essere impostate in modo che qualsiasi SCC abbia almeno una differenza di log 0,5 tra il picco dell'istogramma nel canale di interesse rispetto a qualsiasi altro canale (Figura 1).
- Esegui esempi su eventi di mantenimento "Basso" al secondo sotto 4000. Se la portata non può essere abbassata in modo appropriato, diluire i campioni con un buffer di flusso freddo aggiuntivo. Registrare il volume aggiunto in quanto ciò sarà necessario per il calcolo del conteggio (vedere i risultati rappresentativi).
- Raccogli almeno 3 x 106 eventi per esempio. Questo può essere superiore al numero di cellule a causa di granuli di pigmento e detriti che contano come eventi sul citometro.
- Registrare una fluorescenza Meno Uno (FMO) per ogni fluoroforo diverso da Live/Dead per una corretta strategia di gating nella sezione 6.4. Un FMO è un campione che è stato macchiato con tutti i fluorofori tranne uno.
- Pulire e arrestare il citometro di flusso secondo le istruzioni del produttore o della struttura.
6. Annotazione dei dati di citometria del flusso
- Aprire un nuovo foglio di lavoro utilizzando il software di analisi. Importare file FCS dal citometro per tutti i campioni e i controlli a colori singoli.
- Utilizzare le SCC per creare una matrice di retribuzione.
- Applicare la matrice di compensazione ai campioni macchiati e alle FMO.
- Utilizzare le FMO per determinare la colorazione positiva per disegnare cancelli.
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Representative Results
La figura 1 mostra istogrammi di frequenza non compensati per i CSC e le celle per il laser rosso: Alexa647, Alexa700 e APC-Cy7. Nella figura 1A, la linea magenta raffigurava il picco dell'SCC per Alexa647, mentre la linea ciano mostrava la differenza di log 0,5 prevista. Si noti che il picco in Alexa700 e APC-Cy7 era a sinistra (meno luminoso) della linea ciano. Si noti inoltre che le celle erano tutte a sinistra della linea magenta. Tutte le cellule a destra del picco SCC non sono state compensate. È noto che canali specifici si riversano in altri basati sulla chimica dei coloranti fluorocromi (cioè Laser viola: BV421 -> V500, Laser giallo-verde: PE -> PE-CF594, Laser rosso: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, Cross Laser: PE-Cy7 -> APC-Cy7). Se una delle condizioni di cui sopra non fosse soddisfatta, la tensione di un canale potrebbe essere regolata verso l'alto mentre tutti i canali di fuoriuscita potrebbero essere spostati verso il basso. Per ulteriori esempi del laser rosso, vedere la figura 1B e la figura 1C. Una volta determinate e poi registrate le tensioni, tutti i campioni devono essere eseguiti con i parametri di tensione. Esiste una procedura guidata di configurazione dei compensi che può essere utile.
L'identificazione dei perline di conteggio è necessaria per la quantificazione del conteggio delle cellule. La figura 2A mostrava le proprietà FSC-A e SSC-A per tutti gli eventi analizzati da due occhi di un singolo mouse. È importante regolare la tensione SSC per assicurarsi che le perline di conteggio siano visibili come una raccolta molto stretta di eventi bassi SSC-A alti e FSC-A. I conteggi delle perline sono stati puliti e confermati tracciando PE vs APC-Cy7 (Fig 2B). Le perline pulite erano un gruppo stretto di eventi PE+ e APC-Cy7.
I singlet e le cellule vive sono stati successivamente identificati da tutti gli eventi. I singlet sono stati determinati tracciando FSC-H vs FSC-A. I singlet erano positivamente correlati in queste due proprietà, mentre le celle a doppietta e tripletta avevano fsc-a maggiore rispetto a FSC-H (Figura 2C). Le cellule vive sono state delineate tracciando Live / Dead vs FSC-A. Le cellule morte erano positive vive / morte e le cellule dimostrano un FSC-A maggiore rispetto ai detriti (Fig 2D). Si noti che le perline di conteggio erano Live / Dead+ e sono state rimosse in questo passaggio.
