कार्बनिक सॉल्वेंट मिश्रण में जटिल नैनोस्ट्रक्चर में गामा-संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड की आत्म-असेंबली
Summary
यह लेख कार्बनिक विलायक मिश्रण में गामा-संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड ओलिगोमर से नैनोस्ट्रक्चर के डिजाइन और आत्म-असेंबली के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Abstract
डीएनए और आरएनए नैनोटेक्नोलॉजी में वर्तमान रणनीतियां जलीय या काफी हद तक हाइड्रेटेड मीडिया में विभिन्न प्रकार के न्यूक्लिक एसिड नैनोस्ट्रक्चर की आत्म-असेंबली को सक्षम करती हैं। इस लेख में, हम विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो विशिष्ट रूप से पता करने योग्य, एकल-फंसे, गामा-संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (γPNA) टाइल्स के आत्म-असेंबली के माध्यम से कार्बनिक सॉल्वेंट मिश्रण में नैनोफाइबर आर्किटेक्चर के निर्माण को सक्षम करते हैं। प्रत्येक एकल-फंसे टाइल (एसएसटी) एक 12-बेस है γPNA ओलिगोमर जो प्रत्येक 6 ठिकानों के दो जटिल मॉड्यूलर डोमेन से बना है। प्रत्येक डोमेन नैनोफाइबर बनाने के लिए प्रोग्राम किए गए पूरकता का उपयोग करके पड़ोसी किस्में पर मौजूद पारस्परिक रूप से मानार्थ डोमेन से बांध सकता है जो लंबाई में माइक्रोन तक बढ़ सकता है। एसएसटी आकृति 9 कुल ओलिगोमर से बना है ताकि 3-हेलिक्स नैनोफाइबर का गठन किया जा सके। अनुरूप डीएनए नैनोस्ट्रक्चर के विपरीत, जो व्यास-मोनोडिस्पर्स संरचनाएं बनाते हैं, ये γPNA सिस्टम नैनोफाइबर बनाते हैं जो कार्बनिक विलायक मिश्रण में आत्म-असेंबली के दौरान अपनी चौड़ाई के साथ बंडल करते हैं। यहां वर्णित स्व-असेंबली प्रोटोकॉल में बंडलिंग प्रभावों को कम करने के लिए एक पारंपरिक सर्फेक्टेंट, सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) भी शामिल है।
Introduction
जलीय या काफी हद तक हाइड्रेटेड मीडिया में1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12 में कई जटिल नैनोस्ट्रक्चर का सफल निर्माण किया गया। स्वाभाविक रूप से होने वाले न्यूक्लिक एसिड जैसे डीएनए1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10और आरएनए11,12 पिछले कार्यों में दिखाए गए हैं। हालांकि , स्वाभाविक रूप से होने वाले न्यूक्लिक एसिड डुप्लेक्स पेचिक अनुरूप परिवर्तनों से गुजरते हैं या कार्बनिक विलायक मिश्रण13,14में थर्मल स्टैबिलिटी कम हो गए हैं ।
इससे पहले, हमारी प्रयोगशाला ने गामा-पोजीशन संशोधित सिंथेटिक न्यूक्लिक एसिड की नकल का उपयोग करके 3-हेलिक्स नैनोफाइबर के निर्माण की दिशा में एक विधि की सूचना दी है जिसे गामा-पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (γPNA)15 (चित्रा 1A) कहा जाता है। 16,17के क्षेत्र में सिंथेटिक न्यूक्लिक एसिड की नकलपीएनए के इस तरह के विकास और संभावित अनुप्रयोगों की आवश्यकता पर चर्चा की गई है । हमने डीएनए नैनोस्ट्रक्चर18, 19,20के लिए प्रस्तुत एकल-फंसे टाइल (एसएसटी) रणनीति के अनुकूलन के माध्यम से दिखाया है कि 9 क्रमिक रूप से अलग γPNA ओलिगोमर को डीएमएसओ और डीएमएफ जैसे चुनिंदा ध्रुवीय एप्रोटिक ऑर्गेनिक सॉल्वैंट मिश्रणों में 3-हेलिक्स नैनोफाइबर बनाने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। γPNA ओलिगोमर को साहू एट अलद्वारा प्रकाशित तरीकों के आधार पर प्रत्येक 12-आधार अल्पाहार के साथ तीन γ-पदों (1, 4 और 8 आधार-पदों) पर (आर-डाईथिलीन ग्लाइकोल (मिनी-खूंटी) के संशोधनों के साथ व्यावसायिक रूप से आदेश दिया गया था। 21 ये गामा-संशोधनों के कारण पेचिक पूर्व-संगठन जो असंशोधित पीएनए के सापेक्ष γPNA की उच्च बाध्यकारी आत्मीयता और थर्मल स्थिरता से जुड़ा हुआ है।
