高スループットDNA抽出プレートの装填のための改変方法により、汚染の可能性を低減
Summary
DNA抽出用に96ウェルプレートをロードする現在の方法は、汚染を起こしやすい可能性があります。ウェル間のクロスコンタミネーションのリスクを低減する96ウェルプレートの新しいロード方法を詳しく説明します。当社の方法は、他の研究者が高スループットDNA抽出技術の効率を活用し、汚染のリスクを最小限に抑えるのに役立ちます。
Abstract
高スループットのDNAシーケンシング技術は、微生物群集間の関係、宿主特性、およびより広範な生態系機能の理解の進歩に大きく貢献しています。このシーケンシング能力の急速な増加に伴い、環境DNAを最大限の効率で抽出、増幅、分析、解釈する方法が得られます。残念ながら、DNA抽出を迅速に行うことは、サンプル間の汚染のリスクを高める費用がかかります。特に、96ウェルプレートに含まれるサンプルに基づくハイスループット抽出は、単一チューブ抽出と比較して比較的迅速な方法を提供しますが、ウェル・トゥ・ウェル・クロスコンタミネーションの機会も増加します。サンプル間のクロスコンタミネーションのリスクを最小限に抑えるため、高スループット抽出技術のメリットを維持しながら、環境サンプルを96ウェルプレートにロードする新しい方法を開発しました。サンプルをロードしながら、各プレートをカバーするためにピアス可能なPCRシールフィルムを使用し、サンプルをウェルに移動する前にPCRチューブに最初に追加しました。これらのプラクティスは、サンプルドリフトとウェルの意図しない二重積み込みのリスクを軽減します。本稿で概説した手法は、96ウェルプレートに固有のクロスコンタミネーションのリスクを低減しながら、利用可能なハイスループット抽出技術を最大化するアプローチを研究者に提供します。サンプル採取からDNA抽出への移行方法を、不要なクロスコンタミネーションのリスクを最小限に抑えながら、詳細なステップバイステップの概要を提供します。
Introduction
微生物群集のハイスループットシーケンシングの最近の進歩は、比類のないシーケンシング深さを提供しており、その結果、地球のマイクロバイオーム1の機能と多様性を前例のない一見に見ることができます。単一のシーケンシングレーンに多重化する能力が増加するにつれて、単一のチューブDNA抽出は、生態学的データの生成におけるレート制限ステップになる可能性を有する。しかし、高スループットDNA抽出における新しい方法は、これまで可能であったよりも効率の良い大量の環境サンプルを処理する約束を保持する2。これらの方法は、多くの場合、単一のチューブの代わりに96ウェルプレートを使用して、同時に発生する可能性のある抽出の数を増加させることが含まれます。このように、高スループット抽出方法の実用性および効率は明らかであり、土壌33、4および4植物組織3、55からヒト便物質2に至るまでの環境試料3の処理のために実施されている。
これらの方法は、サンプル処理とDNA抽出に沿って劇的にスピードアップすることができますが、土壌やその他の生態学的サンプルを96ウェルプレートにロードする最初のステップは、クロスサンプル汚染の影響を受けやすいです。このタイプの井戸汚染は、DNA抽出,6、7、87の6間に発生する可能性があり、サンプルが緩衝溶液に懸濁される前のこの最初のステップでは特に脆弱です。8McPhersonら 9 は、漏斗と 8 ウェル PCR ストリップ カバーを使用して 96 ウェルプレートに根球土壌をロードする方法を示していますが、その方法はプレートのローディングに対するより制御されたアプローチですが、各サンプルをロードする際に隣接するウェルの汚染に十分な機会を提供します。さらに、オープンウェルは、気が散った研究者が誤った井戸にサンプルを入れるか、すでにロードされている井戸にサンプルを追加する機会を可能にします。さらに、さまざまなサンプルタイプがこのメソッドでの読み込みに適さないことを証明しています。湿ったサンプルは、多くの場合、漏斗に固執し、乾燥サンプルは静電気のために井戸間の「ジャンプ」します。
ハイスループットDNA抽出の第1ステップで井戸間の汚染の機会を減らすために、土壌サンプルを96ウェルプレートにロードする新しいアプローチを開発しました。私たちの方法は両方とも環境暴露から井戸を保護し、誤って1つの井戸に複数のサンプルをロードするのを防ぎます(ダブルローディング)。以下に報告されているこの方法は、汚染の可能性を減らすという約束を提供し、その後のDNA抽出のために96ウェルプレートをロードするより制御された手段を提供すると考えています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法は、高スループットのサンプル抽出プレートをロードしながら、ウェルツーウェルクロスコンタミネーションの機会を減らし、既存のプレートローディング戦略99,1010を超えて96ウェルプレートをロードするためのより制御された手段を提供する。井戸間の汚染は、特に自動化された66、77の場合?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NSF賞#EPS-1655726からの資金援助を受けた微生物生態学によって支援されました。
Materials
| 18 oz WhirlPak | Nasco | B01065 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 200 µL micro-PCR tubes | Thermo Scientific | AB 2000 | |
| 96-well PowerSoil DNA extraction kit | Qiagen | 12955-4 | We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work. |
| Ice block for 2 mL centrifuge tubes | Any | Any | Any ice block made for 2 mL tubes will work |
| Ice block for 200 µL micro-PCR tubes | Any | Any | Any ice block made for 200 µL tubes will work |
| Micro scoopula | Any | Any | |
| Precut Pierceable Sealing Film | Excel Scientific | XPS25 | |
| Spatula | Any | Any | |
| Surgical scissors | Any | Any |
References
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