La figura 3 mostra la strategia iniziale di dente per la delimitazione dei fagociti mononucleari provenienti da cellule singole vive. I singlet live sono stati visualizzati utilizzando un grafico CD45 rispetto a CD11b (Figura 3, a sinistra). Si noti che CD45+CD11b- (principalmente cellule B e T), CD45dimCD11b+ (microglia putativa) e CD45+CD11b+ cellule (infiltrando le cellule immunitarie, aumentate con laser [Fig 3B, a sinistra]) sono state selezionate. L'assenza di celle CD45+ nel CD45 FMO ha confermato la selezione del gate(Figura 3C,a sinistra). Poi, i neutrofili, gli eosinofili, le cellule B, le cellule NK e le cellule T sono stati esclusi tracciando CD45+ singolette live usando lineage gate (Lin: Ly6G [neutrofili], SiglecF [eosinofili], B220 [cellule B], NK1.1 [cellule NK], CD4 [cellule T], e CD8 [cellule T]) vs CD11b. L'aumento delle cellule CD11b+Lin- tra i gruppi No Laser(Figura 3A,media) e Laser(Figura 3B, al centro) è stato facilmente osservato. Si noti la mancanza di cellule CD11b+Lin- nell'FMO CD11b(Figura 3C, al centro) e la mancanza di cellule Lin+ nell'FMO Lin(Figura 3C, a destra). Le microglia possono essere separate dai fagociti mononucleari infiltrati per la quantità di espressione CD4513,24. CD11b+Lin- le cellule sono state visualizzate utilizzando un grafico CD11b vs CD45 per identificare microgliadim putative CD45 e phagociti mononucleari adalta infiltrazione CD45. L'aumento relativo degli alti fagociti mononucleari cd45 è stato evidente nel topo trattato al laser(figura 3A,B,a destra).
La figura 4 ha identificato microglia, tre sottoinsiemi di macrofagi, monociti e cellule dendritiche. Le microglia sono state determinate tracciando lecelle fioche CD45 su un grafico CD64 vs MHCII(Figura 4,pannello sinistro). Microglia ha dimostrato di essere CD64+MHCIIbasso precedentemente 13. Le microglia sono rimaste relativamente invariate con il laser e assenti nel CD64 FMO(Figura 4A,C a sinistra). Le celle alteCD45 sono state successivamente tracciate sullo stesso grafico CD64 vs MHCII. CD64+MHCII- macrofagi (MHCII- Mac), CD64-MHCII- monociti e MHCII+ cellule sono stati identificati(Figura 4A,B,centro a sinistra). Si noti l'assenza di cellule MHCII+ nell'FMO MHCII(Figura 4C, centro sinistra). Le cellule MHCII+ sono state ulteriormente discriminate utilizzando CD64 e CD11c. CD64+CD11c- macrofagi (CD11c- Mac), CD64+CD11c+ macrofagi (CD11c+ Macs) e CD64-CD11c+ cellule dendritiche (CD) sono stati definiti(Figura 4A,B, centro a destra). Si noti l'assenza di celle CD11c+ nell'FMO CD11c(Figura 4C, centro destra). I monociti erano sottotipati come classici Ly6C+ o non classici Ly6C- monociti(Figura 4,a destra). Si noti l'assenza di Ly6C+ monociti nell'FMO Ly6C(Figura 4C,destra).
Il numero di celle per mouse (o per 2 occhi) è stato calcolato con la seguente equazione:
Usando i volumi in questo metodo, l'equazione è:
Il numero di celle e il conteggio delle perline saranno specifici per ogni campione. La concentrazione di perline è specifica per ogni lotto di perline di conteggio e fornita dal produttore su ogni flaconcino.
I macrofagi si infiltrano nella coroide dopo la lesione laser25e l'esaurimento del macrofago riduce l'area CNV18. Questi studi più vecchi si basano sull'imaging ad immunofluorescenza, che non può differenziare in modo affidabile i fagociti mononucleari, o meno marcatori citometrici a flusso per l'identificazione dei macrofagi. L'eterogeneità dei macrofagi è un concetto emergente nell'immunologia innata, in cui i macrofagi sono in grado di svolgere molteplici funzioni a seconda della loro origine e del microambientetissutale 12,26. Abbiamo eseguito citometria a flusso multi-parametro su occhi di topo non trattati e trattati al laser il giorno 3 dopo una lesione laser per identificare fagociti mononucleari ed eterogeneità del macrofago. Il trattamento laser ha aumentato MHCII-, CD11c-e CD11c+ macrofagi rispettivamente di 7,0-25,6, 2,8-7,2 e 3,9-8,2 volte(figura 5A,C). Anche il conteggio delle cellule dendritiche è stato regolato 4,5-4,7 volte dal laser (Figura 5F). I conteggi delle microglia e dei monociti non sono stati influenzati dal trattamento laser(figura 5D,E). Non sono state rilevate differenze significative con o senza perfusione sistemica prima dell'enucleazione. Questi risultati dimostrano un aumento delle popolazioni di macrofagi e cellule dendritiche dopo lesioni laser senza alcun cambiamento in microglia o monociti. Inoltre, questi dati evidenziano come la citometria a flusso multi-parametro possa rilevare l'eterogeneità dei macrofagi.