यह लेख हमारे रिपोर्ट किए गए कार्य का एक अनुकूलन है जिसमें हम γPNA-आधारित नैनोस्ट्रक्चर15के गठन पर डीएनए के साथ सॉल्वेंट समाधान और प्रतिस्थापन के प्रभावों की जांच करते हैं। इस लेख का उद्देश्य डिजाइन के विस्तृत विवरण के साथ-साथ विलायक-अनुकूलित तरीकों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है जो स्व-असेंबली और γPNA नैनोफाइबर के लक्षण वर्णन के लिए विकसित किए गए थे। इस प्रकार, हम पहले मॉड्यूलर एसएसटी रणनीति पेश करते हैं, जो सिंथेटिक न्यूक्लिक एसिड की नकल पीएनए का उपयोग करके नैनोस्ट्रक्चर डिजाइन के लिए एक सामान्य मंच है।
पीएनए डुप्लेक्स के लिए हेलीकल पिच डीएनए डुप्लेक्स की तुलना में प्रति मोड़ 18 कुर्सियां होने की सूचना दी गई है, जो प्रति १०.५ ठिकानों(चित्रा 1B)एक मोड़ से गुजरता है । इसलिए, प्रदर्शन γPNA एसएसटी की डोमेन-लंबाई 6 ठिकानों पर निर्धारित की गई थी ताकि एक तिहाई पूर्ण मोड़ या 120 डिग्री रोटेशन को समायोजित किया जा सके ताकि तीन त्रिकोणीय सरणी हेलीस के बीच बातचीत को सक्षम किया जा सके। इसके अलावा, पिछले एसएसटी रूपांकनों के विपरीत, प्रत्येक एसएसटी में सिर्फ 2 डोमेन होते हैं, जो प्रभावी रूप से 1-आयामी रिबन जैसी संरचना बनाते हैं जो तीन-हेलिक्स बंडल(चित्रा 1C)बनाने के लिए लपेटता है। प्रत्येक 12-आधार γPNA अल्पाधिकार 1, 4 और 8 पदों पर संशोधित गामा है ताकि समग्र एसएसटी आकृति में मिनी-खूंटी समूहों का समान रूप से दूरी वितरण सुनिश्चित किया जा सके। इसके अतिरिक्त, आकृति के भीतर, दो प्रकार के ओलिगोमर होते हैं: “समीपस्थ” किस्में जो एकल हेलिक्स और हेलिक्स-फैले “क्रॉसओवर” किस्में(चित्रा 1D)पर मौजूद हैं। इसके अलावा, ओलिगोमर पी 8 और पी 6 को फ्लोरोसेंट Cy3 (ग्रीन स्टार) और बायोटिन (येलो ओवल) के साथ क्रमशः(चित्रा 1D)के साथ चिह्नित किया जाता है, ताकि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके संरचना गठन का पता लगाया जा सके। कुल मिलाकर, एसएसटी आकृति 9 कुल ओलिगोमर से बना है ताकि प्रत्येक डोमेन की प्रोग्राम पूरकता के माध्यम से पड़ोसी ओलिगोमर(चित्रा 1E)पर संबंधित डोमेन के माध्यम से 3-हेलिक्स नैनोफाइबर के गठन को सक्षम किया जा सके।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लेख कार्बनिक विलायक मिश्रण की ओर मौजूदा न्यूक्लिक एसिड नैनो टेक्नोलॉजी प्रोटोकॉल को अनुकूल बनाने और बेहतर बनाने पर केंद्रित है। यहां वर्णित तरीकों का चयन ध्रुवीय एपरोटिक कार्बनिक सॉल्वैंट्स के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 1739308, एनएसएफ कैरियर ग्रांट 1944130 और वायु सेना कार्यालय द्वारा विज्ञान अनुसंधान अनुदान संख्या FA9550-18-1-0199 द्वारा समर्थित किया गया था। γPNA सीक्वेंस ट्रूकोड जीन रिपेयर, इंक के डॉ तुमुल श्रीवास्तव की ओर से उदार उपहार थे । हम डीएनए डिजाइन टूलबॉक्स मैटलैब कोड पर उनकी उपयोगी बातचीत के लिए डॉ एरिक विनफ्रे और डॉ रिज़ल हरियादी को धन्यवाद देना चाहते हैं । हम TEM डेटा के संग्रह में उनकी सहायता के लिए जोसेफ सुहान, मारा सुलिवान और सेंटर फॉर बायोलॉजिकल इमेजिंग का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।
Materials
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
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