| Anticorpo o tampone | Fluorofo | Clone | Importo per campione (ng) |
| ratto anti-topo Ly6C | Fitc | Al-21 | 15 |
| CD64 anti-mouse del mouse | Pe | X54-5/7.1 | 40 |
| ratto anti-topo Tim4 | AlexaFluor 647 | RMT4-54 | 300 |
| criceto anti-mouse CD11c | BV 421 | Hl3 | 300 |
| ratto anti-topo Ly6G | PE-CF594 | 1A8 | 10 |
| mouse anti-mouse NK1.1 | PE-CF594 | PK136 | 10 |
| ratto anti-topo Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 20 |
| ratto anti-topo B220 | PE-CF594 | RA3-6B2 | 20 |
| ratto anti-mouse CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | 40 |
| ratto anti-mouse CD4 | PE-CF594 | RM4-5 | 20 |
| ratto anti-topo MHC II | AlexaFluor 700 | M5/114.15.2 | 2.5 |
| ratto anti-mouse CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 2 |
| ratto anti-mouse CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 6 |
| Buffer MACS |
Tabella 1: Fluoroforo anticorpale e cloni (cfr. fase 4.9). Generalmente, un campione è uno o due occhi digeriti. Aggiungere il buffer di flusso a un tubo prima di ogni anticorpo. Le diluizioni possono essere effettuate per evitare di pipeggiare un volume troppo piccolo, modificando al contempo il volume totale del buffer di flusso in modo appropriato. Vedi Tabella dei materiali per il numero di prodotto e la società.
| Laser | PMT Slot | filtro | Specchio | Colori |
| Viola (405nm) | Un | 525/50 | 505LP | V500 o AmCyan |
| B | 450/50 | Pacific Blue, eFluor 450, V450 o BV421 | ||
| Blu (488nm/FSC) | Un | 710/50 | 685LP | PerCP-Cy5.5, PerCP, PI o 7AAD |
| B | 525/50 | 505LP | FITC, CFSE, GFP o AlexaFluor 488 | |
| C | 488/10 | Ssc | ||
| Giallo-Verde (561nm) | Un | 780/60 | 735LP | PE-Cy7 |
| B | 610/20 | 600LP | PE-CF594, mCherry o DsRed2 | |
| C | 582/15 | Pe | ||
| Rosso (640nm) | Un | 780/60 | 735LP | APC-Cy7, APC-H7 o APC-eFluor 780 |
| B | 730/45 | 690LP | AlexaFluor 700 | |
| C | 670/30 | APC o AlexaFluor 647 |
Tabella 2: Configurazione del citometro di flusso. Configurazione del filtro e dello specchio per un citometro a quattro laser e dei fluorofori disponibili che possono essere rilevati in ogni canale. PMT = tubo fotomoltiplicatore, FSC = dispersione in avanti, SSC = dispersione laterale.
| Anticorpo | Fluorofo | Clone | Importo per SCC (ng) |
| ratto anti-mouse CD45 | Fitc | 30-F11 | 500 |
| ratto anti-mouse CD19 | Pe | 1D3 | 40 |
| ratto anti-topo Tim4 | AlexaFluor 647 | RMT4-54 | 100 |
| criceto anti-mouse CD11c | BV421 | Hl3 | 200 |
| ratto anti-topo Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 40 |
| ratto anti-mouse CD19 | AlexaFluor 700 | 1D3 | 200 |
| ratto anti-mouse CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 200 |
| ratto anti-mouse CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 200 |
| Colorante vivo / morto | eFluor 506 | N/D | 1 μl |
Tabella 3: Fluoroforo anticorpale e cloni per controlli monocolore. Ogni anticorpo deve essere aggiunto al tallone di compensazione appropriato come indicato nei passaggi da 5.3.1 a 5.3.3.
Figura 1: Tensione rappresentativa impostata per il laser rosso. (A) Controlli a colori singoli (SCC) per Alexa647. A sinistra viene mostrato l'SCC per Alexa647. Il centro sinistro mostra la fuoriuscita dell'SCC Alexa647 nel canale Alexa700. Il picco dell'Alexa647 SCC è mostrato in magenta e il differenziale obiettivo 0.5 Log viene visualizzato in ciano. Si noti che il picco è a sinistra (meno luminoso) rispetto alla linea ciano. Il centrodestra dimostra la fuoriuscita dell'SCC Alexa647 nel canale APC-Cy7. A destra vengono illustrate le celle del canale Alexa647. Si noti che tutte le celle sono meno luminose della SCC (linea magenta). (B) CCN per Alexa700. Il centrosinistra mostra l'SCC per Alexa700. A sinistra viene visualizzata la fuoriuscita dell'SCC Alexa700 nel canale Alexa647. Il centrodestra dimostra la fuoriuscita dell'SCC Alexa700 nel canale APC-Cy7. Il picco dell'Alexa700 SCC è mostrato in magenta e il differenziale obiettivo 0.5 Log viene visualizzato in ciano. Si noti che il picco è a sinistra (meno luminoso) rispetto alla linea ciano. A destra vengono illustrate le celle del canale Alexa700. Si noti che tutte le celle sono meno luminose della SCC (linea magenta). (C) CCN per APC-Cy7. Sinistra e centrosinistra mostrano la fuoriuscita dell'APC-Cy7 SCC rispettivamente in Alexa647 e Alexa700. Si noti che entrambi i picchi si trovano a sinistra della linea ciano. Il centrodestra dimostra l'SCC ACP-Cy7. A destra vengono illustrate le celle nel canale APC-Cy7. Si noti che tutte le celle sono meno luminose della SCC (linea magenta). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Identificazione rappresentativa di perline di conteggio, singoletti e cellule vive. (A) Area di dispersione laterale (SSC-A) rispetto all'area di dispersione in avanti (FSC-A) per tutte le celle di un grafico di contorno. Le perline di conteggio sono identificate da SSC-A alto, FSC-A basso e raggruppamento molto stretto delle perline uniformi. (B) Terreno PE vs APC-Cy7 per cancello di perline pulito. La freccia tra A e B indica la tracciatura solo degli eventi positivi al conteggio delle perline. Le perline a conteggio pulito sono delineate da UN alto e bassa fluorescenza APC-Cy7. (C) Il grafico FSC-Height (FSC-H) vs FSC-Area (FSC-A) di tutte le celle dimostra le cellule singole in una linea larga correlata positivamente. Doppietti e altri multipli mostrano un'area FSC maggiore rispetto all'altezza FSC. (D) Live / Dead vs FSC-A per le celle singlet. Le cellule vive sono definite come Live / Dead low e FSC-A positive. Le percentuali indicano la percentuale di padre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Identificazione rappresentativa dei fagociti mononucleari. A sinistra: Traccia pseudocolore CD45 vs CD11b di cellule vive da celle non slaserate (A), laserate (B) e fluorescenza meno un controllo (FMO) (C). A sinistra: le celluleCD45 + sono definite in A-B e assenti nell'FMO. Si noti l'aumento delle celle CD45+CD11b+ nel gruppo laserato (B). Al centro: Grafico pseudocolore del marcatore di lignaggio (Lin) rispetto a CD11b per CD45+ celle. CD11b+Lin- le celle sono delineate in A-B e sono assenti nell'FMO per CD11b (in basso). A destra: Traccia CD11b vs CD45 di CD11b+Lin- celle. Vengono identificatele celle alte CD45e CD45. Si noti l'aumento delle cellealte CD45 nel gruppo laserato (B). Le percentuali indicano la percentuale di padre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Identificazione rappresentativa di microglia, cellule dendritiche, monociti e sottoinsiemi di macrofagi. A sinistra: Il grafico pseudocolore CD64 vs MHCIIdelle celle fioche CD45 definisce le microglia come CD64+MHCIIbasse. Si noti la quantità simile di microglia in gruppi non slaserati (A) e laserati (B) e l'assenza di microglia nel controllo FMO (C). Centrosinistra: Il grafico pseudocolore CD64 vs MHCII delle celle alteCD45 definisce le celle MHCII- macrofagi come CD64+MHCII-, monociti come CD64-MHCII-e MHCII+. Si noti l'aumento dei macrofagi MHCII nel gruppo laserato (B), l'assenza di cellule MHCII+ nell'FMO (C, al centro) e il CD64 FMO (C, a sinistra) hanno contribuito a determinare il taglio per le cellule CD64+ e CD64 . Centrodestra: Grafico pseudocolore CD64 vs CD11c di MHCII+ celle. CD11c- macrofagi sono stati definiti come CD64+CD11c-, CD11c+ macrofagi sono stati identificati come CD64+CD11c+e le cellule dendritiche (CD) sono state delineate come CD64-CD11c+. Sia i sottoinsiemi di macrofagi che le cellule dendritiche sono stati aumentati con il laser (B). Si noti l'assenza di celle CD11c+ nell'FMO (C). A destra: grafico pseudocolore Ly6C vs Tim4 di monociti. Ly6C+ classico e Ly6C non classico- monociti sono stati identificati. Si noti che i classici Ly6C+ monociti erano assenti nel Ly6C FMO (C). Le percentuali indicano la percentuale di padre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Dati rappresentativi per i fagociti mononucleari tra topi non sbarrate e laserati sia con che senza perfusione sistemica. I conteggi dei macrofagi MHCII- (A), CD11c- (B) e CD11c+ (C) sono stati tutti aumentati con il laser. Non sono state rilevate modifiche tra microglia non smerigliata e laserata (D) o monociti (E). Anche le cellule dendritiche (DC) sono state aumentate con il laser (F). Brown Forsythe e Welch ANOVA con il test di confronto multiplo T3 di Dunnett sono stati usati per definire differenze statistiche dovute a varianze disuguali tra gruppi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La citometria a flusso multi-parametro consente l'analisi quantitativa di più tipi di cellule in un tessuto complesso. In questo rapporto, descriviamo il rilevamento citometrico del flusso delle popolazioni di fagociti mononucleari, inclusi monociti, cellule dendritiche e sottoinsiemi di macrofagi, dopo lesioni laser nell'occhio del topo. Liyanage et al ha recentemente riportato una strategia di gating simile per rilevare neutrofili, eosinofili, linfociti, PC, macrofagi, macrofagi infiltrati e monociti27. La nostra strategia di gating differisce principalmente dall'aggiunta di CD64. Liyanage et al identifica DC come celle CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ e macrofagi come CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- celle. Identifichiamo DC come CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- celle e macrofagi come CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD64+ celle. L'uso di CD64 per discriminare dc dai macrofagi è benconsolidato 6e questa strategia ci consente di identificare l'eterogeneità dei macrofagi, inclusi i macrofagi CD11c+. La principale limitazione di questo metodo è che non fornisce dati sull'architettura dei tessuti o sulla posizione di cellule specifiche all'interno dell'occhio. Per determinare se queste cellule si trovano nella retina, nel coroide, nell'iride o in un'altra struttura oculare, il nostro protocollo può essere combinato con metodi istologici o modificato per includere una dissezione oftalmica più estesa per eseguire individualmente la citometria del flusso multi-parametro su ogni sottocompartito oculare.
Abbiamo ottimizzato il protocollo per la digestione di interi occhi del mouse per prevenire qualsiasi varianza creata dalla dissezione. Ad esempio, la dissezione delle coppe oculari posteriori con rimozione di cornea, iris e lente potrebbe creare variabilità dall'iride trattenuta o dal materiale corneale (sottosezione) o un aumento della lesione laser alla normale area della coppa oculare posteriore (sovrasezione). Il nostro confronto tra il controllo degli occhi non laserati e laserati rileva l'infiltrazione di fagociti mononucleari a causa di lesioni retinochoridali. Per l'analisi degli effetti delle malattie sistemiche sull'occhio, vale a dire uveite e diabete, è essenziale l'analisi individuale del sottocommento oculare. Il metodo di digestione, nella sezione 2 del protocollo, è il più critico, mentre altri passaggi nelle sezioni 3 - 5 sono stati utilizzati con successo su più tipi ditessuto 24. Siamo arrivati alle nostre condizioni di digestione attraverso un metodo iterativo che ha comportato: (1) test del metodo di digestione chimica (collagenasi D vs enzima di digestione), (2) determinazione della lunghezza della digestione chimica (30, 60 e 90 minuti) e (3) aggiunta di digestione meccanica (nessuna, una, due, tre volte). Ad ogni fase abbiamo giudicato il successo delle condizioni di digestione in base alla vitalità cellulare e al numero di cellule CD45HiCD64+ (infiltrandosi nei macrofagi). La Corte ha riscontrato che l'enzima di digestione (vedi Tabella supplementare dei materiali) ha recuperato più cellule vive della collagenasi D e il tentativo della metà della concentrazione enzimatica di digestione ha comportato meno macrofagi infiltrati. Successivamente, 60 minuti di digestione chimica con digestione meccanica hanno quasi raddoppiato le popolazioni di macrofagi infiltrati. Tre digestione meccanica erano ottimali con il 25-30% di cellule vive di singoletti e le popolazioni di macrofagi più infiltrate. Infine, condizioni di digestione meccanica più veloci hanno causato una grave perdita sia di cellule vive che di macrofagi.
In futuro, proponiamo di estendere il metodo rimuovendo la cornea, l'iride e la lente seguite dalla digestione separata della retina e della coppa oculare posteriore (sclera, coroide ed epitelio pigmentato retinico). Con questa modifica, ci aspettiamo di ridurre le condizioni di digestione a causa delle caratteristiche proteiche e dense della lente e della cornea rispettivamente. Queste riduzioni potrebbero includere una ridotta concentrazione enzimatica di digestione, il passaggio alla collagenasi, una diminuzione del tempo di digestione o una minore quantità di digestione meccanica. Prevediamo condizioni di digestione ridotte complessive per la tazza posteriore degli occhi e ulteriori condizioni di digestione ridotte solo per la retina.
Ulteriori direzioni future includono l'espansione del nostro tradizionale pannello di citometria a flusso multi-parametro a uno strumento laser convenzionale a 6 o citometria a flusso spettrale. La citometria del flusso spettrale consente il rilevamento del fluoroforo su tutto lo spettro, piuttosto che determinato dai filtri disponibili. La citometria del flusso spettrale si traduce in un rilevamento del colore più specifico. Tuttavia, la citometria del flusso spettrale richiede una serie completamente nuova di considerazioni da seguire ed è al di fuori dell'ambito di questo manoscritto. Per maggiori dettagli, si prega di consultare questo recente articolo jove28. I 6 strumenti laser includono un laser ultravioletto, che aggiunge 6-9 rivelatori. Quando si aggiungono marcatori a un pannello di citometria del flusso oculare del mouse, si consiglia il rilevamento di tipi di cellule più oculari. Ad esempio, il cancello di lignaggio potrebbe essere separato per rilevare neutrofili, eosinofili, mastociti, cellule NK e linfociti in modo indipendente. Non è consigliabile aumentare il rilevamento del sottoinsieme dei fagociti mononucleari a causa del piccolo numero di macrofagi allo stato stazionare. Quando aggiungiamo nuovi anticorpi, suggeriamo un'attenta titolazione degli anticorpi.
In sintesi, abbiamo presentato un metodo adattabile e robusto per l'individuazione delle popolazioni di fagociti mononucleari nell'occhio del topo. A causa dei marcatori di superficie cellulare altamente sovrapposti di monociti, cellule dendritiche, macrofagi e microglia, la citometria a flusso multi-parametro è il metodo migliore per rilevare queste popolazioni cellulari. La citometria del flusso può essere utilizzata per l'analisi dei tipi di cellule, la mappatura del destino e/o lo smistamento cellulare per la valutazione trascritomica o proteomica. La sua principale limitazione è la mancanza di architettura tissutale e i risultati chiave possono essere confermati usando l'istologia tradizionale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
JAL è stato supportato dalla sovvenzione NIH K08EY030923; Il CMC è stato supportato da una sovvenzione K01 (5K01AR060169) del NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases e da un Novel Research Grant (637405) della Lupus Research Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
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